NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ

 Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới.

Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, … lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati).
Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc.

Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007. Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến – Anoectochilus setaceus Blume được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này.

Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”.

 I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc.

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)
Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.)
Họ: Phong lan (Orchidaceae)
Bộ: Phong lan (Orchidales)

Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 – 4 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4 x 2 – 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt. Cuống lá dài 2 – 3 cm. Cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 – 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn. Bầu dài 13mm, có lông thưa.

Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm. Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 – 1600m. Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng.

Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)….Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,…

Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan Kim tuyến (A. setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.

Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363). Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học. Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt. Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn…

1.1.1. Đặc điểm hình thái

Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất.

a. Thân rễ

Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông.

b. Thân khí sinh

Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt.

c. Rễ

Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 – 10, trung bình là 5,4. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 – 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm.

d. Lá

Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 – 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 – 4 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6 – 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6, thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.

e. Hoa, quả

Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 – 20 cm ở ngọn thân, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 – 12. Mùa quả chín tháng 12 – 3 năm sau.

Hình 2.1. Cây (A) và hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume

1.1.2. Đặc điểm phân bố

1.1.2.1. Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ. Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới.

– Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v. Chiều cao của tầng A2 từ 15-25 m.

– Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v. Chiều cao của tầng A3 từ 815m.

– Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v…

– Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v…

– Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền (Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae). Điển hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v…

– Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình khoảng 20 cây/ha. Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu.

1.1.2.2. Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh

– Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia. Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90%. Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ.

– Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng.

1.1.2.3. Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao

– Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như chân núi, sườn núi, đỉnh núi.
– Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình.

1.2. Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus)

1.2.1. Nhân giống bằng hạt

Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa.

Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây.
Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt.

1.2.2. Nhân giống bằng cây con

Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất.

1.2.3. Phương pháp giâm cây

Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới.

Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a].

1.2.4. Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình,
1997)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống.
Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo.

Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ.
Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus.
Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen.

1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974).
Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại.

1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do:

Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)…

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như:

– Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987).

– Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.

– Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952). Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975).

– Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải mất 1015 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970).

– Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục.
– Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội.
– Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen.
Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số nhược điểm như:
– Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật.
– Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề.
– Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy từ callus).
Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật.

1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau:
– Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách.
– Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.

• Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên.

• Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo.

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy

1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu.

Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy.

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm.

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy.

1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:

Các nguyên tố khoáng

Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.

• Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…

• Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,…

Chất hữu cơ bổ sung

• Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy.
• Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết.
Nguồn cacbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose.
Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước).

Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường.
Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).

Chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.

• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983).

Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo.

Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. NAA.

• Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo.

Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S.C. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990).

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).

Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích thích tạo củ của hoa Lili (Nhut et al, 2001), tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê Thị Kim Đào, 2001)…

Các chất hữu cơ bổ sung

Ngoài các thành phần dinh dưỡng bắt buộc kể trên trong môi trường nuôi cấy mô tế bà thực vật in vitro, người ta còn bổ sung thêm một số thành phần hỗn hợp tự nhiên khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, nước ép cà chua, khoai tây, chuối… Các thành phần này thường chứa nguồn dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng đa dạng như amino acid, đường, vitamin, nucleic acid, auxin, cytokinin.

Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy. Tất cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et al.,(1961) cho thấy trong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Inositol, auxin, cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20 %.

Tác nhân làm đặc môi trường

Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở dạng lỏng hoặc đặc, nhiều loại môi trường nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải sinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử dụng phổ biến nhất. Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose có thể cũng được sử dụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc.

1.3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường,…

  • Ánh sáng

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòa một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây. Tùy từng loại nuôi cấy, yêu cầu cường độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo, thường không cần ánh sáng. Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi cấy thông qua tác động nên trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng cũng như dinh dưỡng khoáng. Thông thường trong phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/ ngày với cường độ 2000 lux.

  • Nhiệt độ

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220C đến 250C. Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh. Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,… pH môi trường pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 – 5,8.

  • Trạng thái môi trường

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng. Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây.

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng.

Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây. Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…

Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở. Vì vậy, khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương. Cần cung cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây.

Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể. Để tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây.

1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô

Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: a) Lấy mẫu và xử lý mẫu
Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…
Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng. Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991).

b) Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính.

c) Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 300C.
Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng 1-2 tháng tùy từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma. Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 – 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu.

d) Tái sinh rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng.

e) Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường.

1.5. Tình hình nghiên cứu cây lan Kim tuyến

1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005).

Chow và CS (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và CS đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và CS, năm 1992, Lee và CS đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu nuôi cấy.

Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA.

Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus Formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA + 2% than hoạt tính.

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được xếp trong nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc gia và Khu Bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen. Ở Việt Nam do bị người dân thu hái tự phát để bán làm thuốc nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố. Do vậy, có thể nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn.

Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến này như:

Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính.

Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành. Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.

Năm 2010,Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim tuyến.”.

Các tác giả trên đã bước đầu tiến hành thăm dò ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và bước đầu tiến hành nhân giống thử nghiệm lan Kim tuyến nhưng chưa tác giả nào đưa ra quy trình hoàn chỉnh để nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến nghiên cứu nhân nhanh và quy trình ra cây hoàn chỉnh cho loài thảo dược quý hiếm này.

 II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên

Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ Vườn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc.

2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

+ Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng công nghệ tế bào Thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
+ Thời gian: từ tháng 11/2011 – 12/2012

2.2. Mục tiêu nghiên cứu

– Xác định điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy thích hợp, tìm ra các môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro.
– Xác định điều kiện ra cây và bước đầu đưa cây ra vườn ươm.

2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

2.3.1. Ý nghĩa khoa học

– Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến.
– Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume.
– Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume).

2.3.2. Ý nghĩa thực tiễn

– Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cho lan Anoectochilus setaceus Blume.
– Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao.

2.4. Nội dung nghiên cứu

2.4.1. Nghiên cứu xác định chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan vào mẫu thích hợp.

2.4.2. Nghiên cứu xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp.
+ Xác định môi trường nền thích hợp.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thành và hệ số nhân.

2.4.3. Nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh.

2.4.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume).

2.5. Phương pháp nghiên cứu

Điều kiện nuôi cấy
– Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210C
– pH của môi trường là: 5,4.
– Nhiệt độ phòng nuôi: 25±20C
– Cường độ ánh sáng: 2000 lux
– Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày đêm

2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

A. Xác định các phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch

Thí nghiệm 1. Xác định chất khử trùng thích hợp

Chồi và mắt đốt ngang thân cây lan Kim tuyến sau thu hái, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được thử nghiệm khử trùng bằng cồn 70o và H2O2 0,01% trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó được rửa sạch lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0.2% than hoạt tính + 0,8% dịch chiết chuối. Thí nghiệm được tiến hành với các công thức khử trùng:
CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s. CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s.
CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s.
CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s).
CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s).
CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s).
CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút.
CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút.
CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút.

Thí nghiệm 2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch

Các cơ quan khác nhau là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân được khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1).
Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm.

Thí nghiệm 3. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro

Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar.
Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu.

B. Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu.

Thí nghiệm 4. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A. setaceus)

Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*). Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là:
Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: Knud* + Nền môi trường
CT2: MS + Nền môi trường
CT3: Knudson C + Nền môi trường

Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các công thức là:
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: ĐC
CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP
CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP
CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP
CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP
CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin
CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin
CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin
CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin

Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: ĐC
CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA
CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA
CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA
CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA
CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA
CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA
CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA
CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA
CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA
CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA

Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường:
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA
CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA
CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA
CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA
CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA
CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA
C. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra rễ. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu.

Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ

CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar
CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar
CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar
CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar
Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ
Các thí nghiệm được tiến hàn trên nền môi trường nghèo dinh dưỡng
CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar
CT2: Nền + 1% than hoạt tính
CT3: Nền + 3% than hoạt tính
CT4: Nền + 5% than hoạt tính
D. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chăm sóc tới khả năng sinh trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro ngoài vườn ươm.
Cây cao 3-4cm, mọc 3-4 lá và có 3-4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm.
* Cách bố trí thí nghiệm:
– Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi chậu trồng 3 cây.
– Định kì theo dõi: 7 ngày/1lần, chúng tôi đo chiều cao cây, đến rễ lá, số nhánh trong mỗi lần đo định kì.
– Số cây theo dõi
– Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm

Thí nghiệm 10. Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro Giá thể:

CT 1: Giá thể 100% dớn
CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa
CT 3: Giá thể 100% xơ dừa
CT 4: Giá thể 100% bột dừa

Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Thí nghiệm được bố trí với thời gian huấn luyện cây khác nhau:
ĐC: 0 ngày CT1: 4 ngày CT2: 8 Ngày
CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày
Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen.

Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%. Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau:
ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày

2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu

Các chỉ tiêu theo dõi

Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và IRRISTART
5.0 trên máy vi tính.

12. Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống của cây con, đặc điểm của cây con

Đặc điểm của cây con (màu sắc lá, hình thái lá và rễ).

13. Thời gian thu thập: cứ 1 tuần quan sát và ghi số liệu 1 lần.

 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro

Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và sạch bệnh. Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết định thành công của toàn bộ quá trình. Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống.
Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa…) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả). Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp.

3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp

Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng… Trong thí nghiệm này hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh. Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 15 ngày thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày)

Công thức thí nghiệm Chất khử trùng Thời gian khử trùng (s) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
CT1 Cồn 70⁰ (A) 10 47,62 52,38
CT2 20 28,57 47,62
CT3 30 14,29 38,10
CT4 NaClO 2% (B) 300 42,86 23,81
CT5 600 57,14 9,52
CT6 900 33,33 19,05
CT7 Cồn 70⁰ (A) +

NaClO 2% (B)

10A + 300B 71,43 38,01
CT8 10A + 600B 90,48 28,57
CT9 10A + 900B 61,90 33,33

Hình 1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày) Qua bảng 3.1 và đồ thị 3.1 ta có nhận xét sau:

  • Với chất khử trùng là cồn 70⁰ :

Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế bào thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, thời gian khử trùng với cồn 70⁰ trong 10s (CT1) cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (47,62%) do thời gian ngắn thành tế bào ít bị phá hủy là nhưng tỷ lệ nhiễm cũng cao (52,38%) do chưa đủ để dung dịch khử trùng giết chết các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 20s (CT2) thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm giảm là 28,57% và 47,62%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 30s (CT3) thì tỷ lệ sống tiếp tục giảm còn 14,29% và 38,1%.

  • Với chất khử trùng là NaClO 2%

NaClO 2% là hóa chất có tính sát khuẩn cao nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm sẽ giảm nhưng nếu thời gian khử trùng lâu thì dung dịch có thể xâm nhập vào bên trong gây độc với mẫu. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng trong thời gian 5 phút (CT4) thì tỷ lệ nhiếm cao (23,81%) do thời gian chưa đủ để diệt các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút (CT5) thì tỷ lệ nhiễm thấp nhất (9,52%), tỷ lệ sống cao (57,14%). Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên tới 15 phút(CT6) dung dịch đã gây độc cho mẫu nên tỷ lệ sống thấp hơn (33,33%), tỷ lệ nhiễm tăng lên. Như vậy, thời gian khử trùng bằng NaClO 2% tốt nhất là trong 10 phút, cho tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Khử trùng bằng phương pháp kết hợp giữa cồn 70⁰ và NaClO 2%

Khi kết hợp cả hai chất khử trùng trên với thời gian khử trùng thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm của từng chất nên cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ nhiễm giảm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, phương pháp khử trùng là ngâm cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (CT8) cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 90,48% và tỷ lệ nhiễm thấp (28,57%).

Như vậy, thời gian khử trùng mẫu có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Công thức khử trùng CT8 (ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu tái sinh.

3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro

Mục tiêu đặt ra của quy trình khử trùng cho bất kỳ loài cây nào đều là tạo được tỷ lệ mẫu sạch cao đồng thời có khả năng tái sinh mạnh. Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng này là bản chất vật liệu làm mẫu cấy. Mẫu cấy tiếp xúc với nước, đất như rễ thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu. Mẫu mọng nước, có lông thường khó khử trùng hơn những mẫu không mọng nước, bề mặt nhẵn.
Trong nghiên cứu này các vật liệu được khử trùng được khử trùng theo công thức khử trùng tốt nhất suy ra từ kết quả nghiên cứu phần 3.1.1

3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch
Qua kết quả thí nghiệm 1 cho thấy, điều kiện khử trùng hiệu quả nhất đối với loài Lan Kim tuyến là: Ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. Do đó, để xác định cơ quan vào mẫu phù hợp nhất thí nghiệm tiếp tục áp dụng điều kiện khử trùng trên với các vật liệu khác nhau của cây lan Kim tuyến là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân. Kết quả thu được sau 15 ngày được thể hiện ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch (Kết quả thu được sau 15 ngày)

Cơ quan vào mẫu Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%)
Chồi đỉnh

Chồi nách

Mắt đốt ngang thân

66,67

50,00

72,22

33,33

27,78

16,67

Hình 2. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch (Kết quả thu được sau 15 ngày)
Theo kết quả ở bảng 3.2 và hình 2 cho thấy, khi khử trùng mẫu cấy thì mắt đốt ngang thân là vật liệu cho tỷ lệ sống cao nhất (72,2%) và tỷ lệ nhiễm thấp nhất (16,67%), thứ hai là chồi đỉnh cho tỷ lệ sống là 66,67% và tỷ lệ nhiễm là 33,33%, thấp nhất là chồi nách cho tỷ lệ sống là 50% và tỷ lệ nhiễm là 27,78%. Nguyên nhân của sự khác biệt này là do đặc điểm thân khí sinh của Lan Kim tuyến (Anoecctochilus setaceus) có rất nhiều lông tơ do vậy trên bề mặt có một số lượng lớn các mầm bệnh gây nhiễm mẫu, do đó gặp khó khăn trong công tác khử trùng.

Qua kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này cho thấy, cơ quan vào mẫu thích hợp cho việc tạo mẫu sạch là mắt đốt ngang thân.

3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro
C

ơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi. Ở một số loài, cơ quan vào mẫu có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao nhất nhưng lại cho hệ số nhân chồi thấp nhất. Do đó, để đạt hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Kết quả thí nghiệm thu được thể hiện qua Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro (kết quả theo dõi sau 8 tuần).

Cơ quan vào mẫu Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao TB chồi (cm)
Chồi đỉnh 33,33 2,11 2,58
Chồi nách 50 3,50 2,97
Mắt đốt ngang thân 100 4,56 3,2
CV% 0 3,6 2,7
LSD0,05 0,01 0,25 0,16

Hình 3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi

Phân tích phương sai một nhân tố với 3 lần lặp của tỷ lệ mẫu sạch, hệ số nhân và chiều cao chồi đều được hiệu của trung bình mỗi công thức lớn hơn
LSD0,05 chứng tỏ cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo chồi, hệ số nhân và chiều cao TB chồi ở độ tin cậy 95%.

Qua kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi cấy các vật liệu là chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân vào môi trường nhân nhanh phù hợp, kết quả theo dõi sau 8 tuần cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm. Cơ quan nhân kém nhất là chồi đỉnh với tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt 33,33%, hệ số nhân là 2,11 lần và chiều dài chồi là 2,6 cm. Chồi nách cho tỷ lệ tạo mẫu là 44,44%, hệ số nhân 3,5 lần và chiều dài chồi 2,95 cm.

Như vậy, cơ quan vào mẫu thích hợp nhất để tăng hệ số nhân chồi in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là mắt đốt ngang thân.

3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng. Vừa phải cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa phải biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do đó nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt.

3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến  (A. setaceus)

Những nghiên cứu về nuôi cấy Phong lan in vitro cho thấy có một số môi trường thích hợp để nuôi cấy Phong lan như: MS; môi trường Knudson C cho Cattleya, Cymbidium (Adirti, 1993), môi trường Knudson cải tiến (Knud*), môi trường Hyponex (Lou and Kako,1995; Nakano et al, 2000…), môi trường Vaccin &Went… Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy loài Lan Kim tuyến trên ba loại môi trường cơ bản: MS, Knudson C và Knud*.

Thể chồi 4 tuần tuổi từ môi trường vào mẫu được cấy vào các môi trường khác nhau là MS, Knud*, Knudson có bổ sung thêm 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả sau:

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến

Môi trường Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao TB chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Đặc điểm thể chồi
Knud* 3,67 3,57 4,12 Mập, xanh
MS 2,11 1,33 1,55 Gầy, xanh nhạt
Knudson C 2.06 2,22 2,35 Bé, xanh nhạt
CV% 3,1 2,2 2,4  
LSD0,05 0,16 0,11 0,12  

Hình 4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi

Kết quả phân tích phương sai cho thấy, môi trường nền có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến.
Theo kết quả ở Bảng 3.4 thấy rằng môi trường Knud* cho số lượng chồi (3,67 chồi/mẫu) và số lá (4,12 lá/chồi) nhiều hơn ở môi trường MS (số lượng chồi 2,11 chồi/mẫu và số lá 1,55 lá/chồi) và Knudson (số lượng chồi 2,06 chồi/mẫu và số lá 2,35 lá/chồi). Đồng thời, trong môi trường Knud* thì chiều dài chồi (3,57cm) dài hơn hẳn so với hai môi trường còn lại (MS là 1,33 cm và Knudson là 2,22 cm) và chất lượng chồi cũng tốt hơn chồi mập, xanh. Như vậy, môi trường nền thích hợp nhất cho nuôi cấy mô lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là nuôi trường có nguồn gốc Knud*.

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Chất điều hoà sinh trưởng không những là công cụ hữu ích giúp chúng ta nghiên cứu sâu hơn về sự phát sinh hình thái thực vật mà còn giúp ta chủ động định hướng cho sự phát triển của thực vật trong ống nghiệm. Đặc biệt với mục đích nhân giống tạo số lượng lớn trong thời gian ngắn thì việc sử dụng các loại chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tái sinh lớn nhất là tất yếu.

3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ  số nhân

Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang Thạch, 2007). Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin…

Trong thí nghiệm này, hai loại cytokinin là BAP và Kinetin được dùng với các nồng độ khác nhau là 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l trên môi trường (Knud* + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar). Kết quả thu được ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Cytokinin Nồng độ

(mg/l)

Số chồi (chồi/mẫu) Số đốt (đốt/chồi) Chiều cao TB chồi (cm) Đặc điểm chồi
0 (ĐC) 0 1,22 1,54 2,32 Gầy, xanh nhạt
BAP 0,1

0,5

2,44

3,94

2,16

2,31

3,03

3,16

Yếu, xanh nhạt

Khỏe, xanh đậm

  1,0 5,22 2,93 3,23 Khỏe, xanh đậm
  2,0 4,22 2,37 3,02 Xanh nhạt, có lông tơ
CV%   2,8 2,4 1,6  
LSD0,05   0,17 0,1 0,085  
Kinetin 0,1

0,5

2,33

4,22

1,98

2,45

2,45

3,05

Yếu, xanh nhạt

Khỏe, xanh đậm

  1,0 4,89 2,68 3,23 Khỏe, xanh đậm
  2,0 3,22 2,02 3,08 Xanh nhạt
CV%   2,6 2,7 1,6  
LSD0,05   0,15 0,1 0,081  

Hình 5. Ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

  • Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.

Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (5,22 chồi/mẫu và 2,93 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ BAP khác thì thấp hơn, số lượng chồi khi sử dụng nồng độ 0,1 mg/l BAP là 2,44 chồi/mẫu, ở nồng độ 0,5 mg/l BAP là 3,94 chồi/mẫu, ở nồng độ 2,0 mg/l là 4,22 chồi/mẫu và đối chứng là 1,22 chồi/mẫu, số đốt khi sử dụng các nồng độ 0,1; 0,5; 2,0 mg/l BAP lần lượt là 2,16; 2,33; 2,35 đốt/chồi và đối chứng là 1,54 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng cho chất lượng chồi tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì do nồng độ quá cao và quá thấp nên chồi nhỏ và yếu, xanh nhạt.
Như vậy, việc bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.

  • Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và cả chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.
Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin cũng cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (4,91 chồi/mẫu và 2,68 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ Kinetin khác thì thấp hơn, số lượng chồi dao động từ 2,33 – 4,22 chồi/mẫu, số đốt dao động từ 1,98 – 2,45 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì chồi nhỏ, xanh nhạt.
Như vậy, bổ sung Kinetin cũng ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.

3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái  và hệ số nhân lan Kim tuyến (A. setaceus)

Tác dụng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào là khả năng phát sinh rễ đã được kiểm chứng từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vai trò của IBA và αNAA tác động đến quá trình phát sinh rễ trên nhiều đối tượng nghiên cứu như cây lát hoa Côn Đảo, tram Úc… (Trần Văn Minh và Cộng sự, 2003; Nguyễn Văn Nghi và Cộng sự, 2003).
Để kiểm tra ảnh hưởng của auxin (IBA và NAA) tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân, thí nghiệm này được tiến hành trên môi trường Knud* và bổ sung riêng rẽ IBA và αNAA với các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0mg/l + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 7g/l agar. Kết quả thu được ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của auxin (IBA và αNAA) tới sự phát sinh hình thái lan Kim tuyến

Auxin

(mg/l)

Chiều dài chồi

(cm)

Số chồi (chồi/mẫu) Số đốt (đốt/chồi) Chiều dài TB rễ (cm) Số rễ (rễ/chồi) Đặc điểm chồi
      0 (ĐC) 3,33 1,33 2,13 0,92 2,04 Xanh nhạt, lá bé
IBA 0,5 3,12 3,28 2,31 1,12 1,43 Xanh nhạt, có lông tơ
1,0 3,22 3,36 2,52 0,88 1,10 Xanh đậm, lá bé
1,5 3,55 4,87 2,66 0,98 0,96 Xanh đậm, lá to
2,0 3,23 2,28 2,39 1,05 0,83 Xanh nhạt, lá bé
3,0 2,12 2,33 2,58 1,17 0,71 Xanh nhạt, lá bé
CV% 2,2 4,1 3,7 3,3 3,5  
LSD0,05 0,13 0,095 0,16 0,059 0,13  
αNAA 0,5 3,23 3,06 2,54 1,57 1,68 Bé, xanh nhạt
1,0 3,41 4,56 2,87 1,33 2,20 Xanh đậm, Lá to
1,5 3,33 3,78 2,30 0,83 1,42 Bé, xanh nhạt
2,0 3,37 3,11 1,97 1,32 1,32 Bé, xanh nhạt
3,0 3,67 2,67 1,79 1,12 1,21 Bé, xanh nhạt
CV% 1 2,9 4 2,4 2,1  
LSD0,05 0,6 0,14 0,16 0,051 0,13  

Hình 6. Ảnh hưởng của auxin (IBA và αNAA) tới sự phát sinh hình thái lan Kim tuyến

Sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường có bổ sung auxin IBA và αNAA với các dải nồng độ từ 0,5-3,0 mg/l thu được kết quả trong Bảng 3.6. Kết quả cho thấy, IBA và αNAA có hiệu quả sản sinh rễ bất định, αNAA có hiệu quả sản sinh rễ lớn hơn IBA nhưng hiệu quả sản sinh rễ không rõ ràng ở cả 2 loại phytohormon trên. Số lượng rễ và chiều dài rễ không khác biệt nhiều giữa các công thức. Trái lại, hai loại auxin này lại có hiệu quả rõ rệt trong việc sản sinh chồi bất định và đạt kết quả lớn và khác biệt hẳn giữa các công thức. Cụ thể là IBA ở nồng độ (1,5mg/l) cho 4,87 chồi/mẫu và αNAA (1,0mg/l) cho 4,55 chồi/mẫu. Lá cây có màu xanh đậm nhưng kích thước lá nhỏ hơn so với cytokinin. Trong rất nhiều các thí nghiệm và tài liệu nghiên cứu, các loại auxin như IBA, αNAA, 2,4 D, IAA được sử dụng để sản sinh rễ cho hầu hết các loại cây nhưng trong thí nghiệm này, đối với cây lan Kim tuyến (A. setaceus) IBA và αNAA không có hiệu quả sản sinh rễ bất định.

3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự  phát sinh hình thái và hệ số nhân

Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự ra rễ, trái lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hóa chồi, ở tỷ lệ trung bình thì hình thành mô sẹo. Để nghiên cứu nhân nhanh nhằm thu được các chồi có chất lượng tốt cho các giai đoạn tiếp theo, chúng tôi tiến phối hợp giữa BAP, Kinetin và αNAA, IBA với các nồng độ khác nhau kết thu được từ thí nghiệm trên, BAP và kinetin khi sử dụng phối hợp theo tỷ lệ 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l kinetin cho hiệu quả nhân nhanh tốt. Do đó, thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường trên phối hợp với IBA và α-NAA với các dải nồng độ từ 0,1 – 0,5 mg/l + 20g/l Sucrose + 20g/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Công thức (mg/l) Số chồi (chồi/mẫu) Số đốt (đốt/chồi) Chiều cao

TB chồi

(cm)

Đặc điểm chồi
 CT1 (0,1mg/l IBA) 3,33 2,45 3,12 Chồi xanh nhạt, lá bé
 CT2 (0,3mg/l IBA) 3,73 2,53 3,22 Chồi xanh đậm, lá bé
CT3 (0,5mg/l IBA) 4,85 2,49 3,52 Chồi xanh đậm, lá bé
CT4 (0,1mg/l α-NAA) 4,32 2,25 3,00 Chồi xanh nhạt, lá to
CT5 (0,3mg/l α-NAA) 6,56 2,77 3,52 Chồi xanh đậm, lá to
CT6 (0,5mg/l α-NAA) 5,45 2,31 3,02 Chồi xanh nhạt, lá to
CV% 2,8 1,8 2,9  
LSD0,05 0,29 0,091 0,19  

Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy, môi trường chứa các tổ hợp khác nhau của BAP và Kinetin có ảnh hưởng rõ rệt tới số chồi nhưng lại không ảnh hưởng nhiều đến chiều cao chồi. Sự phối hợp của hai nhóm cytokinin (BAP, Kinetin) và auxin có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh hình thái chồi và hệ số nhân.

Theo kết quả ở Bảng 3.6: Mẫu cấy trên môi trường chứa tổ hợp 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3mg/l α-NAA cho số chồi cao nhất đạt (6,56 chồi/mẫu) nhiều hơn so với môi trường chứa tổ hợp 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA (4,85 chồi/mẫu) nhưng số đốt và chiều cao chồi thì lại thấp hơn. Sự phối hợp giữa cytokinin và auxin cho số chồi, số đốt và chiều cao chồi cao nhất (6,56 chồi/mẫu, 2,77 đốt/chồi và chiều cao trung bình chồi đạt 3,52 cm).

Như vậy, qua kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi thấy rằng công thức môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh là: Knud* +0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3 mg/l α-NAA + 20g/l Sucrose + 20g/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt, xanh, lá khỏe.

3.3. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Cây nuôi cấy mô in vitro trước khi chuyển ra vườn ươm thường phải có bộ rễ hoàn chỉnh. Nếu rễ kém phát triển sẽ làm cho quá trình hút nước cũng như khả năng bám đất của cây bị ảnh hưởng nhưng ngược lại, bộ rễ phát triển mạnh sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng của các cơ quan khác. Do đó cần nghiên cứu để tìm ra môi trường ra rễ thích hợp cho cây.
Khi các chồi đạt tiêu chuẩn cho ra rễ, có chiều cao 3 – 5 cm , có 3 – 4 rễ, chồi mập khỏe, lá to, xanh thì được chuyển sang các môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh.
Qua thí nghiệm trên, hai loại auxin là IBA và α-NAA đã được tiến hành nghiên cứu và cho kết quả là không có khả năng sản sinh ra rễ bất định đối với lan Kim tuyến (A. setaceus). Do đó trong nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nghèo dinh dưỡng và than hoạt tính đến sự ra rễ ở cây lan Kim tuyến (A. setaceus).

3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ

Lan Kim tuyến là một loại cây có yêu cầu về dinh dưỡng thấp, khi sống ở các môi trường nghèo dinh dưỡng thì rễ lan Kim tuyến sẽ kéo dài hơn để lấy dinh dưỡng cho cây. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu cho cây ra rễ trên môi trường nền nghèo dinh dưỡng, không có chất kích thích sinh trưởng để đánh giá môi trường nền ra rễ thích hợp và đánh giá khả năng ra rễ của mẫu Lan Kim tuyến trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Môi trường Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Số rễ (rễ/chồi) Chiều dài TB rễ (cm) Đặc điểm rễ
MS 66,67 1,25 1,6 Mập, ngắn
MS/2 83,33 1,87 2,3 Mập, dài
Knud* 66,67 1,5 1,83 Mập, ngắn
Knud*/2 100 2,17 2,47 Mập, dài
CV% 0 3,4 2,0  
LSD0,05 0,0075 0,11 0,077  

Hình 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng đến sự ra rễ)
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy, các môi trường nền khác nhau có ảnh hưởng rõ ràng đến sự ra rễ in vitro của lan Kim tuyến.

Theo kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy, môi trường Knud*/2 cho tỷ lệ tạo rễ cao nhất (100%), số lượng rễ nhiều nhất (2,17 rễ/chồi) và chiều dài rễ cũng cao nhất (2,47 cm), chồi mập và dài. Các môi trường khác đều cho các chỉ tiêu này thấp hơn, tỷ lệ tạo chồi dao động từ 66,67 – 83,33%; số lượng rễ dao động từ 1,25 – 1,87 rễ/chồi; chiều dài rễ đao động từ 1,6 – 2,3 cm; chồi ngắn hơn.
Như vậy có thể thấy rằng môi trường nghèo dinh dưỡng sẽ kích thích bộ rễ Lan Kim tuyến phát triển mạnh hơn và phát triển theo hướng phát triển chiều dài rễ.

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

Vai trò tích cực của than hoạt tính đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Theo đó, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp… Và đặc biệt, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do làm cho môi trường sẫm màu, nên có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ, 2006). Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng than hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar để xác định vai trò của than hoạt tính đối với sự ra rễ của cây Lan Kim tuyến.
Kết quả trình bày ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Nồng độ

(g.L-1)

Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Số rễ (rễ/chồi) Chiều dài TB rễ (cm) Đặc điểm rễ
       0(ĐC) 66,67 1,25 1,6 Ngắn, mập
0.1 100 2,0 2,89 Ngắn, mập
0.3 100 3,83 3,2 Dài, mập, khỏe
0.5 100 4,22 3,5 Mập, dài, rất khỏe
CV% 0 1,6 1,5  
LSD0,05 0,016 0,087 0,077  

Hình 9. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, nồng độ than hoạt tính khác nhau rõ ràng có ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo rễ và chiều dài rễ và số lượng rễ của Lan Kim tuyến nuôi cấy mô.
Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy, bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy rõ ràng là có ảnh hưởng tích cực hơn đến sự hình thành của rễ cây lan Kim tuyến. Ở tất cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung than hoạt tính ở nồng độ 5% cho số lượng rễ nhiều nhất (4,22 rễ/chồi) và chiều cao rễ là 3,5 cm. Trong khi đó ở các nồng độ khác thì số lượng rễ thấp hơn dao động từ 2 – 3,83 rễ/chồi, đối chứng chỉ có 1,25 rễ/chồi, chiều cao dao động từ 2,89 – 3,2 cm, đối chứng là 1,6 cm. Chất lượng rễ của mẫu cấy ở môi trường có bổ sung 5% than hoạt tính là dài, mập và rất khỏe, ở cá nồng độ khác thì rễ ngắn và yếu hơn.

Căn cứ vào các chỉ tiêu đánh, chúng tôi cho rằng, than hoạt tính ở nồng độ 5% là có tác dụng kích thích sự hình thành và phát sinh rễ lan Kim tuyến tốt nhất

3.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (A. setaceus Blume) in vitro

3.4.1. Nghiên cứu giá thể phù hợp nhất cho việc ra cây loài lan Kim tuyến (A.
setaceus Blume) in vitro

Một trong những yếu tố có ý nghĩa quyết định và hay được nghiên cứu khi đưa cây in vitro ra vườn ươm đó là giá thể. Các loại giá thể ươm cây sau in vitro cho các loài Lan thường là Dớn, xơ dừa, bột dừa…được dùng riêng rẽ hay trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp với từng cây. Tùy từng đối tượng cây khác nhau mà cần phải có những nghiên cứu cụ thể nhằm tìm ra loại giá thể phù hợp nhất cho sự sống sót và sinh trưởng của cây.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và sử dụng 4 loại giá thể khác nhau và theo các công thức dưới đây:

CT 1: Giá thể 100% dớn
CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa
CT 3: Giá thể 100% xơ dừa
CT 4: Giá thể 100% bột dừa
Các giá thể được làm sạch, sấy khô và được ngâm nước trước khi đưa vào sử dụng. Sau 2 tuần đưa cây ra ngoài giá thể chúng tôi thu được kết quả theo Bảng 3.9

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới sinh trưởng và tỷ lệ sống của cây lan  Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Công thức Tỷ lệ cây sống (%) Số rễ mới (%) Đặc điểm cây
CT1 55,98 1,22 Cây mảnh, lá xanh đậm
CT2 66,32 1,71 Cây to, mập, xanh đậm
CT3 46,11 0,98 Cây mảnh, lá màu xanh nhạt
CT4 33,76 0,34 Cây gầy, yếu, xanh nhạt

Từ Bảng kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy trên các giá thể khác nhau, tỷ lệ sống sót, khả năng sinh trưởng, phát triển của cây cũng rất khác nhau. Tỷ lệ sống sót và khả năng sinh trưởng tốt nhất của các cây con đạt được ở giá thể gồm 50% Dớn và 50% xơ dừa (CT2). Ở giá thể này, cây thích ứng rất nhanh, chỉ sau 7 -10 ngày trồng cây đã có biểu hiện sinh trưởng rõ rệt. Cây to, mập, lá có màu xanh đậm và cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 66,32% và thấp nhất ở giá thể bột dừa đạt 33,76%.

Tuy Dớn và xơ dừa là giá thể phù hợp nhất cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume nhưng tỷ lệ sống thu được không cao do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành các thí nghiệm nhằm nâng cao tỷ lệ sống cho giống lan in vitro này.

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Mục đích của giai đoạn huấn luyện là tạo điều kiện cho cây trong môi trường in vitro dần làm quen với môi trường tự nhiên bên ngoài. Sau khi được huấn luyện, cây con sẽ cứng cáp, khoẻ mạnh hơn và đạt tỷ lệ sống cao khi đưa ra trồng ngoài nhà lưới, vườn ươm… Có thể coi giai đoạn này như giai đoạn thuần hoá cây trước khi tách khỏi điều kiện in vitro.

Trong điều kiện in vitro, cây con được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng, ánh sáng nhân tạo và vô trùng, tức là đã quen sống dị dưỡng. Khi đưa cây con ra trồng trên giá thể ở ngoài tự nhiên, cây con phải sống tự dưỡng, xung quanh là môi trường không vô trùng, ánh sáng tự nhiên. Do vậy, huấn luyên cây in vitro cũng giúp cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái bán tự dưỡng, để khi đưa cây ra trồng ngoài vườn ươm cây có thể tự dưỡng ngay mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng. Thời gian huấn luyện khác nhau giúp cây có khả năng thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài bình khác nhau, do đó có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống cảu cây con khi đưa ra trồng ngoài vườn ươm.

Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể sau 4 tuần được trình bày ở Bảng 3.10 dưới đây.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

CT TG huấn luyện cây trong bình (ngày) Tỷ lệ cây sống (%) Đặc điểm của cây con khi đem trồng
ĐC 0 60 Rễ dài 1,8 -2,5 cm, có rất nhiều lông hút, rễ trắng, mập. Cây cao 4 – 5cm,

mập, lá xanh non

CT1 4 92,67 Rễ dài 1,9 -2,3 cm, có rất nhiều lông hút, rễ trắng, mập; cây cao 4,2 – 5cm,

mập; lá xanh non

CT2 8 98,67 Rễ dài 2 -2,6 cm, có rất nhiều lông hút, rễ trắng, mập; cây cao 4,5 –

5,2cm, mập; lá dày, xanh non

CT3 12 98,67 Rễ dài 2,2 – 3cm, có rất nhiều lông hút, rễ hơi vàng, mảnh. Cây cao 4,7 – 5,4cm, khá mập, lá xanh non
CT4 16 94,33 Rễ rất dài, mảnh, rễ vàng; lá mỏng xanh nhạt; thân dài 6 cm, nhỏ, đốt dài

Hình 10. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Kết quả phân tích phương sai 1 nhân tố với tỷ lệ cây sống cho Ftính (=106,35) > F0,05 (=5,31) chứng tỏ thời gian huấn luyện ảnh hưởng rõ rệt tới tỷ lệ sống của Lan Kim tuyến.
Công thức đối chứng không tiến hành huấn luyện cây cho tỷ lệ cây sống thấp nhất (60%).
Công thức CT2 và CT3 có tỷ lệ cây sống cao nhất (98,67%), chất lượng rễ và cây con khi đem trồng cũng tốt nhất và tương đương nhau. Tuy nhiên, nếu xét về hiệu quả kinh tế thì công thức CT2 tốt hơn, rễ mập hơn nên công thức này là thích hợp nhất.
Như vậy, trước khi đưa lan Kim tuyến đem trồng lên giá thể nên tiến hành huấn luyện cây trong bình với thời gian là 8 ngày.

Hình 11. Lan Kim tuyến sau huấn luyện 8 ngày trong bình và trồng 2 tuần ngoài giá thể

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới/vườn ươm. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%.
Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau, kết quả thu được ở Bảng 3.11 dưới đây.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

CT TG che kín luống cây

(ngày)

Tỷ lệ cây sống (%) Đặc điểm của cây con
ĐC 0 80,33   Cây cao 4,5 – 5,2cm, mập; lá dày, xanh non; rễ bám vào giá thể ít
CT1 5 95,67   Cây cao 4,7 – 5,3cm, mập; lá dày, xanh non; rễ bám vào giá thể khá và bắt đầu hình

thành rễ mới

CT2 10 99   Cây cao 4,7 – 5,5cm, mập; lá dày, xanh non; rễ bám vào giá thể nhiều, đầu rễ kéo dài ăn Lan vào giá thể 0,5cm
CT3 15 99   Cây cao 4,8 – 5,7cm, mảnh; lá mỏng, xanh nhạt; rễ bám vào giá thể nhiều, đầu rễ kéo

dài ăn lan vào giá thể 0,5cm

Hình 12. Đồ thị ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Kết quả phân tích phương sai 1 nhân tố với tỷ lệ cây sống cho Ftính (=131)> F0,05 (=5,98) chứng tỏ thời gian che kín luống cây bằng nilon có ảnh hưởng rõ tới tỷ lệ sống của cây con.

Công thức CT2 và CT3 có tỷ lệ cây sống cao nhất (99%) và thấp nhất là công thức ĐC (80,33%). Sức sống của cây con ở các thời gian che bóng khác nhau cũng khác nhau khá rõ. Công thức CT2 cây phát triển tốt nhất, cây mập, lá dày và xanh non, rễ phát triển và bám giá thể tốt. Công thức CT5 rễ bám giá thể khá tốt nhưng cây mảnh và lá mỏng mang màu xanh nhạt hơn ở công thức CT2.

Công thức ĐC cho tỷ lệ cây sống thấp nhất. Tuy cây phát triển khá tốt nhưng độ bám của rễ vào giá thể rất kém nên không đạt tiêu chuẩn.

Những ngày đầu đưa cây ra trồng ở nhà lưới/vườn ươm, luống cây được phủ kín nilon để giúp cây con tránh bị mất nước do bay hơi. Nếu luống cây không được che kín bằng nilon, cây con sẽ bị mất nước khi trời nắng hoặc gió lùa khiến cho cây bị héo và chết. Tuy nhiên, thời gian che kín luống cây bằng nilon kéo dài sẽ khiến cây bị quá thiếu ánh sáng dẫn đến bị “ớm”, cây cao nhưng mảnh và lá xanh nhạt làm khả năng quang hợp kém, hay ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây con.

Như vậy, khi đưa lan Kim tuyến ra trồng ở vườn ươm thì nên che bóng trong vòng 10 ngày là thích hợp.

Hình 13. Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

 IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Dựa vào kết quả thu được từ các thí nghiệm chúng tôi rút ra các kết luận sau:

1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch in vitro và cơ quan vào mẫu thích hợp:

Rửa sạch bằng xà phòng rồi đem ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút.
Cơ quan vào mẫu thích hợp nhất là mắt đốt ngang thân, cho tỷ lệ sống cao đạt khoảng 72%, tỷ lệ tạo chồi là 100% và hệ số nhân đạt 4,56 lần

2. Môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp:

– Môi trường nền thích hợp để nhân nhanh Lan kim tuyến (A. setaceus) là môi trường Knud* + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar
– Môi trường: Knud* + 1,0 mg/l BAP hoặc 1,0 mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
– Môi trường nhân nhanh phù hợp nhất: Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3 Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

3. Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh:

– Môi trường phù hợp nhất cho sự ra rễ ở loài Lan kim tuyến là Knud*/2 + 5% than hoạt tính.

4. Xác định điều kiện ra cây thích hợp với loài Lan Kim tuyến

– Giá thể phù hợp nhất với loài Lan Kim tuyến là: 50% Dớn + 50% xơ dừa.
– Thời gian huấn luyện cây trong bình phù hợp nhất là 8 ngày – Thời gian che luống cây phù hợp nhất là 10 ngày cho tỷ lệ cây sống là 99%

4.2. Đề nghị

Do thời gian quá ngắn nên cây lan Kim tuyến vẫn chưa được đưa vào sản xuất trên quy mô công nghiệp nên chúng tôi đề nghị tiếp tục nhân và sản xuất ra với số lượng lớn nhằm bảo vệ nguồn dược liệu quý và đáp ứng nhu cầu sử dụng lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) hiện nay.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

  • Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 3, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, 2005.
2. Bộ Khoa học và Công nghệ, Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb. Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 2007.
3. Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, 2006.
4. Lê Thị Kim Đào, “Nghiên cứu thử nghiệm nhân một số giống cây trồng rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô (Bạch đàn, cây Hông, Giổi xanh, Trầm hương)”, Tạp chí sinh học, 23, 3, tr.46-50, 2001.
5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển 3, Nxb. Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh, 2000.
6. Dương Công Kiên, Nuôi cấy mô thực vật, Nxb. Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, 2002.
7. Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhynchostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm, Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2007.
8. Phùng Văn Phê và nnk, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống In vitro loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume), Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2009.
9. Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành, Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi In vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(4), 248-253, 2010.
10. Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng. “Đặc điểm hình thái, phân bố của loài Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(2), 104-109, 2010.
11. Nguyễn Thị Quỳnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự tăng trưởng của một số cây thân gỗ nhiệt đới và cận nhiệt đới trong điều kiện nuôi cấy in vitro”, Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN, tr. 42-44, 2005.
12. Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô, tế bào thực vật, Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 2000.
13. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Sinh lý học thực vật, Nxb. Giáo dục, Hà Nội, 2007.

  • Tài liệu tiếng Anh

14. Aitken-Christie J. T. Kozai and S. Takayama, Automation in plant tissue cultures – general introduction and overview. In: Aitken-Christie J, Kozai T, Smith MAL (eds.) Automation and environmental control in plant tissue culture, Kluwer Academic Publ, Dordrecht. pp.1-18, 1995.
15. Arditti J. and R. Ernst, Micropropagation of orchids, John Wiley & Sons, Canada, pp. 467-520, 1993.
16. Arditti J. and A.D. Krikorian, Orchid micropropagation: the path from laboratory to commercialization and an account of several unappreciated investigators. Botanical Journal of the Linnean Society, 122: 183-241, 1996.
17. Bajaj Y.P.S., Biotechnology in agriculture and forestry, Vol. 11. Springer, Berlin, 1986.
18. Bajaj Y.P.S., M. Furmanowa and O. Olszowska, Biotechnology of the micropropagation of medicinal and aromatic plants. In: Bajaj Y.P.S, editor. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 4. New York: Springer Verlag. pp. 60-103, 1988.
19. Belitsky I. and V.N.A. Bersenev, Jewel Orchids. In: Orchids. Magazine Am. Orcchid Soc. pp. 33-37, 1999.
20. Bhojwani S.S. and M.K. Razdan, Plant tissue culture: Theory and practice, a revised edition. Elsevier Science B.V. The Netherlands. 113, 1996.
21. Chen G.Y., A.J. Conner, M.C. Christey, A.G. Fautrier, and R.J. Field, Culture and regeneration of protoplasts from shoots of asparagus cultures.
Int. J. Plant Sci. 158: 543-55, 1997.
22. Chen G.Y., A.J. Conner, M.C. Christey, A.G. Fautrier, and R.J. Field, Protoplast isolation from shoots of asparagus cultures, Int. J. Plant Sci., 158: 537-42, 1997.
23. Chen L.J., T.W. Hu, and L.C. Huang, A protocol toward multiplication of the medicinal tree, Eucommia ulmoides Oliver, In vitro Cell Dev Biol Plant, 31: 193-198, 1995.
24. Chow H.T., W.C. Hsieh, and C.S. Chang, In vitro propagation of Anoectochilus formosanus, J. Sci. Eng., 19:155-166, 1982.
25. Du X.M., N.Y. Sun, N. Irino, and Y. Shoyama Glycosidic constituents from in vitro Anoectochilus formosanus. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 48:1803-1804, 2000.
26. Etienne-Barry, D., B. Bertrand, A. Schlönvoigt, and H. Etienne, The morphological variability within a population of coffee somatic embryos produced in a bioreactor affects the regeneration and the development of plants in the nursery, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 68:153-162, 2002.
27. Etienne H. and M. Berthouly, Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 69:215-231, 2002.
28. George E.F. and P.D. Sherrington, In: Plant Propagation by Tissue Culture. Exegetics Ltd., Eversley, England, pp. 324-366, 1984.
29. Goussard P.G., Effect of cytokinin on elongation, proliferation and total mass of shoot derived from shoot apices of grapevine cultured in vitro. Vitis, 20:228-234, 1981.
30. Grewal S., S. Kaul, V. Sachdeva, and Atal, Regeneration of plants of ioscorea deltoidea Wall. by apical meristem cultures, Indian. J. Exp. Biol., 15:201-203, 1977.
31. Huang L. and T. Murashige, Plant tissue culture media: major constituents; their preparation and some applications, Tissue Culture Assoc. Manual., 3:539-548, 1977.
32. Hunter S.S., Cinchona: micropropagation, and the in vitro production of quinine and quinidine. In: Bajaj YPS, editor. Biotechnology in Agriculture
and Forestry. Vol. 4, Medicinal and Aromatic Plants. I. Berlin, New York: Springer. pp. 367-387, 1988..
33. Hyndman S.E., P.M. Hasegawa, and R.A. Bressan, The role of sucrose and nitrogen in adventitious root formation on cultured rose shoots, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1:229-238, 1982.
34. Juss A., A medicinal tree, Plant Cell. Tiss. Org. Cult., 34:13-18, 1993..
35. Kano K., Studies on the media for orchid seed germination, Mem. Fac. Agric. Kagawa University, 20:1-68, 1965.
36. Kargi F. and M.Z. Rosenberg, Plant cell bioreactors: Present status and future trends, Biotechnology Progress. 3:1-8, 1987.
37. Lou H. and S. Kako, Role of high sugar concentration in inducing somatic embryogenesis from cucumber cotyledons, Scientia Hort., 64:11-20, 1995.
38. Murashige T., Plant propagation through tissue cultures, Annu. Rev. Plant Physiol., 25:135-166, 1974.
39. Murashige T., Plant growth substances in commercial uses of tissue culture. In: Skoog F, editor. Plant Growth Substances. Berlin: Springer-Verlag. pp. 426-434, 1980.
40. Murashige T. and F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Plant Physiol., 15:473-497, 1962.
41. Nguyen Trung Thanh, Pham Luong Hang, Nguyen Van Ket, Truong Thi Lan Anh, Phung Van Phe, Nguyen Thi Hong Gam, Phi Thi Cam Mien, The role of different medium and plant hormones on multiple shoots of Jewel orchids (Anoectochilus setaceus Blume), J. Science VNU, Vietnam, Vol. 28 (1): pp 47-53, 2012.
42. Nguyen Van Ket, Effect of environmental conditions on In vitro and Ex vitro growth of Jewel orchid (Anoectochilus formosanus Hayata), Thesis for the Degree of Doctor of Philosophy in Agriculture, The Graduate School of Chungbuk National University, 2003.
43. Palai S.K, G.R. Rout, and P. Das, Micropropagation of ginger (Zingiber officinale Rosc.): interaction of growth regulators and culture conditions,
Proc Biotechnology of Spices, Medicinal and Aromatic Plants, Kerala, India, pp. 20-24, 1997.
44. Pan M.J. and J.V. Staden, Effect of activated charcoal, autoclaving and culture media on sucrose hydrolysis, Plant growth regulation, Vol. 9, pp.135-141, 1999.
45. Trigiano G.N. and D.J. Gray, Plant tissue culture concepst and laboatry exercise, CRC Press. Florida, America, 2000.
46. Van Winkle S.C. and G.S. Pullman, The role of activated carbon in tissue culture medium, Institute for Paper Science and Technology, Vol. 6, No. 6. 1995.
47. Wang S.Y., Y.H. Kuo, H.N. Chang, P.L. Kang, H.S. Tsay, K.F. Lin, N.S. Yang, and L.F. Shyur, Profiling and characterization antioxidant activities in Anoectochilus formosanus Hayata, J. Agr. Fd. Chem., 50:1859-1865, 2002.
48. Wann R.S., R.L. Veazey, and J. Kaphammer, Activated charcoal does not catalyze sucrose hydrolysis in tissue culture media during autoclaving, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 50: 221-224, 1997.
49. Yadav U., L. Madan and V.S. Jaiswal, Micropropagation of Morus nigra L. from shoot tip and nodal explants of mature trees, Sci. Hortic., 44:61-66, 1990.
50. Zenk M.H., The impact of plant tissue culture on industry and agriculture. In: Thorpe TA, editor. Frontiers of Plant Tissue Culture, Proc. Fourth Int. Cong. Plant Tiss. Cult. Calgary: Canada. pp. 1-13, 1978.
51. Zimmerman R.H., (eds). Micropropagation. The Netherlands: Kluwer Academic Publ. pp. 71-93, 1991.
52. Ziv M., Morphogenetic patterns of plants micropropagated in liquid medium in shaken flasks or large-scale bioreactor cultures, Isr. J. Bot., 40:145-153, 1991.

Tài liệu từ Internet:

53. Kim Sinh (2011). “Đua nhau vào rừng sâu “săn”…cỏ !”, http://baoxuan.giadinh.net.vn/30635p0c1000/dua-nhau-vao-rung-sau-san-co.htm.
54. http://congnghexanhviet.com/San-pham/Giong-cay-trong/28/GIONG-CAYCHAT-LUONG-CAO.html
55. http://caythuocviet.com.vn/cay-thuoc-vi-thuoc/Lan-kim-tuyen.html

Tác giả

Phí Thị Cẩm Miện. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC. NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *