Khảo sát các môi trường nuôi cấy mô cây cọ dầu từ phôi non

Tóm tắt: Mô cọ dầu (Elaeis guineensis) nuôi cấy chậm, không hiệu quả và phụ thuộc vào kiểu gen. Do đó, những nỗ lực để cải thiện hệ thống tái sinh là rất cần thiết và đang được tiếp diễn. Phôi chưa trưởng thành (IE) đã được báo cáo là đáp ứng nhanh hơn với nuôi cấy in vitro so với các loại khác.

Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá môi trường nuôi cấy hiệu quả nhất để tái sinh toàn bộ cây từ IE. IE đã được nuôi cấy trên ba môi trường, đó là N6, MY3 và MS +Y3. Quan sát ban đầu cho thấy sẹo (callus) xuất hiện sớm nhất là hai tuần sau khi nuôi cấy. chúng bắt đầu sản xuất/tạo ra các callus rời rạc (friable calli) sau khoảng ba đến bốn tháng. IE đã cho thầy các đáp ứng khác nhau với các môi trường thử nghiệm. Kết quả ban đầu sẽ rất hữu ích trong việc xác định môi trường nuôi cấy IE tốt nhất.

Giới thiệu

Cây cọ dầu (Elaeis guineensis) là loài cây một lá mầm với một đỉnh phát triển duy nhất, cây không thể được nhân giống theo cách sinh sản sinh dưỡng (multiplied vegetatively) . Do đó, sự thay thế duy nhất cho việc nhân giống kiểu gen tốt của cây cọ dầu là thông qua phương pháp nuôi cấy mô (Parveez et al., 2012). Tuy nhiên, nuôi cấy mô cọ dầu bị cản trở bởi khó khăn trong việc tạo ra một hệ thống tái sinh hiệu quả, chính xác và nhanh chóng (Kushairi et al., 2010). Hơn nữa, cũng có những thách thức trong việc loại bỏ hoặc giảm thiểu biến dị soma (somaclonal variation) (Corley và Tinker, 2003). Tạo phôi soma hoặc phát sinh cơ quan trong cọ dầu là một quá trình phức tạp đòi hỏi phải xem xét nhiều nhân tố tác động. Hai trong số các yếu tố chính để tạo phôi soma trong cây cọ dầu là lựa chọn của các mẫu nuôi cấy và lựa chọn môi trường nuôi cấy.

Cho đến nay, có nhiều báo cáo về tái sinh cọ dầu bằng nhiều mẫu cấy khác nhau như lá non (Schwendiman et al., 1988), phôi trưởng thành (Teixera et al., 1993), phôi chưa trưởng thành (IE) (Abdullah et al., 2005 ), rễ và cụm hoa cọ dầu (root and oil palm inflorescence) (Guedes et al., 2011) và protoplast (Masani et al., 2013). Nói chung, đối với nhiều loài thực vật, phôi được đề xuất làm các mẫu nuôi cấy vì nó có tiềm năng phôi cao nhất (embryogenic potential); kế tiếp là hypocotyl (trụ dưới lá mầm), cuống lá, mẫu lá (leaf lamina) và rễ (Neumann, 2000). Đối với cọ dầu, IE có lợi ích hơn các lựa chọn khác vì sự phong phú của nó. Tổng số 300 đến 500 IE có thể được phân lập từ một chùm quả đơn (single fruit bunch) giúp dễ dàng vận chuyển trong khoảng cách dài mà không ảnh hưởng nhiều đến khả năng tái sinh của nó (Teixera et al., 1993; Abdullah et al., 2005). IE có thể đáp ứng tốt trong nuôi cấy vì nó có các tế bào tạo phôi (possess embryogenic destiny). Ngược lại, các tế bào trong các mô biệt hóa phải xóa bỏ chương trình phát triển hiện có (existing developmental programme) bằng cách trải qua nhiều biến đổi để trở thành phôi (Elhiti và Stasolla, 2011). Do đó, các mô trẻ hơn như IE là lựa chọn ưu tiên vì chúng có tiềm năng và năng lực tốt hơn vì các mẫu cấy yêu cầu tín hiệu cảm ứng thấp so với các loại khác (Elhiti và Stasolla, 2011).

IE cũng có thể được sử dụng làm mô mục tiêu cho các nghiên cứu biến đổi để tạo ra cây cọ dầu biến đổi gen (Abdullah et al., 2005). Mục tiêu chính của chương trình kỹ thuật di truyền (genetic engineering programme) cọ dầu là duy trì sự bền vững của ngành cọ dầu trước những thách thức khác nhau. Trong số các mục tiêu của kỹ thuật di truyền cọ dầu là tăng hàm lượng axit oleic, axit stearic, axit palmitoleic, axit ricinoleic, hàm lượng lycopene và tổng hợp nhựa phân hủy sinh học (Parveez et al., 2015; Rasid et al., 2014). Tiềm năng của việc sử dụng IE làm mô mục tiêu cho chuyển đổi cọ dầu chưa được khám phá và kiểm tra đầy đủ. Abdullah và cộng sự (2005) từng báo cáo việc cây cọ dầu con (oil palm plantlets) biến đổi gen được tái sinh từ IE. Tuy nhiên, báo cáo không dứt khoát vì nó không cung cấp bằng chứng phân tử về sự tích hợp của gen chuyển. Nỗ lực biến đổi dầu cọ IE sử dụng gen protein huỳnh quang màu xanh lá cây (gfp) cũng đã được bắt đầu, liên quan đến việc tối ưu hóa các điều kiện biến đổi, cấu trúc gen và các tác nhân chọn lọc, tuy nhiên, việc tái tạo cây cọ dầu biểu hiện gen gfp chưa được báo cáo cho đến nay (Na ‘imatulapidah và Parveez, 2007; Parveez and Na’imatulapidah, 2008; Parveez et al., 2007). Gần đây, Bhore và Shah (2012) đã chứng minh những nỗ lực biến đổi IE của loài Elaeis oleifera (một loài cọ dầu khác không được trồng thương mại).

sự thụ phấn chéo giữa hai bố mẹ riêng biệt và do đó nền tảng di truyền (genetic backgrounds) của chúng không đồng nhất (Abdullah et al., 2005). Vì cọ dầu có tuổi thọ rất dài từ 25 đến 30 năm, nên việc trồng cây con có nguồn gốc từ cha mẹ đã được chọn lọc là rất quan trọng. IE không đồng nhất, dẫn đến IE không phải là một lựa chọn hoàn hảo cho các nhà nuôi cấy mô cọ dầu. Đối với quy trình nuôi cấy mô thương mại, IE chưa bao giờ được sử dụng do nhược điểm trên. Do đó, giải pháp thay thế tốt nhất để có được lợi ích tối đa là sử dụng IE thu được từ sự thụ phấn có kiểm soát của cha mẹ thương mại được chọn lọc.

Thành phần của môi trường được sử dụng để duy trì phôi là chìa khóa để nuôi cấy thành công. Có ba môi trường cơ bản chính đã được sử dụng để nuôi cấy phôi hữu tính (zygotic embryo) của cây cọ dầu là MS (Murashige và Skoogie, 1962), N6 (Chu et al., 1975) và Y3 (Eeuwens, 1976). Cho đến nay, đó là những môi trường không chuẩn để nuôi cấy phôi hữu tính dầu cọ. Môi trường MS được phân loại là môi trường muối cao so với nhiều công thức khác, với hàm lượng nitơ, kali cao và một số nguyên tố vi lượng, đặc biệt là boron và mangan (Cohen, 1995). Tuy nhiên, Eeuwens (1976) đã báo cáo rằng môi trường Y3 tốt hơn môi trường MS khi bắt đầu tạo callus trong dừa bởi vì thiếu khoáng chất chứa các nguyên tố đại lượng như nitơ (ammonium), kali và các nguyên tố vi lượng như sắt và molypden. Các môi trường cơ bản này đã được sửa đổi, cụ thể là MY3 (Muniran et al., 2008), MS + Y3 (Parveez, 2010) và N6 (Thuzar et al., 2011), đã tạo thành công cây con hoàn chỉnh (plantlets) từ IE. Tuy nhiên, không có môi trường tối ưu hóa để nuôi cấy IE cọ cọ dầu. Do đó, trong nghiên cứu này, IE có nguồn gốc từ các nền tảng di truyền khác nhau (cha mẹ khác nhau) đã được nuôi cấy trên môi trường MY3, MS + Y3 và N6 và hiệu quả của việc tạo ra mô sẹo (callus) cũng như tái sinh thực vật đã được đánh giá.

Nguyên liệu và phương pháp

Cây nguyên liệu

Những chùm quả cọ dầu (oil palm fruit bunches) chưa trưởng thành được lấy từ Trạm nghiên cứu MPOB, Kluang, Johor, Malaysia. Quả được tách và khử trùng trong natri hypoclorit 10% trong 10 phút. Quả được rửa kỹ trong nước vô trùng bảy lần. Những quả này sau đó được ngâm trong 70% ethanol trong 15 phút và sấy khô trong tủ hấp (laminar flow cabinet). IE được phân lập từ trái cây (Hình 1) và được nuôi cấy trên môi trường.
Cảm ứng mô sẹo
Các thí nghiệm đã được thiết lập để kiểm tra các hiệu quả của ba môi trường sau; (1) MS +Y3 (Parveez, 2010), (2) N6 (Thuzar et al., 2011) và (3) MY3 (Muniran et al., 2008), trong cảm ứng callus từ IE (Bảng 1). Mỗi lần thử nghiệm bao gồm 50 phôi (10 đĩa petri; năm phôi cho mỗi đĩa petri) và được lặp lại 3 lần như vậy.Mmẫu cấy được ủ ở 28°C ± 2°C dưới đèn huỳnh quang trắng mát (cool-white fluorescent lamp) (50-60 umol/m2s) trong 16 giờ chu kì sáng (photoperiod). Mẫu cấy thế hệ (Subculture) được thực hiện hàng tháng và số lượng callus và phôi được tạo ra đã được thu nhận và ghi lại cho mỗi lần thử nghiệm.

Huyền phù callus (Callus Suspension)

Nuôi cấy huyền phù được bắt đầu bằng cá

ch quay 1g callus rời rạc (friable callus) ở 150 vòng/phút trong bóng tối ở 28°C trong bình tam giác 100 ml (Erlenmeyer flask) chứa 20 ml môi trường chất lỏng huyền phù (MS macro, MS micro, Y3 vitamins, 0.1 g/l myo-inositol, 0.1 g/l L-glutamine, 0.1 g/l L-asparagine, 25 µM 2,4-D and 30 g/l sucrose). Sau một tháng, callus được chuyển vào 20 ml môi trường huyền phù mới/tinh sạch.
Phát triển, trưởng thành và nảy mầm của phôi Somatic

Calli phôi được chuyển vào môi trường EC (MS macro, MS micro, Y3 vitamins, 0,1 g/1 myo-inositol, 0,1 g/l L-glutamine, 0,1 g/l L- asparagine, 0,1 uM NAA và 30 g/l sucrose) cho sự phát triển. Subcultures được thực hiện hàng tháng trên môi trường mới trong ba đến sáu lần cho đến khi polyembryoids được bắt đầu/xuất hiện.

Kết quả và thảo luận

Nói chung, có ba bước dẫn đến việc sản xuất cây con (plantlets) thông qua quá trình tạo phôi soma, đó là (1) cảm ứng và duy trì trạng thái phôi, (2) sinh trưởng và phát triển phôi soma và (3) tái sinh của cây con (plantlets) từ phôi soma (Thuzar et al., 2011). Trong các hệ thống tạo phôi soma, có hai loại quá trình cảm ứng: trực tiếp hoặc gián tiếp. Trong quá trình tạo phôi soma trực tiếp, phôi phát triển thành cây con (plantlets) mà không trải qua giai đoạn tạo callus, trong khi đó trong quá trình tạo phôi soma gián tiếp, sự phân chia cao của các tế bào được yêu cầu thông qua giai đoạn tạo callus(Neumann, 2000). IE đã được phân lập từ quả chưa trưởng thành trước khi được nuôi cấy riêng trên ba môi trường. Đã có quan sát thấy rằng IE bắt đầu phình lên (swell) sau một tuần trên ba môi trường nuôi cấy.

Sau bốn tuần, IE bắt đầu cho thấy sự hình thành của các đốm callus nhỏ vàng. Các loại và hình dạng của callus được tạo ra từ phôi chưa trưởng thành trên ba môi trường được thể hiện trong Hình 2. Callus sơ khởi/ sơ cấp hình thành trên môi trường MS +Y3 hiển thị tương đối lớn, có màu vàng và kết tụ với nhau (compact) (Hình 2a). Trong khi đó, callus được sản xuất trên môi trường MY3 chủ yếu có kích thước nhỏ hơn với màu nâu sẫm đến đen (Hình 2b). Đối với môi trường N6, callus có sự pha trộn, có màu vàng và kết tụ với phần lớn trong số chúng có kích thước nhỏ hơn và xuất hiện màu nâu (Hình 2c).

Sau 12-17 tuần trên ba môi trường cảm ứng callus, callus kết tụ (compact calli) (Hình 3a) bắt đầu tạo ra calli rời rạc (friable calli) (Hình 3b). Callus rời rạc có màu vàng và trông giống như trứng cá. Chúng dễ dàng tách ra khỏi callus sơ khởi (primary calli). Tuy nhiên, loại callus này thường được hình thành ở tần số thấp so với compact calli. Friable calli sau đó được phân lập và chuyển vào môi trường chất lỏng huyền phù (Hình 3c) để nhân lên. Sau tám tháng, calli được chuyển vào môi trường EC cho các giai đoạn biệt hóa và trưởng thành (Hình 3d).

Sau khoảng 17 tuần trên môi trường EC, friable calli bắt đầu phát triển thành phôi soma màu trắng sau đó phát triển qua các giai đoạn lưỡng cực và hình cầu (bipolar and globular stages) (Hình 3e). Những phôi soma này hiện đang trong giai đoạn phát triển chồi (Hình 3f).

Tần số hình thành mô sẹo cao nhất được quan sát thấy từ IE nuôi cấy trên môi trường MS+Y3 là 41,25 sau đó là môi trường N6 và MY3 lần lượt là 9,25 và 18,5 (Hình 4). Quan sát thấy IE đã tạo thành công friable calli khi nuôi cấy trên môi trường MS+Y3. Ngược lại, không phải tất cả IE đều tạo ra friable calli khi được nuôi cấy trên môi trường MY3 và N6. friable calli đã được báo cáo là nguyên liệu tốt nhất để sản xuất hàng loạt và biến đổi gen (Li và Qu, 2010; Frame et al., 2000). Trong công việc này, môi trường MS+Y3 đã được chứng minh là môi trường hiệu quả nhất cho cảm ứng callus từ IE cọ dầu.

Môi trường MS+Y3 bao gồm các yếu tố đại lượng từ môi trường MS và các yếu tố vi lượng của môi trường Y3. Quan sát tương tự đã được báo cáo bởi Eeuween (1976) trong nghiên cứu của họ về cây dừa. Nó đã chỉ ra rằng môi trường chứa MS macro và Y3 micro, vượt trội và đáp ứng yêu cầu nuôi cấy mô có nguồn gốc từ cây dừa (Cocos nucifera). Môi trường MS+Y3 chứa nồng độ nguồn canxi cao hơn so với môi trường N6 và MY3 (Bảng 1).

Trong thực vật, canxi điều chỉnh tín hiệu canxi (calcium signalling) và hoạt động như một chất kích thích/hoạt hóa tốt cho sự hình thành phôi soma (Ghasemi et al., 2009). Ngoài ra, MS+Y3 chứa ammonium nitrate, chất này đã được đề xuất về việc ảnh hưởng đến sự hình thành phôi soma bằng cách thay đổi độ nhạy của mẫu thí nghiệm đối với auxin (Kothari et al., 2004). Kết quả cho thấy thành phần dinh dưỡng của MS+Y3 phù hợp hơn cho sự phát triển tế bào và sự biệt hóa tế bào của mô sẹo so với thành phần dinh dưỡng của môi trường MY3 và N6.

Kết luận
Nghiên cứu sơ bộ hiện tại đã chứng minh ảnh hưởng của ba môi trường nuôi cấy khác nhau đối với sự hình thành mô sẹo của IE có nguồn gốc từ bốn nền tảng di truyền (genetic backgrounds) khác nhau. Dữ liệu ban đầu chứng minh rằng môi trường MS+Y3 là môi trường phù hợp nhất cho cảm ứng callus cọ dầu. Các kết quả cho thấy rõ ràng rằng các nghiên cứu sâu hơn để xem xét tác động của môi trường này lên IE có nguồn gốc từ một hàng loạt các nền tảng di truyền (genetic backgrounds) khác là cần thiết. Kết quả của công việc như vậy sẽ có một lợi thế rõ ràng trong việc xác định môi trường nuôi cấy tốt nhất để có tỷ lệ tái sinh cao nhất mà không phụ thuộc vào kiểu gen.

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Call Now Button