Kiểm nghiệm bệnh lý thực vật

Môi trường kiểm nghiệm bệnh lý trên thực vật

Phát hiện được bệnh của thực vật ngay từ đầu sẽ giảm chi phí và tiết kiệm thời gian rất nhiều cho việc nghiên cứu và sản xuất. Bộ kit hay môi trường chẩn đoán, xét nghiệm bệnh lý thực vật là một trong những giải pháp nên áp dụng ngay từ ban đầu.

Khoa Học SBC cung cấp giải pháp môi trường dành cho kiểm bệnh lý của hạt giống. Có thể nói, cây lương thực hết sức quan trọng đối với sự tồn tại của con người.

Chẳng hạn như cây lúa, là cây lương thực chính của thế giới. Chỉ riêng hai loại lúa Oryza sativa và Oryza glaberrima( phổ biến ở Châu Á và Châu Phi) cung cấp tới 1/5 toàn bộ lượng calo tiêu thụ bởi con người. Lúa là các loài thực vật sống một năm, có thể cao tới 1-1,8 m, đôi khi cao hơn, với các lá mỏng, hẹp bản (2-2,5 cm) và dài 50–100 cm. Tuỳ thời kì sinh trưởng, phát triển mà lá lúa có màu khác nhau. Khi lúa chín ngả sang màu vàng. Các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài 30–50 cm. Hạt là loại quả thóc (hạt nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5–12 mm và dày 2–3 mm.

Cây Ngô cũng là một trong những cây quan trọng của thế giới, có nguồn gốc từ Trung Mỹ, sau đó lan tỏa khắp Châu Mỹ. Đến cuối thế kỷ thứ 15 thì bắt đầu lan tỏa ra khắp thế giới. Ngày nay chúng ta sử dụng Ngô với mục đích khác nhau hơn là thực phẩm. Ngô đã trở thành nguyên liệu thô trong công nghệ sản xuất đủ loại sản phẩm, từ sơn đến bao bì, thức ăn gia súc, các phụ gia thực phẩm và mỹ phẩm. Ngoài ra còn có các giống cây họ đậu, cải bắp, cà rốt, tỏi, tiêu, cà chua, vân vân.

Trong thời gian bảo quản hạt thường bị một số loại nấm mốc, vi khuẩn xâm nhập và gây hại. Nấm hay vi khuẩn phá hủy dinh dưỡng trên hạt, có thể làm chết phôi hạt, làm hạt mất sức nảy mầm. Các loại nấm gây hại này thường là những loại nấm gây hại cả trên hạt và cả trong giai đoạn nảy mầm của hạt. Các bệnh trên hạt thường liên quan các loại bệnh hại trên đồng ruộng trước khi thu hoạch, chúng tồn tại trên hạt từ đồng ruộng về kho bảo quản, do vậy các yếu tố như thời gian thu hoạch, biện pháp phơi sấy trước khi đưa vào kho cũng rất quan trọng.

Tên giống Tên chủng vi khuẩn cần xét nghiệm Tên môi trường
BEAN( cây họ đậu) Pseudomonas syringae pv. Syringae KBBC, MSP, MT
Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola mKB, MSP, MT
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli MT, mXCP1, PTSA
BRASSICA( bắp cải) Xanthomonas campestris pv. campestris mCS20ABN, mFS
Xanthomonas campestris pv. armoraciae mCS20ABN, mFS
CARROTS Xanthomonas campestris pv. Carotae mD5A, mKM, mTBM
LEEK( tỏi tây) Pseudomonas syringae pv. Porri PSM, KBBC
PEA( đậu Hà Lan) Pseudomonas syringae pv. pisi SNAC, KBBC
PEPPER( tiêu) Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mTMB, MXV, CKTM
TOMATO( Cà chua) Clavibacter michiganensis subsp. michiganesis mSCM, D2ANX
Pseudomonas syringae pv. tomato KBBC, KBZ
Xanthomonas camprestris pv. vesicatoria mTMB, MXV, CKTM
BACTERIA MEDIUM
( môi trường vi sinh)
Bacteria KB, YDC, CDA, CDB
FUNGAL MEDIUM Fungi MA, CDA, CDB

I. Môi trường KBBC(K5120)

Pseudomonas syringae là một loại vi khuẩn Gram âm hình que với đuôi phân cực. Nó là một tác nhân gây bệnh trên thực vật, P. Syringae ảnh hưởng rất nhiều giống khác nhau. Pseudomonas syringae pv. Syringae là nguyên nhân gây nên bệnh chấm nâu ở họ đậu. Loại vi khuẩn này được sinh ra trong hạt, do đó chẩn đoán xét nghiệm hạt trước là điều cần thiết. KBBC là môi trường chọn lọc nhằm phát hiện Pss trong hạt. KBBC thực chất dựa trên môi trường King’s B, tuy nhiên KBBC được bổ sung boric acid(1.5g/liter), cephalexin và nystatin. Nystatin được dùng để kiểm soát nấm. Cũng có thể dùng cycloheximide để giết nấm. KBBC mang tính chọn lọc hơn môi trường MSP. Pspha, không giống như Pss, sẽ không phát triển trên KBBC. Bởi vậy, khả năng phát hiện ra Pss cao hơn khi cả hai môi trường bù nhau được dùng. Phát hiện Pss bằng cách trải que có chứa khuẩn trên KBBC và MSP. Sau đó, cụm có chứa Pss được cô lập và chuyển qua môi trường KB. Cuối cùng xác định cụm khả nghi bằng assay hay PCR. Các colonies Pss trên môi trường KBBC cí đường kính là 3-4 mm, dẹt, tròn và mờ, trắng kem, có màu xanh huỳnh quang khi chiếu dưới đèn UV. Môi trường này còn dùng để phát hiện Ps porri, Ps Pisi và Ps tomato trên hạt tỏi tây, đậu Hà Lan và cà chua.

Thành phần của môi trường KBBC(K5120)

Thành phần Gram/lit
Agar 15
Di-potassium hydrogen phosphate(K2HPO4) 1.5
Boric acid(H3BO3) 1.5
Magnesium sulphate andydrous(MgSO4 andydrous) 0.73
Proteose Peptone 20.0

Phương pháp phát hiện như sau:

– Hòa tan 38.7 gram bột của KBBC trong nước cất và điều chỉnh tới 970ml nước.
– Thêm 30ml glycerol(50%) và trộn đều
– Điều chỉnh pH tới 7.2
– Hấp môi trường ở 121oC, 15psi, trong 15 phút
– Chuẩn bị dung dịch kháng sinh vô trùng và thêm số lượng như sau trên một lít nước.
+ 80mg cephalexin monohydrate(C0110)
+ 35mg nystatin(N0138) hoặc 100mg cycloheximide( C0176)
– Khi hấp môi trường xong, để nguội tới 45 hoặc 50oC và thêm kháng sinh vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)

II. Môi trường MSP(M5167)

MSP( modified sucrose peptone) là môi trường thích hợp dành cho phát hiện Pseudomonas savastanoi pv. Phasiolicola(pspha) và Pseudo syringae(Pss). Thêm bromothymol blue làm cho môi trường có màu xanh. Màu của cụm vi khuẩn bị ảnh hưởng bởi thành phần này. Assy bắt đầu bằng trải que có vi khuẩn thu được từ hạt, cho lên môi trường MSP. Sau đó, cụm vi khuẩn khả nghi được chuyển qua môi trường King’s B. Sau cùng, cụm khả nghi được cô lập được xác định bằng test hoặc PCR.

Thành phần môi trường MSP(M5167)

Thành phần Gram/lit
Agar 20
Di-potassium hydrogen phosphate(K2HPO4) 0.5
Peptone special 0.5
Magnesium sulphate andydrous(MgSO4 andydrous) 0.13
Sucrose 20.0

Phương pháp phát hiện như sau:

– Hòa tan 45.6 gram môi trường trong nước cất rồi điều chỉnh tới 1000ml
– Chỉnh pH tới 7.4
– Hấp môi trường ở 121oC, 15psi, trong 15 phút
– Chuẩn bị dung dịch kháng sinh vô trùng và thêm số lượng như sau trên một lít nước.
+ 80mg cephalexin monohydrate(C0110)
+ 35mg nystatin(N0138)
+ 10mg vancomycin HCL(V0155)
+ 15mg bromothymol blue
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)

III. Môi trường MT

MT( Milk- Tween) là môi trường nữa chọn lọc dành cho phát hiện Pseusomonas syringae(Pss), Pseudomonas savastanoi pv. Phaseolicola(Pspha) và Xanthamonas axonopodis pv. Phaseoli (Xap) trong hạt đậu. Môi trường dựa trên khả năng của vi sinh vật thủy phân casein. Cụm khả nghi được chuyển qua môi trường YDC(Xap) hoặc KB(Pss và Psha). Cuối cùng, xác định cụm khả nghi bằng test hoặc PCR. Cụm Pspha và Pss màu trắng kem, tròn dẹt, đường kính 4-5 mm và tạo ra màu xanh huỳnh quang khi chiếu dưới đèn UV. Cụm Xap ( đường kinh 3-3.5mm) có màu vàng, không phát quang, và có 2 khu vực bao quanh cụm đó là : to hơn, vùng rõ ràng là casein hydrolysis và vùng nhỏ hơn là Tween 80 lipolysis. Xap var. fuscans( đường kính 1-2mm) tạo ra sắc tố màu nâu trong vòng 5 ngày.

Thành phần Gram/lit
Agar 20
Di-potassium hydrogen phosphate(K2HPO4) 0.5
Peptone special 0.5
Magnesium sulphate andydrous(MgSO4 andydrous) 0.13
Sucrose 20.0

Phương pháp phát hiện:

– Hòa tan 25.7 gram môi trường trong nước cất và thêm nước cất tới 800ml
– Hòa tan 10ml Tween 80 trong nước cất và điều chỉnh tới 100ml
– Hòa tan 10g sữa gầy( skim milk) trong 100ml nước cất
– Hấp các dung dịch ấy ở 121oC, 15psi, trong 15 phút.
– Chuẩn bị các kháng sinh vô trùng và thêm theo tỷ lệ trên lít:
+ 80mg cephalexin monohydrate(C0110)
+ 35mg nystatin(N0138)
+ 10mg vancomycin HCL(V0155)
– Khi môi trường hấp xong chờ cho nguội tới 45 hoặc 50oC ta tiến hành thêm Tween, bột sữa gầy và dung dịch kháng sinh.
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)

IV. Môi trường mXCP1( X5121)

mXCP1 (modified Xanthomonas Campestris pv. Phaseoli) là môi trường bán chọn lọc để phát hiện Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli(Xap) trong hạt đậu. Hai màu cụm Xap xậm và sáng đều lớn trên môi trường mXCP1. Tuy nhiên, để có được cụm màu nâu thì phải nuôi trong thời gian dài. Môi trường điều chỉnh rất cần thiết bởi vì sự phục hồi kém của chủng Xap var. fuscans. Nhận ra được cụm Xap dựa trên khả năng Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli thủy phân tinh bột( starch). Những cụm Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli trên môi trường mXCP1 được bao quanh bởi vùng sáng do thủy phân tinh bột.

Phát hiện Psp và Xap thường được thực hiện bằng assay kết hợp. Xap được phát hiện bằng cách trải que cấy chủng được cô lập từ hạt lên môi trường mXCP1. Sau đó, cụm khả nghi trên mXCP1 được chuyển qua YDC. Cuối cùng phát hiện đối tượng bằng test hoặc PCR.

Cụm Xap có màu vàng, lồi, nhầy và được bao quanh bởi vùng sáng do thủy phân tinh bột. Cụm var. fuscans được phân biệt bằng biểu hiện của sắc tố màu nâu.

Thành phần môi trường mXCP1(X5121)

Thành phần Gram/lit
Peptone special 10.0
Potassium bromide(KBr) 10.0
Calcium Chloride anhydrous(CaCl2 anhydrous) 0.25
Agar 20.0
Soluble starch 20.0
Crystal Violet 0.0015

Phương pháp phát hiện:

– Hòa tan 60.2 gram môi trường vào nước cất và điều chỉnh mực nước tơi 900ml
– Hòa tan 10ml Tween 80 vào nước cất và điều chỉnh nước tới 100ml
– Hấp các môi trường ở 121oC, 15psi, trong 15 phút
– Chuẩn bị kháng sinh vô trùng và thêm theo tỷ lệ sau:
+ 10 mg cephalexin monohydrate(C0110)
+ 3 mg 5-fluorouracil(F0123)
+ 0.1 mg tobramycin sulphate(T0153)
+ 35 mg nystatin(N0138)
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC, trộn đều và thêm kháng sinh vào.
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)
– Cất đĩa môi trường trong 4 ngày ở nhiệt độ 4oC để tăng khả năng thấy thủy phân tinh bột

V. Môi trường PTSA(P5135)

PTSA( Peptone Tyrosine Sodium Chloride Agar) là môi trường bán chọn lọc phát hiện chừng Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli trong hạt đậu. Môi trường không mang tính chọn lọc bằng mXCP1, nhưng đặc biệt cụm tư var. duscans được nhận ra bởi môi trường này bởi những sắc tố màu nâu rất nổi. Chủng Xap (màu sáng) phát triển tốt trên PTSA nhưng phát hiện rất khó bởi thiếu các sắc tố nhận diện. Xap được phát hiện bằng trải que cấy vi khuẩn được thu từ hạt trên môi trường PTSA. Sau đó cụm khả nghi được chuyển qua YDC. Cuối cùng, cụm cô lập được xác định bằng PCR hoặc kit test.
Cụm Xap var. fuscans được phân biệt bằng các sắc tố màu nâu.

Thành phân môi trường PTSA(P5135)

Thành phần Gram/lit
Peptone special 10.0
L-tyrosine 1.0
Soluble starch 2.0
Sodium Chloride(NaCl) 5.0
Agar 15.0

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 33.0 gram môi trường trong nước cất và làm đầy tới 1000ml
– Hấp môi trường ở 121oC, 15psi, trong 15 phút
– Chờ khi môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC
– Trộn đều nhẹ môi trường, tránh bong bòng và đổ ra đĩa(15-20ml/ đĩa 9.0 cm)

VI. Môi trường mCS20ABN

moi-truong-kiem-nghiem-benh-ly-thuc-vat-mCS20ABN.PNG

mCS20ABN được phát triển bởi Chang et al. thu chủng Xanthomonas campestris pv. Campestris từ hạt bông cải. Công thức môi trường gốc cho phép cô lập hầu hết các Xcc. Tuy nhiên, sự phục hồi của vài chủng Xcc rất kém do sự phụ thuộc pH nhạy cảm với neomycin. Trong môi trường cải tiến, độ pH được điều chỉnh xuống 6.5 bằng cách thêm lượng potassium dihydrogen phosphate.

Sự điều chỉnh này tăng khả năng phục hồi của chủng nhạy cảm với neomycin
Những hạt bị nhiễm bệnh được phát hiện bằng cách trải que cấy mẫu thu được trên môi trường mCS20ABN và mFS. Cụm khả nghi được chuyển sang môi trường YDC. Cuối cùng chúng được phát hiện bằng test( dùng cây con bắp cải) hoặc PCR.

Cụm Xcc và Xanthomonas campestris pv. Armoraciae có màu vàng, nhầy, đươc bao quanh bởi vùng có tinh bột bị thủy phân.

Thành phần môi trường mCS20ABN

Thành phần Gram/lit
Agar 18.0
Soluble starch 25.0
Soya peptone 2.0
Tryptone 2.0
Potassium dihydorgen phosphate (KH2PO4) 2.8
Di-amoonium hydrogen phosphate[(NH4)2HPO4] 0.8
Magnesium sulphate anhydrous( MgSO4 anhydrou) 0.1952
L-glutamine 6.0
L-histidine 1.0
Glucose monohydrate 1.0

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 58.8 gram môi trường trong 900 ml nước cất
– Điều chỉnh pH 6.5 và thêm nước tới 1000ml
– pH nên 6.5 không được hơn!
– Hấp môi trường ở 121oC, 15psi trong 15 phút
– Chuẩn bị dung dịch kháng sinh tiệt trùng và thêm theo tỷ lệ trên lít môi trường
+ 35mg nystatin(N0138)
+ 40mg neomycin(M0135)
+ 100mg bacitracin(B0106)
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau đó thêm kháng sinh vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)
– Cất đĩa môi trường trong 4 ngày ở nhiệt độ 4oC để tăng khả năng thấy thủy phân tinh bột

VII. Môi trường mFS

mFS(modified Fieldhouse Sasser medium) được phát triển để xác định bệnh chấm đen ở cây cải bắp. Môi trường này là môi trường bổ sung của mCS20ABN(C5122) dựa vào kháng sinh thay thế. Phiên bản chỉnh sửa tập trung vào lượng bổ sung tinh bột và thiếu gentamycin.

Hạt bị nhiễm bênh có thể được phát hiện bằng cách trải que cấy mẫu thu được lên môi trường mCS20ABN và mFS. Cụm khả nghi được chuyển sang môi trường YDC. Cuối cùng, phát hiện ra bằng test( dùng cây con cải bắp)
Cụm Xanthomonas campestris pv. Campestris( Xcc) và Xanthomonas campestris pv. Amoraciae(Xca) trên môi trường mFS có màu xám xanh tới trong suốt, nhầy, bao quanh bởi vùng nhỏ tinh bột bị thủy phân. Cụm thu được nhìn chung nhỏ hơn trên môi trường mCS2-ABN và có sự khác biệt về kích cỡ và được nhìn thấy sau 5-6 ngày.

Thành phần môi trường mFS

Thành phần Gram/lit
Agar 15.0
Soluble starch 25.0
Yeast extract 0.1
Di-potassium hydrogen phosphate(K2HPO4) 0.8
Potassium dihydorgen phosphate (KH2PO4) 0.8
Potassium nitrate(KNO3) 0.5
Magnesium sulphate anhydrous( MgSO4 anhydrous) 0.0488

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 42.2 gram môi trườn trong nước cất và làm đầy tới 950ml, điều chỉnh pH tới 6.8
– Thêm 1.5ml methyl green (1% aq.) và thêm nước cất cho tới 1000ml
– Hấp môi trường ở 121oC, 15psi trong 15 phút
– Chuẩn bị dung dịch tiệt trùng bao gồm vitamins, amino acids, kháng sinh trên một lít môi trường
+ 35mg nystatin(N0138)
+ 3mg D-methionine-HCl (M0715)
+ 1mg pyridoxine-HCl(P0612)
+ 50mg cephalexin monohydrate(C0110)
+ 30mg trimethoprim(T0154)
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau thêm dung dịch vừa chuẩn bị vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)
– Cất đĩa môi trường trong 4 ngày ở nhiệt độ 4oC để tăng khả năng thấy thủy phân tinh bột

VIII. Môi trường mD5A(D5124)

moi-truong-kiem-nghiem-benh-thuc-vat-mD5A.PNG

mD5A(modified D-5 Agar medium) được dùng để phát hiện Xanthomonas campestris pv. Carota)Xccar), gây nên bệnh tàn lụi trên cây cà rốt. Thu mẫu từ hạt nhiễm bệnh rồi trải que cấy lên môi trường mD5A và môi trường bán chọn lọc khác. Cụm khả nghi sau đó được chuyển qua môi trường YDC. Cuối cùng, Xác định cụm khả nghi bằng PCR. Cụm Xccar trên mD5A có màu vàng rơm, lấp lánh, tròn, nhẵn, lỗi và có đường kính từ 2-3mm.

Thành phần môi trường mD5A(D5124)

Thành phần Gram/lit
Agar 15.0
Sodium dihydrogen phosphate(NaH2PO4) 0.9
Di-potassium hydrogen phosphate(K2HPO4) 3.0
Magnesium sulpahte andydrous(MgSO4 anhydrous) 0.15
Ammonium chloride(NH2Cl) 1.0

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 20.1 gram môi trường vào nước cất và thêm nước cho tới 900ml, điều chỉnh pH tới 6.4
– Hòa tan 10.0 gram D-cellobiose trong nước cất và thêm nước cất cho tới 100ml
– Hấp môi các môi trường này riêng biệt ở 121oC, 125psi, trong 15 phút
– Chuẩn bị các dung dịch vô trùng amono acids và kháng sinh và thêm theo tỷ lệ trên lít như sau:
+ 5mg L-glutamic acid(G0707)
+ 1mg L-methione(M0715)
+ 35mg nystatin (N0138)
+ 10mg cephalexin monohydrate(C0110)
+ 10mg bacitracin(B0106)
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau thêm dung dịch vừa chuẩn bị vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)

IX. Môi trường mKM(K5125)

mKM (modified KM-1 medium) được dùng để phát hiện Xanthomonas hortorum pv. Cartotae( Xccar). Hạt bị nhiễm bệnh có thể được phát hiện bằng cách thu mẫu( cô lập vi khuẩn) trải lên môi trường mD5A và môi trường bán chọn lọc khác. Sau đó chuyển qua môi trường YDC. Cuối cùng, xác định mẫu khả nghi bằng phương pháp PCR. Cụm Xccar trên mKM có màu vàng kem, sáng nâu cho tới vàng anh đào, lấp lánh, tròn và có đường kính khoảng 2-4 mm.

Thành phần của môi trường mKM(K5125)

Thành phần Gram/lit
Agar 18
Potassium dihydorgen phosphate (KH2PO4) 1.2
Di-potassium hydrogen phosphate(K2HPO4) 1.2
Ammonium chloride(NH4Cl) 1.0
Lactose monohydrate 10.0
Threlalose anhydrous 4.0
2-Thiobarbituric acid 0.2
Yeast Extract 0.5

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 36.1 gram môi trường vào nước cất và điều chỉnh tới 1000ml, pH 6.6
– Hấp dung dịch ở 121oC, 15psi, trong 15 phút
– Chuẩn bị dung dịch kháng sinh vô trùng và thêm theo tỷ lệ sau:
+ 35mg nystatin(N0138)
+ 10mg cephalexin monohydrate(C0110)
+ 50mg bacitracin(B0106)
+ 2mg tobramycin sulphate(T0153)
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau thêm dung dịch vừa chuẩn bị vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)

X. Môi trường mTBM(T5132)

mTBM được dùng để phát hiện Xanthomonas hortorum pv. Caratae( Xccar). Môi trường bán chọn lọc cho Xanthomonas hortorum pv. Cartotar là mKM(K5125) và mD5A(D5124). Cụm Xanthomonas hortorum pv. Carotae trên môi trường mTBM thường có màu trắng hoặc vàng hoặc trắng vàng, lấp lánh, tròn, dẹt với viền và bao quanh bởi vùng không có casein thủy phân

Thành phần của môi trường mTBM:

Thành phần Gram/lit
Agar 15.0 15.0
Boric acid( H3BO3) 0.3 0.3
Potassium bromide(KBr) 10.0 10.0
Peptone 10.0moi-truong-vi-sinh-mTBM.PNG 10.0

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 35.5 gram môi trường trong nước cất và làm đầy tới 800ml, pH 7.4
– Hòa tan 10ml Tween 80 trong nước cất và làm đầy tới 100ml
– Hòa tan 10g sữa gầy( Skim milk) trong nước cất và làm đầy tới 100ml
– Hấp môi trường riêng biệt tại 121oC, 15psi, trong 15 phút.
– Chuẩn bị dung dịch kháng sinh vô trùng và thêm số lượng theo tỷ lệ trên lít như sau:
+ 20mg nystatin(N0138)
+ 65mg cephalexin monohydrate(C10110)
+ 12mg 5-fuorouracil(F0123)
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau thêm dung dịch vừa chuẩn bị vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)

XI. Môi trường PSM(P5134)

Pseudomonas Syringae pv. Porri(Pspo) là tác nhân gây ra bệnh tàn lụi trên cây tỏi tây. Loại mầm bệnh này ở hạt do đó sẽ kiểm tra trên hạt có bệnh hay không. Hạt có thể bị hủy hoại nhanh nếu nhiễm bệnh và ở đó có sự hiện diện của Pspo. Để phát hiện bệnh này thì mẫu bênh cô lập được nuôi trên KBBC và PSM( Pseudomonas Syringae medium). Cụm khả nghi Pspo sau đó được chuyển qua môi trường KB. Sau đó phát hiện cụm khả nghi bằng kính hiển vi huỳnh quang miễn dịch.

Cuối cùng, khẳng định sự có mặt của Pspo bwangf PCR hoặc assy dùng cây tỏi con.
Trên môi trường PSM, cụm có đường kính từ 2-4mm, tròn với đường mép nhẵn, trong, vàng kem cho tới trắng. Lưu ý rằng có nhiều màu trên cụm Pspo có sự sự tích tụ của bromothymol blue trên mỗi cụm dựa vào tổng số cụm trên đĩa.

Thành phần của PSM(P5134)

Thành phần Gram/lit
Sucrose 20.0
Peptone special 5.0
Di-potassium hydrogen phosphate(K2HPO4) 0.5
Magnesium sulphate andydrous(MgSO4) 0.13
Agar 20.0

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 45.6 gram môi trường trong 970ml nước cất, chỉnh pH 7.5 và làm đầy nước tới 990ml
– Cho 1g acid boric trong bình nước cất 10ml
– Hấp môi trường riêng biệt ở 121oC, 15psi, trong 15 phút.
– Chuẩn bị môi trường tiệt trùng và thêm theo tủ lệ sau:
– 80mg cephalexin monohydrate(C0110)
– 35mg nystatin(N0138)
– 10mg vancomycin HCl(V0155)
– 15mg bromothymol blue
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau thêm dung dịch vừa chuẩn bị vào
— Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)

XII. Môi trường SNAC(S5130)

Pseudomonas syringae pv. Pisi là tác nhân gây bệnh tàn lụi trên cây đậu Hà Lan. Dùng hạt đậu sạch bệnh để kiểm chứng trong suốt quá trình. SNAC được dẫn xuất từ môi trường SNA. Tính chọn lọc của môi trường được tăng khi thêm acid boric và kháng sinh. Dùng mẫu thu được nuôi trên môi trường bán chọn lọc như SNAC và/hoặc KBBC để phát hiện Psp. Cụm khả nghi được chuyển qua môi trường KB. Sau đó dùng kính hiển vi quang học miễn dịch và PCR để khẳng định kết quả.

Cụm Pspi trên môi trường SNAC có màu trắng tới nhầy trong suốt và có hình dạng hình vòm.

Thành phần môi trường SNAC(S5130)

Thành phần Gram/lit
Tryptone 5.0
Peptone 3.0
Sodium chloride(NaCl) 5.0
Sucrose 50.0
Agar 15.0

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 75.0 gram môi trường trong nước cất và điều chỉnh tới 990ml
– Thêm 1g acid boric trong 10ml nước cất
– Hấp các dung dịch riêng lẻ ở 121oC, 15psi và trong 15 phút
– Chuẩn bị dung dịch kháng sinh vô trùng và thêm theo tỷ lệ dưới:
+ 80mg cephalexin monohydrate(C0110)
+ 35mg nystatin(N0138)
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau thêm dung dịch vừa chuẩn bị vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)

XIII. Môi trường KB(K5165)

KB(King’s B) là môi trường không chọn lọc và được dùng để cấy chuyền các cụm được cô lập. Bổ sung kháng sinh như cephalexin sẽ làm cho môi trường mKB thích hợp hơn để xác định nhiều chủng Psudomonads và Pseudomonas syringae pv. Syringae và Pseudomonas savastonoi pv. Phaseolicola
Môi trường King’s B là một trong những môi trường khác được dùng cho phát hiện và cấy chuyền pseudomonads huỳnh quang từ hạt và cây. Phathovar của Pseudomonas syringae sản sinh ra sắc tố xanh huỳnh quang có thể hiển thị dưới đèn UV.

Thành phần môi trường KB(K5165)

Thành phần Gram/lit
Agar 15.0
Di-potassium hydrogen phosphate(K2HPO4) 1.5
Magnesium sulphate anhydrous(MgSO4 anhydrous) 0.73
Proteose 20.0

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 37.2 gram môi trường trong nước cất và làm đầy tới 980 ml nước cất, và điều chỉnh pH tới 7.5
– Thêm 20ml glycerol 50%
– Hấp các dung dịch riêng lẻ ở 121oC, 15psi và trong 15 phút
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau thêm dung dịch vừa chuẩn bị vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)
– Lựa chọn thêm: thêm 50mg cephalexin và 35mg nystatin trên lít môi trường để chọn lọc cho pseudomonads(mKB)

XIV. Môi trường YDC(Y5136)

YDC( Yeast Extract-dextrose-CaCO3) là môi trường không chọn lọc. YDC dùng để cấy chuyển các chủng Xanthomonads(vàng) và clavibacters(cam) sau khi cho lên môi trường bán chọn lọc

Thành phần môi trường YDC:

Thành phần Gram/lit
Agar 15.0
Yeast extract 10.0
Calcium carbonate(CaCO3) 20.0
Glucose anhydrous 20.0

Phương pháp xác định:

– Hòa tan 65.0 gram môi trường trong nước cất và làm đây tới 1000ml, pH là 6.9
– Hấp các dung dịch riêng lẻ ở 121oC, 15psi và trong 15 phút
– Chờ cho môi trường nguội tới 45 hoặc 50oC sau thêm dung dịch vừa chuẩn bị vào
– Trộn nhẹ đều, tránh bong bóng và đổ ra đĩa( 15-20ml/đĩa 9.0 cm)
– Trong quá trình đổ môi trường, trộn CaCO3 cho thật kỹ.

Thông tin chi tiết về sản phẩm xin vui lòng liên hệ:

CTY TNHH TMDV KHOA HỌC SBC VIETNAM
Email: info@sbc-vietnam.com
Tel: (+84) 68400104
Hotline: (+84) 945677929

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *