Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sinh trưởng, phát triển và hàm lượng hoạt chất cordycepin của nấm Cordyceps militaris NBRC 100741 trên nhộng tằm

He stood there for a long time. Tami Learningpdf Joan and John desperately retreated until they reached the 70-697 Exam Study Guide other side of Examprepwell the door, holding two sweaty bodies tightly together. The drivers hand bent Examprepwell into the shape of a cup, blocking the lights shone on the street light, looked at them more carefully. Suddenly, a loud noise echoed in the air. Tameron could not help but constricted a 200-125 Test Exam PDF while, and 70-412 dumps John made a Learningpdf short, screaming scream. Behind the driver, the air in the distance was filled with bright red and blue flame stripes instantly. Then again is a few roar and scream. The driver turns and looks up, just to see a huge, orange-red 200-125 Test Exam PDF cobweb over the city. It was a fireworks, and Tamie remembered the Learningpdf news read in the newspaper. It is a gift from the host and the Secretary-General of the United Nations to the delegates Learningpdf attending the conference and Examprepwell welcomes them to this great city on Earth. The driver turned 200-125 Test Exam PDF Examprepwell toward the taxi again. Pat soon, he 300-085 Exam Demo opened the door 70-697 Exam Study Guide lock, slowly opened the door. 2 As usual, the informant did not leave a name. Therefore, there is no other way to pour back into the past to understand what the reporter said is a Learningpdf piece of open space. The headquarters radio said He said it was on the Examprepwell 37th Street near Eleventh Street. Those at the Notification Center Learningpdf never figured out where the exact location of the murder was. Although it is nine oclock Examprepwell in the morning, it has made 70-412 dumps people sweat more than hot. Emilia Shakes lay aside a tall grass thatch. She is conducting a search of light – a jargon of crime scene investigators – searching for suspicious objects with an S-shaped route. Nothing at all She looked down at the intercom on the dark blue uniform shirt. Patrolman 5885 70-412 dumps calls headquarters without any notice. Do Examprepwell you have any further news The dispatcher replied in a bumpy noise 5885, there 70-412 dumps is no more information about the scene of the crime at the moment, but one thing The informant 200-125 Test Exam PDF said 70-697 Exam Study Guide he hoped the victim was 70-412 dumps dead. Please say it again, headquarters. 70-412 dumps 300-085 Exam Demo The complainant said he hoped the victim was 70-697 Exam Study Guide already dead. He said it would Learningpdf be best if so. Finished. Hopefully the victim Dead Shakes struggled across a broken barbed wire and began searching for another piece of open space. Still not found. She wants to leave. Just call 10-90, report that without any discovery, you can return to the Si Si area, 300-085 Exam Demo 70-412 dumps it is her daily patrol area. Her 300-085 Exam Demo knees hurt and she 70-697 Exam Study Guide felt as if she had been roasted on a 300-085 Exam Demo terrible August day. She Examprepwell just wanted to slip to the Port Authority and get stuck with the Little Furrier there and come back to a 70-412 dumps Learningpdf large can Learningpdf of Arizona iced tea. Then, at eleven 300-085 Exam Demo thirty – just two hours now – she was able to clear the drawers in 200-125 Test Exam PDF the south section of Midtown and go to the lower town for training. But 200-125 Test Exam PDF 200-125 Test Exam PDF she finally Examprepwell did not 70-697 Exam Study Guide do 70-697 Exam Study Guide this. She can not leave this briefing without answering the phone call. As she 200-125 Test Exam PDF continued to move on, she walked along the hot sidewalk through the path between the two abandoned apartments and 200-125 Test Exam PDF into another covered, planted area. She slid her slender forefinger 70-412 dumps down into her flat-top hat and scratched it with irresistible 70-697 Exam Study Guide restraints through layers of long, red hair on her head. In order to scratch more scalp, she simply faded her cap side, while crazy scratch. Sweat streaming 300-085 Exam Demo down her forehead, itchy, so she fiercely blew Examprepwell a few brows.

She was 200-125 Test Exam PDF thinking Only the last two hours of patrolling in the street were available, and Learningpdf I could survive. Shakes 70-697 Exam Study Guide continued. The first time she felt uneasy this morning as she walked into a bush. Someone is watching me. The hot wind blew through the dry bushes and made the rustling sound. A car truck ran full steam ahead of the Lincoln Tunnel. She remembered one thing the patrolmen would often think of the city was so noisy that I could not Learningpdf detect if someone came back to me behind me and walked to lift me up with a Learningpdf knife. Or take my back as a target She turned quickly. Nothing except Examprepwell leaves, 200-125 Test Exam PDF rusty machines and rubbish. When climbing a pile of stones, the knee pain so she could not help but shrink body. Emily Shakes, 31, is afflicted with joint inflammation – her mother often Examprepwell says youre 31 It is inherited from her grandfather, just 70-412 dumps as she inherited her mothers good figure, her fathers good looks and occupation as long as the red hair no one can say it. She slowly passed through a cluster of dead shrubs, a sharp pain on her knees. Thanks to her prompt closing, she did not drop a steep 30-foot deep slope. Below her was a gloomy gorge that cut deeply through the bottom of the West End. The railroad tracks of the U.S. Railroad Passenger Transport Company run through the canyon and the train goes to the north. She narrowed her eyes 70-697 Exam Study Guide and looked to the bottom of 300-085 Exam Demo the canyon not far from the tracks. what is that Is inserted in a circle of soil has been 300-085 Exam Demo turned over the twigs It looks 70-697 Exam Study Guide like Europe, my god The sight of her made her shiver. Nausea 300-085 Exam Demo suddenly rose, burning 70-697 Exam Study Guide like a flame burning her skin. For a moment she really wanted to turn around and escape, pretended nothing was seen. But she tried hard to suppress the idea in my heart. He 200-125 Test Exam PDF hopes the victim is dead. This is 70-412 dumps the best. She runs to an iron staircase that 200-125 Test Exam PDF leads Learningpdf from the 70-412 dumps sidewalk to the canyon. She stopped in time as she grabbed the balustrade of the iron staircase. bad The murderer has escaped in all likelihood, and is likely to have left the ladder. If she touches the railings, she may undermine the mark he left behind when he ran away. Okay, then Examprepwell well waste something. She took a deep breath and held 70-412 dumps back 200-125 Test Exam PDF the pain of the knee joint. She 300-085 Exam Demo inserted the deliberately polished bright boot into the crevice of the stone on the first day of her new job and began to climb down the rock wall. She was still four feet off the ground and jumped straight to 70-412 dumps the place where it was Learningpdf buried. My God It is not a branch that extends from under the ground it is a mans hand. The body of this man was buried vertically in the earth, leaving only the 70-697 Exam Study Guide arm, wrist and palm left outside. She stared at the ring finger of 300-085 Exam Demo the hand all the muscles had been cut off, 70-412 dumps the red of the bones of the fingers, set with a huge female diamond ring. Shakes knelt on Examprepwell the ground, began digging down. The soil fluttered under her hands as a dog. She found 70-697 Exam Study Guide that those fingers that had not been cut 300-085 Exam Demo were wide open, pointing in the direction that their fingers would not normally 300-085 Exam Demo bend. This 200-125 Test Exam PDF shows that the victim was still alive when the Learningpdf last shovel 70-697 Exam Study Guide 200-125 Test Exam PDF of mud buried his face. Maybe its still alive now. Shakes desperately dug soft soil, her hands were shattered by pieces of glass, dark red 300-085 Exam Demo Examprepwell blood Examprepwell and dark red soil mixed together. This persons hair is exposed, followed by a bluish, gray forehead due to lack of oxygen. She continued digging until she saw the dull eyes and mouth of the man. The mans mouth twisted into horrible curvature, indicating that in the last few seconds of life the victim struggled to keep his mouth through the rising black soil. This is not a woman. Despite Learningpdf the finger on the set of a diamond ring. He was 70-412 dumps a big man in his fifties and was as angry as 300-085 Exam Demo the soil surrounding him. She took a few steps back, her gaze never leaving that person, almost tripped over by the tracks behind her. For a while, her mind was empty and could not think of anything, only knowing that a man was buried to die like this. Then she reminded herself Be strong, baby. In front of you is the scene of a homicide together, and you are the first police officer present. You know what to do ADAPT, adapt. A is the 70-697 Exam Study Guide current arrest of Arrest. D is a major eyewitness and suspect to Detain. A is Assess murder scene. P is P what is it She bowed her head towards the walkie-talkie Patrolman 5885 calls headquarters.

Tóm tắt

Cordyceps militaris (L.) Link được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở châu Á nhờ có nhiều tá dụng dược lý quan trọng. Nuôi cấy nấm C.militaris được nghiên cứu rộng rãi nhằm tạo thể quả đạt số lượng và chất lượng để sử dụng trong y học và thực phẩm bổ dưỡng.

Nhiệt độ và ánh sáng là hai trong nhiều yếu tố môi trường quan trọng cho quá trình sinh trưởng, phát triển hình thành thể quả và sinh tổng hợp hàm lượng cordycepin của nấm Cordyceps militaris. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm đánh giá yếu tố nhiệt độ và ánh sáng đến khả năng hình thành thể quả và hoạt chất cordycepin của nấm Cordyceps militaris NBRC 100741 trên nhộng tằm. Kết quả cho thấy nhiệt độ tối ưu cho cho sự sinh trưởng, phát triển, hình thành thể quả và hàm lượng cordycepin của nấm C. militaris trên nhộng tằm là 25oC. Ngoài ra, loại ánh sáng từ đèn compact (công suất 20W, tương đương 350 lx) và thời gian chiếu sáng (12 giờ sáng: 12 giờ tối) cho hiệu suất hình thành thể quả (số lượng và kích cỡ) và hàm lượng cordycepin cao hơn so với ánh sáng từ nguồn đèn LED màu xanh dương, màu đỏ (750 bóng, mỗi bóng có công suất 0,05W, 716 lx). Hàm lượng cordycepin trong thể quả từ loại ánh sáng của đèn compact là 4.54 mg/g.

1. Đặt vấn đề

Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris có hình thức sống ký sinh trên cơ thể côn trùng và sâu bọ [1]. Cordyceps militaris là một trong những loài hiện đang thu hút mối quan tâm của nhiều nhà khoa học, vì khả năng nuôi cấy dễ dàng hơn trong điều kiện in vitro so với nấm C. sinensis [2]. Giá thể nhân tạo và giá thể tự nhiên là hai loại môi trường chính mà nấm C.militaris có thể sinh trưởng tạo thể quả. Một số loại giá thể nhân tạo thường được áp dụng trong nuôi cấy nấm C. militaris gồm: môi trường SDAY có bổ sung bột nhộng hoặc tằm, môi trường gạo lứt có bổ sung thêm môi trường SDAY hoặc bột nhộng/tằm… Giá thể tự nhiên chính là cơ thể tằm dâu hoặc nhộng [3]. Khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm C. militaris và hàm lượng cordycepin trên giá thể nhộng tằm phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố trong đó có thể kể đến như: nhiệt độ nuôi cấy, loại, cường độ và thời gian chiếu sáng, độ ẩm và trạng thái sinh lý của nhộng, tằm. Để đảm bảo sản phẩm tạo ra có hàm lượng hoạt chất cao, cần xác định được nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm trên giá thể tự nhiên [3]. Hiện nay, tại Việt Nam có rất ít các nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sự sinh trưởng, phát triển và hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học được tổng hợp bởi nấm C. militaris. Vì vậy, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sự sinh trưởng, phát triển và hình thành hoạt chất của nấm C. militaris nghiên cứu trên nhộng tằm nhằm xác định điều kiện tối ưu cho qui trình nuôi cấy C. militaris.

2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chủng nấm sử dụng là chủng Cordyceps militaris NBRC 100741 được mua vào tháng 4/2015, tại Trung Tâm Nguồn Sinh Học Quốc Gia (NBRC), Nhật Bản. Nhộng và tằm dâu được thu mua tại hộ gia đình có truyền thống nuôi tằm dâu. Nhộng được thu mua cả kén để đảm bảo tránh nhiễm vi sinh vật thêm trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu này gồm: tủ ấm lắc (Jeio Tech – SI300), buổng cấy vi sinh (Telstar), máy đo pH (Schott Instrument Lab 850), nồi hấp (Sturdy SA300VF), phòng nuôi cấy có trang bị điều hoà nhiệt độ, que cấy, kim tiêm vô trùng (đường kính kim Φ = 1,2 mm), bơm tiêm dùng một lần (dung tích 5 mL), dàn để mẫu có hệ thống chiếu sáng bằng đèn compact (công suất 1 bóng: 20W) và dàn để mẫu được chiếu sáng bằng đèn LED (gồm có hai màu: xanh dương và đỏ. Tỉ lệ giữa hai màu tương ứng lần lượt là: 1 xanh dương: 2 đỏ).

2.1. Chuẩn bị giống Cordyceps militaris NBRC 100741

5 ml giống nghiên cứu được cấy vào 150 ml môi trường SDAY lỏng (40 g/L glucose, 10 g/L pepton, 10g/L cao nấm men pH = 7,0) trong box cấy vô trùng. Bình nuôi cấy sau đó được chuyển sang máy lắc (Jeio Tech – SI300) và lắc ở tốc độ 150 rpm trong điều kiện nhiệt độ môi trường 25°C. Thời gian nuôi giống là 4 – 5 ngày.

2.2. Nuôi cấy C. militaris trên giá thể tự nhiên nhộng tằm

Giá thể tự nhiên được sử dụng trong nghiên cứu này là tằm/nhộng tằm sống. Giống Cordyceps militaris NBRC 100741 được tiêm vào phần đầu của nhộng trong điều kiện vô trùng. Thể tích giống tiêm cho một cơ thể nhộng sống là 0,1 ml. Các bước chuẩn bị và nuôi cấy C. militaris được tiến hành như sau:
– Chuẩn bị giá thể nhộng tằm: Tiến hành cắt kén tằm trong box cấy vô trùng thu lấy nhộng.
– Lây nhiễm nấm C. militaris vào giá thể nhộng tằm: Tiêm 0,1 ml (2.105 CFU bào tử/mL) giống nấm C. militaris vào phần đầu nhộng tằm. Sau khi tiêm, nhộng được trải rộng ra trên một miếng giấy ẩm (vô trùng) và được đặt trong lọ thủy tinh trong suốt có nắp đậy.
– Ủ tối tạo hệ sợi nấm C. militaris trên giá thể nhộng tằm: Nhộng tằm sau khi được lây nhiễm thì được bảo quản trong bóng tối ở nhiệt độ 23 – 250C, độ ẩm 80 – 90%. Khoảng 4 – 5 ngày sau khi tiêm giống nấm, hệ sợi nấm dần dần bao kín giá thể nhộng tằm.

2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris

Tiến hành nuôi cấy tạo thể quả nấm C. militaris vào các cá thể nhộng tằm, sau đó chuyển các cá thể này sang các nhiệt độ khác nhau: 7°C; 15°C; 20°C; 25°C; 30°C, mỗi nhiệt độ được dao động trong khoảng ± 1oC, đồng thời cần đảm bảo các điều kiện về độ ẩm, ánh sáng. Mỗi dải nhiệt độ, bố trí 30 cá thể nhộng/tằm, lặp lại thí nghiệm 3 lần. Theo dõi kết quả trong vòng 2 tháng.
Các chỉ tiêu theo dõi, đánh giá:
+ Thời gian hình thành mầm thể quả sau khi ra sáng (ngày)
+ Số lượng thể quả/con
+ Khối lượng thể quả/con (g)
+ Kích thước thể quả (mm)
+ Hình dạng thể quả
+ Màu sắc thể quả

2.4. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành thể quả của nấm Cordyceps militaris

Sau khi tiêm Cordyceps militaris NBRC 100741 vào phần đầu của nhộng, nhộng được đặt trong điều kiện không được chiếu sáng, nhiệt độ 25°C và độ ẩm 80 – 90%. Sau 14 ngày, nhộng được chuyển ra điều kiện chiếu sáng với loại ánh sáng khác nhau. Thời gian chiếu sáng là 12 giờ sáng: 12 giờ tối. Có hai lô thí nghiệm với hai loại ánh sáng khác nhau:
Lô 1 – được chiếu sáng bằng đèn compact có công suất 20W, tương đương với 350 lx.
Lô 2 – được chiếu sáng bằng đèn LED màu gồm 750 bóng nhỏ (gồm bóng cho ánh sáng xanh dương và bóng cho ánh sáng đỏ với tỉ lệ 1:2) mỗi bóng có công suất 0,05W tương đương với 716 lx.
Mỗi lô thí nghiệm gồm 30 cá thể nhộng. Sau 60 ngày nuôi cấy, chúng tôi xác định số lượng và kích thước thể quả phát triển trên giá thể nhộng.
Các chỉ tiêu theo dõi, đánh giá:
+ Thời gian hình thành mầm thể quả sau khi ra sáng (ngày)
+ Số lượng thể quả/con
+ Khối lượng thể quả/con (g)
+ Kích thước thể quả (mm)
+ Hình dạng thể quả
+ Màu sắc thể quả

2.5. Định lượng cordycepin

Theo phương pháp được mô tả trước đây với một số thay đổi nhỏ cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [3]. Mẫu chuẩn: cordycepin (C3394, Sigma, Singapore) được hòa tan trong nước cất và pha loãng thành các nồng độ khác nhau bao gồm 5, 10, 12.5, 25, 50, và 100 μg /mL để lập đường chuẩn. Mẫu nghiên cứu (thể quả) được làm khô 1h tại 85oC, sau đó nghiền thành bột. Hòa 1 g bột khô vào 20 mL nước cất và siêu âm 1h tại 50oC. Đem ly tâm tại 4000 rpm trong vòng 15 phút tại 4oC. Lấy dịch nổi, lọc qua màng lọc 0.45 μm và được dùng để tiêm vào hệ thống HPLC. Nồng độ cordycepin được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 infinity. Cột phân tích: Cột RP C18 Elipse plus C18 (4.6 x 250 mm, kích thước hạt 5 μm ). Nhiệt độ cột duy trì ở 25°C. Pha động gồm nước cất và methanol (tiêu chuẩn HPLC) với tỷ lệ 87:13 (v/v). Tốc độ dòng: 1ml/phút. Detector UV-VIS, bước sóng 260 nm. Thể tích tiêm 10 μL.

2.6. Phương pháp xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lí trên phần mềm Iristat 4.0. Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. So sánh được sử dụng theo phương pháp tstudent.

3. Kết quả

3.1. Kết quả phân tích hàm lượng cordycepin thể quả nấm Cordyceps militaris

Khảo sát về tính thích hợp của hệ thống HPLC tại phòng thí nghiệm
● Độ chọn lọc – đặc hiệu
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn cordycepin có nồng độ 10 µg/mL, mẫu trắng và mẫu thử. Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của cordycepin (14.60 phút) không xuất hiện pic như ở mẫu chuẩn. Các pic của chất phân tích trong mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ đặc hiệu cao.
● Độ tuyến tính
Pha một dãy dung dịch chuẩn cordycepin có nồng độ khoảng 5 – 100 µg/ml, và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn (Bảng 1).

Bảng 1. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của cordycepin

Nồng độ (µg/mL) 5                10         12,5         25           50 100
Diện tích pic (mAU*s)

 

 

134.2      270.8      334.2     667.5     1341.2

 

Phương trình hồi quy: y = 26.368 + 7.6287 R2=0.9999

2637.4

Hình 1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của cordycepin.

Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ cordycepin trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ~ 1, đáp ứng yêu cầu của đường chuẩn trong phân tích định lượng.
● Độ đúng
Xác định độ đúng dựa vào phân tích mẫu kiểm soát ở các nồng độ khác nhau trong đường chuẩn: 5,0 µg/ml, 50,0 µg/ml, 100 µg/ml. Chuẩn bị 3 dãy mẫu kiểm soát. Xác định độ đúng là tỷ lệ % giữa nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn so với nồng độ thực tế (Bảng 2).
Kết quả cho thấy: ở điều kiện trong ngày và khác ngày, độ đúng của phương pháp đều đạt > 98.6%. Độ lặp lại trong ngày và khác ngày của phương pháp được xác định với hệ số RSD nhỏ.
● Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của cordycepin. Tiến hành pha thử 4 – 5 nồng độ quanh điểm dự kiến. Kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của cordycepin là 0,1 µg/ml; giới hạn định lượng dưới của cordycepin là 0,4 µg/ml.

Bảng 2. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng cordycepin

Nồng độ biểu kiến (µg/ml) TRONG NGÀY (n=3) KHÁC NGÀY (n=3)
Nồng độ ngoại suy (µg/ml) Độ đúng (%) RSD (%) Nồng độ ngoại suy (µg/ml) Độ đúng (%) RSD (%)
5 5.02 ± 0.03 102.0 2.94 4.98 ± 0.015 98.6 1.53
50 50.01± 0.13 100.02 0.32 49.89 ± 0.76 99.22 1.95
100 99.66 ± 0.62 99.66 0.62 99.32 ± 1.12 98.32 1.15

Hình 2. Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn cordycepin.

Hình 3. Sắc ký đồ HPLC của mẫu thử.

3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển và hình thành thể quả của nấm Cordyceps militaris trên nhộng tằm

Sau 2 tháng tiến hành thí nghiệm, kết quả thể hiện trong bảng 3 và hình 4.
Dựa vào kết quả ở bảng 3 và hình 4, kết hợp với theo dõi quá trình hình thành thể quả, nhận thấy: ở 7oC và 15oC nhiệt độ quá thấp, hệ sợi nấm chuyển màu từ trắng sang vàng cam nhưng không hình thành mầm thể quả. Ở 30oC, sau 2 – 3 ngày ra sáng, hệ sợi nấm màu tráng chuyển sang màu cam nhạt. Tuy nhiên, do nhiệt độ cao không thích hợp cho hệ sợi nấm sinh trưởng và phát triển, hệ sợi nấm bị chết, không hình thành mầm thể quả. Nhiệt độ môi phòng nuôi 20oC, 25oC thích hợp cho hệ sợi nấm sinh trưởng, phát triển và hình thành thể quả, sau 2 – 3 ngày ra sáng, hệ sợi nấm chuyển màu, thời gian hình thành mầm thể quả ở 25oC nhanh hơn ở 20oC. Kích thước, khối lượng trung bình thể quả của nấm C. militaris khi nuôi ở nhiệt độ 250C cũng lớn hơn khi nuôi ở 20oC.

Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps militaris trên nhộng tằm

7            15          20 25                                       30
Thời gian hình thành mầm thể quả sau khi ra sáng (ngày) –             –             8 – 10 6 – 8                                   –
Số lượng thể quả/con –             –             4,63±0,25 4,75±0,10                         –
Khối lượng thể quả/con (g) –             –             1,4±0,03 1,72±0,04                         –
Kích thước thể quả (mm) –             –              26,48±0,04×2±0,02 27,56±0,03×2±0,02        –
Hình dạng thể quả –                            – Hình trụ đôi khi phân nhánh Hình trụ đôi khi phân         – nhánh
Màu sắc thể quả –             –             Vàng sậm Vàng sậm                         –

Hình 4. Thể quả nấm C. militaris trên nhộng tằm ở các dải nhiệt độ khác nhau.

Kết quả phân tích hàm lượng cordycepin trong thể quả nấm Cordyceps militaris
Phân tích hàm lượng cordycepin của thể quả mẫu nấm C. militaris nuôi cấy tạo thể quả ở 20oC và 25oC. Kết quả được trình bày ở bảng 4 cho thấy tại 25oC thì thể quả cho hàm lượng cordycepin cao hơn, và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tại nhiệt độ 20oC

Bảng 4. Kết quả phân tích hàm lượng cordycepin

20oC 25oC
Hàm lượng Cordycepin 1,13 ± 0,17 mg/g 4,79 ± 0,26 mg/g*

*: khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

3.3. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành thể quả của nấm Cordyceps militaris trên nhộng tằm

Sau khi nuôi cấy nhộng trong điều kiện không được chiếu sáng (4-5 ngày), hệ sợi của nấm C. militaris đã phát triển tốt trên giá thể này (hình 5).
Số lượng, kích thước trung bình và các chỉ tiêu theo dõi của thể quả của nấm C. militaris ở hai lô thí nghiệm được trình bày trên bảng 5 và hình 6.

Hình 5. Hệ sợi của nấm C. militaris phát triển trên giá thể nhộng trong điều kiện không được chiếu sáng.

Bảng 5. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn compact và ánh sáng đèn led trắng lên sự hình thành thể quả của nấm C. militaris trên nhộng tằm

Các chỉ tiêu theo dõi Ánh sáng đèn compact Ánh sáng đèn led trắng
Thời gian hình thành mầm thể quả 6 – 8 6 – 8
Số lượng thể quả/lọ 4,70 ± 0,02 3,82 ± 0,27
Khối lượng thể quả/lọ 1,74 ± 0,18 1,35 ± 0,60
Kích thước thể quả (dài x rộng) (26,87 ± 0,23) x (2 ± 0,02) (21,46 ± 0,54) x (2 ± 0,03)
Hình dạng thể quả Hình trụ, đôi khi phân nhánh Hình trụ, đôi khi phân nhánh
Màu sắc thể quả Vàng sậm Vàng nhạt

Hình 6. Thể quả nấm C. militaris trên nhộng tằm dâu khi nuôi trồng trong điều kiện ánh sáng đèn compact và ánh sáng đèn led trắng.

Theo kết quả thu được trên bảng 5 và hình 6, lô thí nghiệm gồm các bình được chiếu sáng bằng đèn compact cho kết quả tốt hơn so với lô còn lại được chiếu sáng bằng đèn led trắng cả về hiệu suất, kích thước và khối lượng thể quả.
Sự khác biệt về kích thước thể quả trong hai điều kiện chiếu sáng khác nhau được trình bày trên hình 7.

4. Phân tích hàm lượng cordycepin của thể quả mẫu nấm C. militaris

Tiến hành phân tích hàm lượng cordycepin của thể quả mẫu nấm C. militaris nuôi cấy tạo thể quả của lô 1 và lô 2. Kết quả được trình bày ở bảng 6. Kết quả cho thấy lô 1 thì thể quả cho hàm lượng cordycepin cao hơn, và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2.
Bảng 6. Kết quả phân tích hàm lượng cordycepin

Lô 1 (Ánh sáng đèn compact) Lô 2 (Ánh sáng đèn LED)
Hàm lượng cordycepin 4,54 ± 0,21 mg/g* 0,98 ± 0,13 mg/g

* khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi xác định được loại ánh sáng thích hợp cho sinh trưởng của nấm C. militaris là ánh sáng từ đèn compact.

5. Bàn luận

C. militaris từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở châu Á nhờ có các tác dụng sinh học đa dạng như chống ung thư, tăng cường và điều hòa hệ miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn… do sự có mặt của các hoạt chất như cordycepin. Thể quả của C.militaris trong tự nhiên rất đắt, vì đặc điểm vật chủ của nấm C. militaris rất đặc hiệu và hiếm gặp trong tự nhiên. Nấm C. militaris phát triển rất chậm trong tự nhiên, sự tăng trưởng có giới hạn và kích thước nhỏ. Rất khó để thu được một số lượng để có thể dùng làm thuốc hay thực phẩm chức năng. Nhộng tằm đã được sử dụng làm vật chủ cho nuôi cấy nấm C. militaris trong một số nghiên cứu [4]. Phương pháp tiêm cấy vào nhộng tằm cho thấy hiệu quả cao hơn các phương pháp khác như phun sấy hay nhúng [5]. Do đó, chúng tôi sử dụng phương pháp tiêm trong nghiên cứu của mình. Nhộng tằm khi bị tiêm cấy giống C.militaris chết trong vòng 2 ~ 3 ngày, trở nên cứng trong khoảng 7 ngày sau tiêm, và sau đó sản sinh thể quả. Thể quả trong tự nhiên của C. militaris có màu cam, hình trụ và dao động 2,5-4,5 cm chiều dài [6]. Kết quả của chúng tôi cho thấy thể quả cũng có các đặc điểm tương tự, cho thấy rằng nhộng tằm cũng có khả năng sản sinh ra thể quả của nấm
C.militaris tương tự trong tự nhiên.

Đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhằm tối ưu điều kiện nuôi cấy để cho nấm C. militaris. Hung và cs. đã đánh giá yếu tố nhiệt độ đến hàm lượng cordycepin của nấm C. militaris nuôi cấy trong các bình Erlenmeyer. Nhóm tác giả này cho thấy nhiệt độ 20oC – 25oC là nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của nấm C. militaris và cho hàm lượng cordycepin cao nhất trên sợi nấm và thể quả [7]. Nhiệt độ 30oC ức chế sự sinh trưởng của nấm, do đó ngăn cản quá trình sinh tổng hợp cordycepin. Kết quả của chúng tôi cũng tương tự của nhóm tác giả này, cho thấy nhiệt độ 25oC là nhiệt độ tối ưu cho nuôi cấy nấm C. militaris.

Hình 7. Kích thước thể quả của nấm C. militaris NBRC 100741 trên giá thể nhộng trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau. Lô1 – điều kiện chiếu sáng bằng đèn compact; Lô2 – điều kiện chiếu sáng bằng đèn LED  (gồm tỉ lệ màu: xanh dương: đỏ là 1:2).

Một số nghiên cứu khác đã được tiến hành nhằm xác định ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng của nấm C. militaris trên giá thể tự nhiên và nhân tạo [8-11]. Kết quả của các nghiên cứu này cho thấy rằng ánh sáng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của nấm C. militaris đồng thời cũng có ảnh hưởng đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học có trong thể quả của nấm C. militaris. Theo Dong và cs, ánh sáng có màu hồng (gồm 1/3 ánh sáng có bước sóng 450 – 460 nm và 2/3 ánh sáng có bước sóng 650 – 660 nm) cho thể quả có kích thước lớn hơn và hàm lượng cordycepin nhiều hơn so với ánh sáng xanh dương (xanh blue) hoặc ánh sáng đỏ [9].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả của Dong và cs [9]. Đèn compact tạo ra ánh sáng trắng có bước sóng kết hợp giữa bước sóng của tia tử ngoại (400 – 450 nm) và ánh sáng nhìn thấy được (600 – 700 nm), do đó cho kết quả sinh trưởng, phát triển và hình thành thể quả của nấm C. militaris cao hơn so với ánh sáng từ đèn LED phối hợp hai loại ánh sáng màu xanh dương và ánh sáng màu đỏ với tỉ lệ tương ứng là 1:2.

6. Kết luận

Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu và tạo thể quả trên nhộng tằm tốt nhất ở 24-26oC, ở nhiệt độ này cho kết quả hình thành thể quả tốt nhất và hàm lượng cordycepin trong thể quả là cao nhất so với các dải nhiệt độ khác. Trong nuôi cấy C. militaris nếu sử dụng ánh sáng từ đèn compact thì thu được kết quả sinh trưởng tốt hơn so với khi sử dụng ánh sáng từ đèn LED có pha trộn giữa hai loại ánh sáng màu xanh dương và ánh sáng màu đỏ với tỉ lệ tương ứng là 1:2 do thu được số lượng và kích thước thể quả cao hơn, cũng như hàm lượng cordycepin cao hơn.
Lời cảm ơn
Đề tài được tài trợ bởi Chương trình Khoa học và Công nghệ phục vụ phát triển bền vững vùng Tây Bắc, ĐHQGHN, mã số đề tài: KHCN-TB.03C/13-18.
Tài liệu tham khảo
[1] Kobayashi Y. The genus Cordyceps and its allies. Sci Rep Tokyo Bunrika Daigaku Sect B 5((1941) 53.
[2] Sung J-M, Choi Y-S, Lee H-K, Kim S-H, Kim Y-O, Sung G-H. Production of fruiting body using cultures of entomopathogenic fungal species. The Korean Journal of Mycology 27(1) (1999) 15.
[3] Mao X-B, Eksriwong T, Chauvatcharin S, Zhong J-J. Optimization of carbon source and carbon/nitrogen ratio for cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris. Process Biochemistry 40(5) (2005) 1667.
[4] Hong I-P, Kang P-D, Kim K-Y, Nam S-H, Lee M-Y, Choi Y-S, et al. Fruit body formation on silkworm by Cordyceps militaris.
Mycobiology 38(2) (2010) 128.
[5] Chen R, Ichida M. Infection of the silkworm, Bombyx mori, with Cordyceps militaris. Journal of Insect Biotechnology and
Sericology 71(1) (2002) 61.
[6] Sung J. The insects-born fungus of Korea in color. (1996).
[7] Hung L, Keawsompong S, Hanh V, Sivichai S, Hywel-Jones N. Effect of temperature on cordycepin production in Cordyceps militaris. Thai J Agric Sci 42(2) (2009) 219.
[8] Yi ZL, Huang WF, Ren Y, Onac E, Zhou GF, Peng S, et al. LED lights increase bioactive substance at low energy cost in culturing fruiting bodies of Cordyceps militaris. Scientia Horticulturae 175((2014) 139.
[9] Dong JZ, Lei C, Zheng XJ, Al XR, Wang Y, Wang Q. Light wavelengths regulate growth and active components of Cordyceps militaris fruit bodies. J Food Biochem 37((2013) 578.
[10] Chen YS, Liu BL, Chang YN. Effects of light and heavy metals on Cordyceps
militaris fruiting body growth in rice grainbased cultivation. Korean J Chem Eng 28(3) (2011) 875.
[11] Dong JZ, Liu MR, Lei C, Zheng XJ, Wang Y. Effects of selenium and light wavelengths on liquid culture of Cordyceps militaris Link. Applied biochemistry and biotechnology 166(8) (2012) 2030.

Nguồn tham khảo: Phạm Thị Lan, Đỗ Hải Lan, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Bạc Thị Thu, Phạm Văn NhãNghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sinh trưởng, phát triển và hàm lượng hoạt chất cordycepin của nấm Cordyceps militaris NBRC 100741 trên nhộng tằm .Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *