Ảnh hưởng của Auxin và cytokinin trong nuôi cấy mô loài tảo Grateloupia dichotoma (Gigartinales,Rhodophyta)

Tóm tắt
Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong tảo còn ít được biết đến. Để tăng cường kiến thức về chức năng của các chất auxin và cytokinin trong rong biển, các mẫu nghiên cứu từ phần đỉnh (apical) ,

các đoạn xen giữa (intercalary segments) và các cấu trúc giống sẹo (callus-like structures) (CLS) của Grateloupia dichotoma đã được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo bán rắn (semi-solid) hoặc lỏng ASP 12-NTA. Hai chất auxin, axit indole-3-acetic (IAA) và axit 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D) và một cytokinin, 6-benzylaminopurine (BA), đã được thử nghiệm ở nồng độ 0.5 và 5.0 mg/l. Ngoài ra, IAA và BA đã cùng được thử nghiệm ở nồng độ 1:5 và 5:1 mg/l. Tất cả các phương pháp thử nghiệm đều thúc đẩy sự phát triển của CLS trong các intercalary segments; CLS từ các apical (phần đỉnh) cao hơn đáng kể trong các phương pháp thử ngiệm với 2,4-D hoặc IAA: BA (1: 5 mg/1). Các đáp ứng morphogenetic đối với các chất auxin và BA đối ngược nhau, các chất auxin làm ức chế trong khi BA thúc đẩy sự hình thành các cành/nhánh bên; tuy nhiên, các chất auxin đã thúc đẩy sự kéo dài của các nhánh như vậy. Quá trình tái sinh thực vật quan sát được trên CLS đã được thúc đẩy đáng kể bằng cách xử lý với nồng độ cao BA hoặc IAA: BA (1:5 mg/1) trong môi trường bán rắn và lỏng. Sự tăng trưởng của upright axes (trục thẳng đứng) được kích thích đáng kể bằng cách xử lý 2,4-D trong môi trường bán rắn và IAA: BA (1:5 mg/1) trong môi trường lỏng. Những kết quả này cho thấy tầm quan trọng mà các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể có trong việc kiểm soát sự tăng trưởng, quá trình biến đổi hình thái (morphogenetic processes) và vi nhân giống (micropropagation) trong tảo đỏ

Giới thiệu

Ngày càng có nhiều sự quan tâm trong việc áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô và nuôi cấy protoplast cho rong biển để thao tác di truyền và vi nhân giống để cải thiện cây trồng thủy sản, và tăng kiến thức về các quá trình biệt hóa, morphogenesis và tái sinh. Các mô sẹo và cấu trúc giống như mô sẹo đã được báo cáo từ nuôi cấy in vitro của tảo nâu, chẳng hạn như loài Dictyosiphon foeniculaceus (Huds.) Grev. (Saga và cộng sự, 1982), Ecklonia spp. (Lawlor và cộng sự, 1988; Notoya, 1988), Laminaria spp. (Fries, 1980; Saga & Sakai, 1983), Sargassum spp. (Polne-Fuller & Gibor, 1987) và Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar (Yan Zuomei, 1984; Kawashima & Tokuda, 1993); và tảo đỏ, như loài Agardhiella subulata (C.Ag.) Kraft & Wynne (Bradley & Cheney, 1990), Eucheuma denticulatum (Burman) Collins & Hervey, Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty (Dawes & Koch, 1991 ; Dawes et al.1993) Gelidium vagum Okamura, Gracilaria verrucosa (Hudson) Papenf. (Gusev et al.,1987), Grateloupia filiformis Kiitz (Yokoya et al., 1993), Laurencia spp. (Gusev et al ., 1987 ; Robaina et al ., 1992), some species of Porphyra (Polne-Fuller et al ., 1984; Saga et al., 1986 ; Zhao & Zhan, 1981), and Solieria filiformis (Kutz.) Gabrielson (Robledo & Garcia-Reina, 1993). Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu về vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đối với sự hình thành mô sẹo, sự biệt hóa và tái sinh ở tảo. Trong số các bài báo được đề cập ở trên, chỉ có Bradley & Cheney (1990), Dawes & Koch (1991) và Dawes cùng cộng sự (1993) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh và phát triển mô sẹo. Các cách tiếp cận khác liên quan đến các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã được Provasoli & Carlucci (1974), Buggeln (1981), Bradley (1991) và Evans & Trewavas (1991) xem xét.
Bài viết này báo cáo về tác động ngoại sinh của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (hai chất auxin và một cytokinin) đối với sự hình thành, phát triển và hình thái mô sẹo ở Grateloupia dichotoma J. Ag., Một tảo đỏ sản xuất carrageenan.

Nguyên liệu và phương pháp

Những cây Grateloupia dichotoma chất lượng được thu thập từ Brava Beach, Ubatuba, bang Sao Paulo, đông nam Brazil, vào tháng 9 năm 1991. Các mẫu chứng từ được gửi trong thư viện `Maria Eneyda P .Kauffmann Fidalgo ‘, Viện Thực vật học, Bang Sao Paulo, Brazil.
Nuôi cấy theo phương pháp Unialgal (Unialgal cultures) được bắt đầu từ sự nảy mầm của carpospores và nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy Von Stosch (Von Stosch culture medium) (Edwards, 1970, có điều chỉnh), ở nồng độ 4 ml/1 nước biển vô trùng, độ mặn 30 ± 2% và nhiệt độ 24 ± 2°C. Photon chiếu xạ 40-50 umol/m2s được cung cấp bởi đèn huỳnh quang trắng mát với ánh sáng 14:10h chu kỳ sáng:tối. Germanium dioxide (1 mg/1) đã được thêm vào môi trường nuôi cấy trong tháng đầu tiên nuôi cấy carpospore. Thay mới môi trường cứ sau mỗi 14 ngày.
Phương pháp tốt nhất để có được nguyên liệu cho phương pháp nuôi cấy axenic (axenic culture) là lấy cây dài từ 3 đến 6 cm từ nuôi cấy unialgal và đưa chúng xử lí kháng sinh và kháng nấm (5 ug/1 ciprofloxacin (Sigma) và 100 ug/1 nystatin (Sigma) trong môi trường nuôi cấy) trong 48 giờ. Sau đó, bên trong buồng vô trùng, chúng được rửa trong 20 giây trong dung dịch nước biển vô trùng (được khử trùng bằng bộ lọc và được hấp khử trùng trong một giờ ở 121 ° C) với natri hypochlorite 0.5% và 5 giọt chất tẩy (detergent). Cuối cùng, chúng được rửa năm lần trong nước biển vô trùng. Các mẫu thử nghiệm sử dụng cho các thí nghiệm là các apical và intercalary segments với chiều dài 5 mm được cắt từ các mẫu thực vật đã được xử lí.

Để kiểm tra tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR), chúng tôi đã chọn hai chất auxin là axit indole-3-acetic (IAA) và 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và một cytokinin, 6-benzylaminopurine (BA ). Mỗi PGR được sử dụng đơn lẻ ở nồng độ 0,5 và 5,0 mg/l. IAA và BA đã được thử nghiệm cùng nhau ở nồng độ 5 mg/l:1 mg/l (5:1) và 1 mg/l: 5 mg/l (1:5). PGR đã được thêm vào trong môi trường nuôi cấy tổng hợp ASP 12-NTA (Iwasaki (1967) được sửa đổi bằng việc bổ sung 100ug thiamine HCI), thêm với 1% sucrose, ở độ mặn 30%. Sau khi bổ sung PGR, độ pH được điều chỉnh thành 8.0 và môi trường được gel bởi 0,4% agar. Mẫu đối chứng không thêm PGR đã được thiết lập song song.

Hiệu quả của các chất auxin và BA trong quá trình tái sinh trong các cấu trúc giống như mô sẹo (CLS) đã được đánh giá. Chúng được tạo ra bởi các mẫu thử thu được theo cách được mô tả ở trên và cả nuôi cấy trong môi trường bán rắn ASP 12-NTA (0 .4% agar) mà không có PGR. Sau sáu tuần CLS đã được phân lập từ cực cơ bản (basal pole) của mẫu thử và xử lí với PGR trong môi trường bán rắn và lỏng.

Mỗi lần thử nghiệm bao gồm ba lần lặp lại với bốn mẫu trong mỗi lần, được nuôi cấy trong đĩa Petri với 20ml môi trường bán rắn hoặc trong Erlenmeyers với 25 ml môi trường lỏng.
Các điều kiện nuôi cấy tương tự đã được sử dụng trong các thí nghiệm này như các điều kiện đã được mô tả cho nuôi cấy unialgal, ngoại trừ chu kỳ sáng:tối 16:8.
Các quan sát được thực hiện sau hai tháng, và kết quả được đánh giá từ sự thay đổi về chiều dài, diện tích của CLS (được xác định bởi mặt cắt ngang lớn hơn), số lượng và chiều dài của các nhánh bên và đỉnh, và số lượng và chiều dài của đoạn trục (upright axes) được tái tạo từ CLS.
Kết quả được phân tích bằng thử nghiệm so sánh theo một chiều ANOVA và Tukey sau đó được sử dụng để chọn các phương pháp thử nghiệm hiệu quả đáng kể khác nhau sau kiểm tra ANOVA.

Kết quả

Tăng trưởng và phát sinh hình thái của các đoạn đỉnh và intercalary segments
Sự phát triển của CLS từ cực cơ bản (basal pole) của cả apical và intercalary segments được quan sát thấy trong tất cả các phương pháp nghiên cứu đã được kiểm tra. Sự tăng trưởng của CLS ở các phân đoạn đỉnh (apical) cao hơn đáng kể trong các phương pháp xử lí với 2,4-D và IAA: BA ở mức 1:5 mg/l (Hình 1); tuy nhiên, sự tăng trưởng của CLS trong intercalary segments đã được kích thích/thúc đẩy trong tất cả các phương pháp nghiên cứu/thử nghiệm có bổ sung PGR (Hình 2). Ứng dụng ngoại sinh của các chất auxin và BA cũng thúc đẩy sự kéo dài của các phân đoạn đỉnh (apical) và đoạn xen kẽ (intercalary segments ) (Hình 3-4). Độ giãn dài cao nhất của các phân đoạn đỉnh được quan sát thấy trong các phương pháp điều trị bằng IAA (5.0 mg/ l). Tuy nhiên, đối với các phân đoạn xen kẽ (intercalary segments), không quan sát thấy sự khác biệt rõ ràng giữa các phương pháp thử nghiệm được bổ sung auxin và BA (Hình 4).

Hai loại PGR thúc đẩy các đáp ứng hình thái (morphogenetic) khác nhau, IAA và 2,4-D đã ức chế sự hình thành các nhánh trong khi BA thúc đẩy nó. Số lượng các nhánh bên xuất hiện trong các phân đoạn đỉnh (apical) và đoạn xen kẽ (intercalary segments) cao hơn với nồng độ BA thấp (Hình 5, 6). Mặt khác, sự kéo dài của các nhánh bên ngẫu nhiên được kích thích đáng kể bởi các chất auxin. Trong các đoạn đỉnh (apical), chiều dài tối đa của các nhánh bên xuất hiện ngẫu nhiên được quan sát thấy trong các phương pháp xử lí với 2,4-D (0,5 và 5,0 mg/l) (Hình 7). Trong các đoạn xen kẽ (intercalary segments), các đáp ứng tương tự đã được quan sát và các phương pháp xử lí với IAA và nồng độ BA thấp đã kích thích sự kéo dài của các nhánh bên (adventitious lateral branches) (Hình 8).
Các đoạn xen kẽ (intercalary segments) tạo ra các nhánh ngẫu nhiên trên bề mặt cắt tương ứng với cực đỉnh (apical pole) (ngoại biên). Tất cả các phương pháp thử nghiệm đều thúc đẩy sự hình thành của các nhánh đỉnh ngẫu nhiên này (Hình 9), nhưng các giá trị cao nhất được ghi nhận từ các phương pháp thử nghiệm auxin, chủ yếu là 2,4-D, ở cả hai nồng độ. Mặc dù sự tăng trưởng của các nhánh này được kích thích khi áp dụng PGR , sự khác biệt là không đáng kể.
Tăng trưởng và tái sinh trong CLS
Số lượng và độ giãn dài của các trục (upright axes) được kích thích đáng kể bởi nồng độ BA và 2,4-D cao, tương ứng (Hình 10). Tuy nhiên, sự tăng trưởng của CLS, được đánh giá bằng sự thay đổi trong khu vực/diện tích, được kích thích bằng cách bổ sung PGR, ngoại trừ việc xử lí với nồng độ IAA cao (Hình 10) nhưng sự khác biệt không đáng kể (Bảng 1).

Ở CLS nuôi cấy trong môi trường lỏng, có sự gia tăng trọng lượng tươi, số lượng và độ giãn dài của trục (upright axes) trong tất cả các phương pháp được thử nghiệm, nhưng điều này chỉ nổi bậc với tỉ lệ IAA: BA ở mức 1:5 mg /l khi so sánh với đối chứng (Hình 11-13).
Quá trình tái sinh trong vùng sợi (filamentous-region) của CLS
CLS nuôi cấy cả trong môi trường bán rắn và lỏng, không phụ thuộc vào loại và nồng độ PGR, đã phát triển vùng sợi (filamentous-region) (Hình 12). Vùng này bao gồm các sợi có các tế bào sắc tố nhẹ, kéo dài trở nên ngắn hơn về phía đỉnh (Hình 14). Các tế bào trung gian của sợi trải qua một số phân chia, tạo ra các tế bào nhỏ và bắt màu tốt/rõ sắc tố (wellpigmented cells) (Hình 15-16),và tạo ra các trục (upright axes) (Hình 17-18).
Thảo luận
Sự phát triển của CLS từ cực cơ bản (basal pole)của cả đoạn đỉnh (apical) và đoạn xen kẽ (intercalary segments) của Grateloupia dichotoma đã được quan sát thấy trong các phương pháp thử nghiệm cho dù chúng có được bổ sung PGR hay không. Kết quả này chỉ ra rằng sự phát triển của cấu trúc này được gây ra bởi các quá trình gây tổn thương, theo quan sát của Polne-Fuller & Gibor (1987) đối với vết sẹo của một số loài tảo đỏ, xanh lá cây và nâu, và bởi Yokoya et al. (1993) cho loài Grateloupia filiformis.

Auxin và BA, dù đơn lẻ hoặc kết hợp, đã thúc đẩy sự phát triển của CLS và sự kéo dài của các đoạn đỉnh (apical) và đoạn xen kẽ (intercalary segments) của G. dichotoma, kích thích phân chia tế bào và/hoặc phát triển tế bào. Những kết quả này phù hợp với tác dụng của PGR này trong nuôi cấy mô của thực vật có mạch (Nogle & Fritz, 1976).
Ngoài ra, Dawes & Koch (1991) đã báo cáo rằng các chất auxin (a-naphthalenacetic acid và phenylacetic acid) và cytokinin (BA và 2iP = N6-[- 2-isopentenyl] adenine) gây ra sự phát triển mô sẹo cao nhất ở tảo đỏ Kappaphycus alvarezii. Những quan sát khác về sự kích thích tăng trưởng của tảo khi được điều trị bằng PGR đã được báo cáo bởi Fries (1973, 1974), Fries & Iwasaki (1976) và Bradley & Cheney (1990) đối với một số loài tảo đỏ; Fries & Aberg (1978) cho Enteromorpha và Nys et al. (1991) cho Macrocystis pyrifera (L.) C. Ag.

Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các chất auxin (IAA và 2,4-D) thúc đẩy sự kéo dài tối đa của các đoạn đỉnh (apical segments) và các nhánh bên (adventitious lateral branches) và tương tự như của Davidson (1950) đối với các cây Fucus và Ascophyllum. Hơn nữa, tác dụng ức chế của các chất auxin đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis), trái ngược với tác dụng kích thích của BA đối với sự hình thành các nhánh bên tương tự như các quan sát được thực hiện trong thực vật có mạch. Mặt khác, số lượng lớn hơn nhánh đỉnh (adventitious apical branches) trong các đoạn xen kẽ (intercalary segments) được xử lý bằng 2,4-D có thể liên quan đến hoạt động của nó trong quá trình biệt hóa các tế bào nằm ở vị trí xa. Vùng xa có thể có một sinh lý khác biệt với vùng gần.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, quá trình tái sinh thực vật từ CLS ở G. dichotoma được kích thích chủ yếu bằng các phương pháp xử lí với BA hoặc IAA: BA ở nồng độ 1:5 mg/l. Trong trường hợp này, ảnh hưởng của nồng độ cao của cytokinin có thể liên quan đến sự phân chia tế bào, bằng cách tăng mức độ tổng hợp protein và hoạt động trao đổi chất và ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào. Những quan sát của chúng tôi đồng ý với những gì được mô tả bởi Nehlsen (1978), người đã báo cáo rằng một trong những tác dụng rõ rệt nhất của cytokinin là sự khởi phát của chồi trên protonema của rêu. Tuy nhiên, Bradley & Cheney (1990) đã quan sát thấy rằng nồng độ cao của cytokinin (10 mg/l) ức chế sự tái sinh của cây tảo đỏ Agardhiella subulata.

Quá trình tái sinh thực vật được quan sát thấy trong phần sợi (filamentous part) ở CLS của G. dichotoma tương tự như mô tả của Yokoya et al . Ở loài này, tế bào cuối (phía ngoài cùng) (terminal cell) của sợi (filament) thường trở nên tròn, sắc tố đậm và phân chia để tạo thành các tế bào giống như mô sẹo (callus-like cells) để tổ chức thành một trục thẳng đứng (upright axis). Ngược lại, trong G.dichotoma, tế bào thường bắt đầu quá trình tái sinh nằm ở phần giữa của sợi.
Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng PGR có vai trò kiểm soát sự tăng trưởng, hình thành mô sẹo và tái sinh thực vật ở G. dichotoma, hơn nữa một số tác dụng có thể so sánh với những gì được quan sát thấy ở thực vật có mạch. Tuy nhiên, cần nhiều thí nghiệm hơn để làm sáng tỏ các phản ứng sinh lý của loài này và các loài rong biển khác ở các loại và nồng độ PGR khác nhau. Nghiên cứu này cũng cho thấy tầm quan trọng của PGR trong vi nhân giống và trữ lượng hạt giống trong tảo đỏ.

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *