Môi trường nuôi cấy mô cây lúa- gạo

Hơn 90% lúa gạo được trồng và tiêu thụ ở Châu Á, nơi có khoảng 55% dân số thế giới sống, phản ánh giá trị của gạo trong cuộc sống hàng ngày của con người (Bajaj và Mohanty, 2005). Việc nuôi cấy mô trên cây lúa nhằm cho mục đích nghiên cứu chuyển gene vào cây lúa ví dụ như gene kháng hạn, gene kháng mặn…

Kỹ thuật nuôi cấy mô trên cây lúa- cụ thể là Nàng Thơm Chợ Đào.

Lúa – Gạo là một trong số rất ít các loại ngũ cốc thực phẩm thích nghi với sự biến đổi di truyền và gần đây đã nổi lên như một loại ngũ cốc mẫu cho nghiên cứu tổ chức gen, sự biểu hiện gen và chức năng cũng như số phận của gen chuyển gen (Datta et al., 2002; Tyagi et al. , 2004). Mặc dù nhiều báo cáo thành công đã được mô tả trong gạo cũng như các loại ngũ cốc khác, sự chuyển đổi thường xuyên của giống lựa chọn vẫn còn khó khăn do đáp ứng đặc hiệu gen cụ thể trong nuôi cấy in vitro (Visarda và Sarma, 2004).

Nghiên cứu này tập trung nghiên cứu mô hình trồng lúa indica nổi tiếng Nang Thom Cho Đào (NTCD) với mục tiêu phân tích các thông số mô tả sự phù hợp các loại môi trường đối với từng giai đoạn nuôi cấy mô cây lúa. Áp dụng công nghệ chuyển gene trên giống NTCD với các gene từ các nguồn khác có thể được sử dụng để làm cho cây lúa chịu được hoặc chịu được sâu bệnh, bệnh tật, và gene chiu các stress môi trường khác nhau, các gene giàu chất dinh dưỡng như sắt, beta-caroten, axit béo, …

Con đường nuôi cấy mô trên cây lúa NTCD

Con đường được sử dụng để tái tạo cây lúa là tái sinh gián tiếp. Con đường này bao gồm 3 giai đoạn: tạo mô sẹo (callus), tái sinh chồi và tạo rễ. Trong quá trình này, các nghiên cứu trước cũng đã cho thấy việc sử dụng các chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật cụ thể và phạm vi nồng độ của chúng (Cheema và Hussain, 2004; Behera and Sahoo, 2009; Karim et al, 2002; Rashid và cộng sự, 2009).

Đối với việc tạo mô sẹo , hormone 2,4-D là thuốc trừ cỏ thông dụng chung được sử dụng trong việc kiểm soát cỏ dại lá rộng và thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm để nghiên cứu thực vật và bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật như môi trường MS. 2,4 D đã được tìm thấy có hiệu quả ở khoảng 1 tới 4 mg / l. Katiyar 1999 và Zhenyu et al, 1999 báo cáo rằng đáp ứng tốt nhất của hạt giống trưởng thành đối với điều kiện nuôi cấy in vitro là 2-3 mg / l;

Để tái sinh chồi từ mô sẹo, ta sử dụng cytokinins để kích thích sự tái sinh. Một số loại và sự kết hợp điều chỉnh tăng trưởng đã được nghiên cứu bao gồm GA3 và kinetin, BAP và NAA, BAP và IBA (Karim et al, 2002; Rashid và cộng sự, 2009). Đáng chú ý nhất, khi kết hợp BA và NAA đã được thử nghiệm ở khoảng 1-3 mg / l và 0.2-1 mg / l, tỷ lệ tái sinh đạt 60-70% với BA 3 mg / l và NAA 0,3 mg / l .

Môi trường MS(Murashige and Skoog, 1962) và cách pha chế được sử dụng với công thức bên dưới

Elements in culture stock solutions Concentration in stock solution (mg/l) Concentration in culture medium (mg/l)
Đa lượng: Dissolve them in 1000 ml of distilled water, take 50 ml/l medium
KNO3
NH4NO3
CaCl2.2H2O
MgSO4·7H2O
KH2PO4
38,000
33,000
8,800
7,400
3,400
1,900
1,650
440
370
170
Vi lượng: Dissolve them in 400 ml of distilled water, take 2 ml/l medium
Na2EDTA

FeSO4.7H2O

7,460
5,560
37.3
27.8
MnSO4·4H2O
ZnSO4·7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4·2H2O
CuSO4·5H2OCoCl2·6H2O
3,380
1,720
1,240
166
50
5
5
16.9
8.6
6.2
0.83
0.25
0.025
0.025
Vitamins: Dissolve them in 400 ml of distilled water, take 2 ml/l medium
Thiamine HCl
Nicotinic acid
Pyridoxine HCl
Glycine
Myo inositol
20
100
100
400
20,000
0.1
0.5
0.5
2.0
100
Others
Casein hydrolysate 30 g/l
Sucrose 30 g/l
Agar 8 g/l (agar medium)
0 g/l (liquid medium)
pH: 5.8

Nội dung các bước:

a. Giai đoạn vô trùng mẫu

Hạt giống đã bóc vỏ cẩn thận bằng tay để tránh tổn thương phôi và rửa bằng nước cất 2 đến 3 lần. Các hạt này được rửa bằng ethanol 70% (w / w) với lắc trong 5 phút và sau đó rửa lại với nước cất để loại bỏ lượng ethanol còn xót. Khử trùng bề mặt hạt được thực hiện trên máy lắc bằng dung dịch Javel 50% (w / w). Sau 30 phút, dung dịch đã được loại bỏ và hạt được rửa kỹ lưỡng 5 – 6 lần với nước cất vô trùng. Hạt tiệt trùng của gạo đã được blotted vài phút trên giấy blotering vô trùng và chuyển vào bình hình nón chứa môi trường cảm ứng callus.

b. Giai đoạn tạo mô sẹo và tăng sinh khối

Hạt được khử trùng (Hình 1A) được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có chứa các nồng độ 2,4-D, tức là 1, 2, 3, 4 mg / l đối với sự phát triển của callus (giữ trong điều kiện tối). Sự hình thành mô sẹo được tìm thấy sau khoảng 7 – 10 ngày, ta tiếp tục nuôi mô sẹo trong 1-2 tháng tiếp theo (Hình 1B, 1C, 1E; Hình 2). Trên môi trường chứa 2 mg / l 2,4-D, kích thước callus có đường kính lớn nhất so với môi trường có chứa 1, 3 và 4 mg / l 2,4-D. Trên môi trường có nồng độ thấp 2,4-D (1 mg / l) và nồng độ cao 2,4-D (4 mg / l), vài mô sẹo có màu nâu (Hình 2A, 2D) vào cuối giai đoạn nuôi cấy (Sau 1,5 tháng).

Tỷ lệ hình thành mô sẹo là 85,92%, 78,52%, 73,33% và 59,26% đối với môi trường có tên là RC2 , RC4, RC3 và RC1; Môi trường hiệu quả nhất đối với NTCD là 85,92%; RC2 có chứa 2 mg / l 2,4-D (Bảng 3)

Tỷ lệ hình thành mô sẹo là 85,92%, 78,52%, 73,33% và 59,26% đối với môi trường có tên là RC2 , RC4, RC3 và RC1; Môi trường hiệu quả nhất đối với NTCD là 85,92%; RC2 có chứa 2 mg / l 2,4-D (Bảng 3).

Thông qua nuôi cấy tế bào callus (1 lần / tháng) từ chu kỳ thứ hai trở đi, sự hình thành mô sẹo dễ vỡ (hình 1F) đã được tìm thấy cùng với sự gia tăng sự hình thành phôi . Sự hình thành loại callus này ngày càng tăng theo thời gian; Nó phát triển nhanh và mất khả năng tái sinh / cây trồng.

Tế bào callus có thể được nuôi cấy và duy trì trên môi trường thạch hoặc trong môi trường lỏng trong tối đa 4-5 tháng (Hình 2E, 2F). Sau thời gian đó, callus trở nên dễ vỡ, khả năng phục hồi của mô đã giảm hoặc thậm chí bị mất.

c. Giai đoạn tái sinh chồi từ mô sẹo

Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có chứa BA và NAA khác nhau để tái sinh (giữ trong điều kiện ánh sáng). Callus trở thành màu trắng, nhỏ gọn, màu xanh nhạt sau khoảng 10 ngày nuôi cấy, các chồi nhỏ phát triển sau khoảng 1 tháng nuôi (Hình 4G, 4H). Trong một số trường hợp, nhiều môi trường đã được quan sát thấy trên môi trường có nồng độ BA cao (3 mg / l) (Hình 4C, 4E).

Tỉ lệ tái sinh thực vật là 9,53%, 43,62%, 67,69%, 24,80% và 54,44% đối với RR1, RR2, RR3, RR4 và RR5 trung bình; Tái sinh thực vật cao nhất trong NTCD là 67,69% ở RR3 trung bình có BA3 mg / l BA và NAA 0,3 mg / l (Hình 3).

Về nguyên tắc, BA – một loại cytokinin đóng một vai trò rất quan trọng trong việc hình thành chồi. Do đó, ở môi trường có nồng độ BA cao (3 mg / l) (RR3 và RR5), số lượng chồi được hình thành cao hơn (67,69%, 54,44%) so với môi trường RR1, RR2 và RR4 (1-2) Mg / l BA) (lần lượt là 9,53%, 43,6% và 24,8%). Nhiều rễ ngẫu nhiên cũng được quan sát trên bề mặt callus trên môi trường có chứa NAA 1 mg / l; Theo chúng tôi, NAA ở nồng độ cao này gây ra sự hình thành rễ. Khi chồi đạt chiều cao khoảng 5 cm, chúng được phân lập và nuôi cấy trên môi trường mới để phát triển.

d. Môi trường tạo rễ

Các cây tái sinh (cao 5-10 cm) được nuôi cấy vào môi trường MS mà không có điều chỉnh sinh trưởng để rễ (Hình 4I, 4J) trước khi cấy vào đất để cứng và phát triển. Kết quả ban đầu cho thấy các cây tái sinh phát triển bình thường trong nhà kính, không có bất kỳ kiểu hình bất thường nào (Hình 4K).

Kết luận

Từ kết quả thu được, chúng tôi đã có thể kết luận một số phát hiện quan trọng:

– Từ hạt trưởng thành được nuôi cấy trong ống nghiệm, callus được bắt đầu trên môi trường MS có nồng độ khác nhau 2,4-D. Tỷ lệ phần trăm callus cảm ứng cao nhất được quan sát thấy trong môi trường MS bổ sung với 2 mg / L 2,4-D.

– Tái sinh chồi bằng cách cho mô sẹo phát triển trên môi trường MS bổ sung với sự kết hợp các chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật khác nhau, benzyl-aminopurine (BA) và axit naphthaleneacetic (NAA). Đáp ứng tốt nhất của callus cho tái sinh của chồi / cây đã được quan sát thấy trên môi trường bổ sung với 3 mg / L BA và 1 mg / l NAA đối với giống lúa NTCD. Các cây tái sinh được trồng với môi trường MS mà không có điều chỉnh tăng trưởng thực vật trước khi chuyển qua nhà kính.

REFERENCE

https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/hoa-chat-dung-cu-nuoi-cay-mo-thuc-vat/moi-truong-nuoi-cay-mo-cay-lua-gao.aspx

1. Aldemita RR, Hodges TK, 1996. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of japonica and indica varieties. Planta 199: 612-617.
2. Baisakh N, Datta K, Oliva N, Ona I, Rao GJN, Mew TW, Datta SK, 2002. Rapid development of homozygous transgenic rice using anther culture harboring rice chitinase gene for enhanced sheath blight resistance. Plant Biotechnology 18: 101-108.
3. Bajaj S, Mohanty A, 2005. Recent advances in rice biotechnology – towards genetically superior transgenic rice. Plant Biotechnology Journal 3:275-307.
4. Chand S, Sahrawat AK, 2001. Stimulatory effect of partial desiccation on plant regeneration in indica rice (Oryza sativa L.). J. Plant Biochem.& Biotech. 10: 43-47.
5. Datta K, Baisakh N, Thet KM, Tu J, Datta SK, 2002. Pyramiding transgenes for multiple resistance in rice against bacterial blight, yellow stem borer and sheath blight. Theoretical and Applied Genetics 106: 1-8.
6. Datta SK, Datta K, Soltanifar N, Donn G, Potrykus I, 1992. Herbicide resistant indica rice plants from IRRI breeding line IRRI after PEG mediated transformation of protoplast. Plant Mol.Biol. 20: 619-629.
7. Diah P, Bhalla PL, 2000. Plant regeneration from mature embryo derived callus of Australian rice (Oryza sativa L.) varieties. Australian Journal of Agricultural Research 51:305-312.
8. Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T, 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6: 271-282.
9. Hoque ME, Ali MS, Karim NH, 2007. Embryogenic callus induction and regeneration of elite Bangladeshi indica rice cultivars. Plant Tissue Cult. & Biotech. 17(1): 65-70, 2007
10. Jain RK, 1997. Effects of some factors on plant regeneration from indica rice cells and protoplasts – A review. Indian Journal of Experimental Biology 35: 323-331.
11. Kathuria H, Giri J, Tyagi H, Tyagi AK, 2007. Advances in transgenic rice biotechnology. Crit. Rev. Plant Sci. 26: 65-103.
12. Katiyar SK, Chandel G, Singh P, Pratibha R, 1999. Genetic variation and effect of 2,4-D in in-vitro plant regeneration in indica rice cultivars. Oryza 36: 254-256.
13. Khelada L, Al- Forkan, 2006. Genotypic variability in callus induction and plant regeneration through somatic embryogenesis of five deep water rice (Oryza sativa L.) cultivars of Bangladesh. African Journal of Biotechnology 5 (16): 1435-1440.
14. Kishor PBK, Sangam S, Naidu KP, 1999. Sodium, potassium, sugar, alcohol and proline mediated somatic embryogenesis and plant regeneration in recalcitrant rice callus. Plant Tissue Cult. Biotech.: Emerging Trends. Proc. Symposium held at Hyderabad, India, 78-85.
15. Kyuozuka J, Otoo E, Shimamoto K, 1988. Plant regeneration from protoplast of indica rice: genotype differences in culture response. Theoretical and Applied Genetics 76: 887-890.
16. Lee K, Jeon H, Kim M, 2002. Optimization of a mature embryo-based in vitro culture system for high-frequency somatic embryogenic callus induction and plant regeneration from japonica rice cultivars. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 71: 237-244.
17. Li L, Duan S, Kong J, Li S, Li Y, Zhu Y 2007. A single genetic locus in chromosome 1 controls conditional browning during the induction of calli from mature seeds of Oryza sativa ssp. Indica. Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 89: 237-245.
18. Lin YJ, Zhang Q, 2005. Optimizing the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice. Plant Cell Reports 23: 540-547.
19. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.
20. Pandey SK, Ramesh B, Gupta PK, 1994. Study on effect of genotype and culture medium on callus formation and plant regeneration in rice (Oryza sativa L.). Indian Journal of Genetics 54: 293-211.
21. Rafique MZ, Zia M, Rashid H, Chaudhary MF, Chaudhry Z, 2010. Comparison of transgenic plant production for bacterial blight resistance in Pakistani local rice (Oryza sativa L.) cultivars. African Journal of Biotechnology 9 (13): 1892-1904.
22. Rashid H, Toriyama K, Quraishi A, Hinata K and Malik KA, 2000. An improved method for shoot regeneration from calli of Indica rice (Basmati). Pak. J. Biol. Sci. 3(12): 2229-2231.
23. Rashid H, Yokoi S, Toriyama K and Hinata K, 1996. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Rep. 15: 727-730.
24. Rueb S, Leneman M, Schilperoort RA, Hensgens LAM 1994. Efficient plant regeneration through somatic embryogenesis from callus induced on mature rice embryos (Oryza sativa L.). Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 36: 259-264.
25. Saharan V, Yadav RC, Yadav NR, Chapagain BP, 2004. High frequency plant regeneration from desiccated calli of indica rice (Oryza sativa L.). Afr. J. Biotechnol. 3: 256-259.
26. Seraj ZI, Islam Z, Faruque MO, Devi T, Ahmed S, 1997. Identification of the regeneration potential of embryo derived calluses from various indica rice varieties. Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 48: 9-13.
27. Seraj Zl, Islam Z, Omar Faruque M, Devit, Ahmed S, 1997. Identification of the regeneration potential of embryo derived calluse from various indica rice varieties. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 48:9-13.
28. Suprasanna S, Ganapathi TR, Rao PA, 2000. High frequency plant regeneration from somatic embryos of indica rice. Rice Genetics News letter 1:183.
29. Tyagi AK, Khurana JP, Khurana P, Raghuvanshi S, Gaur A, Kapur A, Gupta V, Kumar D, Ravi V, Vij S, et al., 2004. Structural and functional analysis of rice genome. J. Genet. 83: 79–99.
30. Vega R, Vásquez N, Espinoza AM, Gatica AM, Valdez-Melara M (2009) Histology of somatic embryogenesis in rice (Oryza sativa cv. 5272) Int. J. Trop. Biol. 57: 141-150.
31. Visarda KBRS, Sarma NP, 2004. Transformation of indica rice through particle bombardment: factors influencing transient expression and selection. Biologia Plantarum 48(1): 25-31.
32. Wenzhong T, Rance I, Sivamani E, Fauquet C, Beachy RN, 1994. Improvement of plant regeneration frequency in vitro in indica rice. Chin. J. Genet., 21: 1-9.
33. Yookongkaew N, Srivatanakul M, Narangajavana J, 2006. Development of genotype-independent regeneration system for transformation of rice (Oryza sativa ssp. indica). Journal of Plant Research 120(2): 237-245.
34. Zaidi MA, Narayanan M, Sardana R, Taga I, Postel S, Johns R, McNulty M, Mottiar Y, Mao J, Loit E, Altosaar I, 2006. Optimizing tissue culture media for efficient transformation of different indica rice genotypes. Agronomy Research 4 (2):563-575.
35. Zhang J, Xu RJ, Elliott MC, Chen DF, 1997. Agrobacterium mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Mol. Biotechnol. 8: 223–231.
36. Zhenyu G, Gaozy HD, Huang DN, 1999. Some factors influencing callus formation and plant regeneration in indica rice varieties. Plant Physiology Comments 35: 113-115.

 

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *