Nhân giống mã đề Plantago major L. bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Plantago major L. ( Mã đề) có nguồn gốc từ miền Viễn Đông, là loại dược liệu được sử dụng từ xưa. Kỹ thuật tạo và nuôi cấy mô sẹo cũng như tái sinh chồi từ cuống lá và lá non cây Plantago major L. đã được thực hiện. Kết quả nghiên cứu cho thấy : (i) môi trường thích hợp cho sự tạo mô sẹo là môi trường MS bổ sung 2,4 D 1mg/L kết hợp BA 0.5mg/L;

(ii) từ các mô sẹo hình thành, có thể tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung TDZ 1mg/L hoặc TDZ 1mg/L kết hợp NAA 0.5mg/L sẽ cho hiệu quả cao (tương ứng 100 và 96%); (iii) từ chồi tái sinh có thể cấy chuyền trên môi trường MS bổ sung BA nồng độ 5mg/L để tăng số chồi; (iv) trong giai đoạn tạo rễ in vitro, có thể sử dụng môi trường MS bổ sung NAA nồng độ 2mg/L. Cây con sau khi tạo rễ đều sinh trưởng, phát triển tốt và có hình thái như cây mẹ trên các giá thể: phân rơm mục + tro trấu (tỉ lệ 1:1), cát + đất (1:1); đất hoặc cát khi thuần dưỡng trong nhà lưới.

Từ khóa: 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, ABBREVIATIONS, Acclimatization, BA: Benzyl adenine, NAA: -Naphthaleneacetic acid, MS: Murashige and Skoog, Plantago major L., plant growth hormone, TDZ: Thidiazuron, tissue culture.

1. Giới thiệu

Nghiên cứu trên cây dược liệu là hướng phát triển tương lai vì khả năng chi trả và tiếp cận tối thiểu. Trong số các cây dược liệu, cây mã đề (Plantago major L.) thuộc họ Plantaginaceae, là loài dược liệu tiềm năng vì chứa hàm lượng cao biosubstances, flavonoids, và một số acid hữu cơ và có khả năng kháng viêm, giảm đau, chống oxi hóa, kháng sinh yếu, điều chế miễn dịch, chống lại bệnh ung thư, chống đông máu, hạ huyết áp (Ho, 2000; Kolak et al., 2011). Loài này đang thu hút nhiều sự chú ý và bắt đầu có giá trị kinh tế (Basma et al., 2012).

Các phương pháp nhân giống thông thường, như gieo hạt, ghép, cắt cành, sucker(chồi nhảy từ cây mẹ như chồi mới cây chuối gọi là sucker) được thực hiện tại chỗ nhưng cồng kềnh và phụ thuộc vào mùa. Vì vậy, ứng dụng các công cụ hiện đại của công nghệ sinh học cần được chuẩn hóa để khai thác tối đa lợi ích từ cây dược liệu này (Kalia et al., 2011). Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật và một công cụ giá trị trong nông nghiệp. So sánh với các phương pháp thực vật khác, đây là một kỹ thuật thuận tiện để tạo cây đồng đều và đồng nhất bộ gen của nhiều loài mong muốn. Công nghệ này thuận tiện và có khả năng sản xuất quanh năm lại không yêu cầu không gian lớn (IAEA, 2004). Đây là một tiềm năng to lớn trong sản xuất quy mô lớn trong chương trình cải thiện nguồn gen cây Plantago major. Thật sự, nhân giống cây mã đề trở nên thông dụng hơn và phương pháp nuôi cấy mô đạt được kết quả thành công cho hầu hết các giống: P.lanceolata L., P.major, P.maritima L., P.madia L. và P.ovata Forssk (Tu, 1996; Makowczynska và Golec, 2000; Makowczynska và Golec, 2003; Fons et al., 2008).
Tuy nhiên, sự cảm ứng mô sẹo trực tiếp hay gián tiếp tái sinh chồi vẫn hạn chế (Fons et al., 2008). Các kết quả tích cực về nhân giống Mongolian và cây mã đề lá rộng ở Việt Nam vẫn chưa được thực hiện. Nghiên cứu này được tiến hành với mục đích xác định môi trường tối ưu cho tái sinh cây mã đề nhờ công chệ nuôi cấy mô để áp dụng và cải thiện sản xuất và ứng dụng cây mã đề, cũng như góp phần phát triển cây mã đề ở quy mô công nghiệp nhằm cung cấp sản phẩm cho cả thị trường trong và ngoài nước.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu thực vật

Hạt trưởng thành Plantago major được khử trùng bề mặt bằng cách rửa qua cồn 70% trong 2 phút và rửa lại ba lần với nước cất khử trùng. Sau đó, hạt được khử trùng với NaOCl 2% (v/v) và 0.03% (v/v) Tween 20 trong 15 phút và rửa lại ba lần với nước cất vô trùng. Sau đó hạt lắc với HgCl2 0.1% (w/v) trong 2 phút và rửa lại 6 lần với nước cất vô trùng.

2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Tất cả các mẫu được trải trên môi trường gồm muối cơ bản và vitamin của MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 3% (w/v) sucrose và 0.2% (w/v) phytagel. Môi trường được chỉnh về pH 5.8, sau đó hấp khử trùng tại áp suất 1.2-1.3 kg/cm 121oC trong 20 phút. Quá trình nuôi cấy duy trì ở điều kiện in vitro tại 251oC và chiếu sáng 16h dưới cường độ 45molm-2s-1 được cung cấp bởi ánh sáng trắng đèn huỳnh quang. Sau 10 ngày nuôi cấy, các mẫu (5mm đường kính lá non, 5mm chiều dài cuống là) được cắt ra trong điều kiện vô trùng từ cây P.major gieo hạt để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Tất cả điều kiện nuôi cấy duy trì trong cùng điều kiện in vitro đã mô tả ở trên.

2.3. Phương pháp

2.3.1. Hiệu quả của nồng độ và sự kết hợp hormon khác nhau trong cảm ứng mô sẹo
Để xác định hiệu quả của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên cảm ứng mô sẹo từ lá non và mẫu cuống lá, môi trường MS bao gồm nhiều sự kết hợp của nồng độ 2,4 D (0, 0.1, 0.5 và 1 mgL-1) và nồng độ BA (0, 0.5, 1 và 2 mgL-1). Mỗi nghiệm thức được tiến hành 5 lần lặp lại (10 mẫu trên 1 đĩa petri cho 1 lần lặp lại) cho mỗi loại mẫu thử. Sau 4 tuần nuôi cấy, phần trăm cảm ứng tạo mô sẹo được đếm.

2.3.2. Tái sinh chồi và nhân chồi
Các cụm callus được chọn từ nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm cảm ứng mô sẹo ờ trên để sử dụng cho các phân tích tiếp theo. Để xác định hiệu quả các chất điều hòa tăng trưởng lên tái sinh chồi, môi trường MS bao gồm sự kết hợp của nồng độ NAA (0, 0.5 và 1 mgL-1) và nồng độ TDZ (0, 0.2, 0.5 và 1 mgL-1). Mổi nghiệm thức được tiến hành 5 lần lặp lại, 10 mẫu trên 1 đĩa petri cho 1 lần lặp lại. Sau 4 tuần nuôi cấy, phần trăm tái sinh chồi được đếm.

Để đánh giá hiệu quả của nồng độ BA lên sự nhân nhanh chồi, các chồi với 3-4 lá được nuôi cấy. Môi trường MS chứa các nồng độ BA (0, 1, 2, 3, 5 và 7 mgL-1) được sử dụng.
Mỗi nghiệm thức được tiến hành 5 lần lặp lại, 3 mẫu trong 1 bình cho mỗi lần lặp lại. Sau 2, 4, 6 và 8 tuần nuôi cấy, số chồi mới được đếm.
2.3.3. Tạo rễ
Các chồi được tái sinh, không có rễ được chuyển sang môi trường MS (1/2 MS và MS) bổ sung than hoạt tính 2 gL-1 và các nồng độ khác nhau của NAA (0, 0.5, 1, 2 và 4 mgL-1) để kiểm tra hiệu quả của hormon NAA trong tạo rễ. Sau 4 tuần nuôi cấy, số rễ được đếm.
2.3.4. Thuần hóa
Sau khi hình thành rễ, cây được chuyển ra chậu nhựa 20×20 cm với 4 chất nền bao gồm cát, đất, cát:đất (1:1, v/v) và rơm rạ: tro trấu (1:1, v/v). Thí nghiệm được tiến hành 4 nghiệm thức, 5 lần lặp lại, 15 cây con cho mỗi lần lặp lại.
2.4. Phân tích thống kê
Tất cả các dữ liệu được phân thích nhờ gói thống kê cho các ngành khoa học xã hội (phiên bản 16.0 cho Windows, SPSS Inc.) và phần mềm Microsoft Excel để thực hiện ANOVA và DUNCAN test (P0.05 hoặc 0.01).
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Hiệu quả của nồng độ hormon lên sự cảm ứng mô sẹo cây mã đề
Kết quả từ thí nghiệm cảm ứng callus chỉ rõ phần trăm mô sẹo được tạo ra là khác biệt có ý nghĩa tại mức 0.01. Phần trăm cảm ứng callus cao nhất trên môi trường MS chứa 1 mgL-1 2,4 D và 0.5 mgL-1 BA (Bảng 1). Tuy nhiên, không có sự khác biệt có nghĩa trên các mẫu còn lại hoặc giao thoa giữa các mẫu và sự kết hợp hormon trong cảm ứng callus. Kết quả này tương tự nghiên cứu trên sự phát triển P.major trên môi trường MS chứa 0.5-1 mgL-1 2,4 D kết hợp 0.2 mgL-1 BAP (Tu, 1996; Makowczynska và Andrzejewska – Golea, 2000).
3.2. Hiệu quả của nồng độ và sự kết hợp hormon trong phát sinh chồi
Chồi sơ khởi được hình thành từ mẫu callus trong 2 tuần nuôi cấy. Các biệt hóa sơ khởi trong chồi xanh với 2-3 foliar appendages sau thời gian 4 tuần. Hiệu quả của các môi trường MS lên cảm ừng chồi từ cụm callus được trình bày trong Hình 1, 2B và F. Quan sát thấy đáp lại nồng độ 1 mgL-1 TDZ hoặc kết hợp 0.5 mgL-1 NAA là khác biệt có nghĩa (P<0.01) với phần trăm mẫu tạo chồi cao nhất, tương ứng 100 và 96% chồi được hình thành.

Tuy nhiên, phát sinh chồi không hình thành trên các sự kết hợp nồng độ NAA và TDZ. Trong nghiên cứu này, TDZ có hiệu quả hơn trong cảm ứng tái sinh chồi từ mô sẹo P.major so với khi kết hợp với NAA. TDZ là substitute phenyl urea có hoạt tính tương tự cytokinin với N6 được thay thế dẫn xuất adenine (Mok et al., 1982). TDZ cho thấy kích thích tích lũy cả auxin var cytokinin nội sinh trong đậu và các cây cỏ (Murthy et al., 1995; Hutchinston và Saxena, 1996). Cũng vậy, nghiệm thức mô sẹo đậu nành với TDZ kích thích tích lũy cytokinin (Thomas và Ketterman, 1986). Điều này có thể vì cytokinin không thể đảo ngược tính bất hoạt bởi hai cơ chế, một trong số đó là sự phân hủy oxi hóa vị trí N6 của bề mặt cytokinin do cytokinin oxidase (Kende và Zeevaart, 1997). TDZ được biết là ức chế không cạnh tranh hoạt tính cytokinin oxydase (Chatfield và Armstrong, 1986), vì vậy tăng cường khả năng của cytokinin nội sinh. Trong nghiên cứu này, TDZ cho thấy hiệu quả có khả năng tái sinh chồi hơn các hormon khác, hỗ trợ cho các giả thuyết trước.

3.3. Hiệu quả của BA trong nhân chồi cây mã đề
Hiệu quả của các nồng độ BA trong nhân chồi từ mẫu được trình bày trong Bảng 2. Nó cho thấy đáp ứng trong phạm vi nồng độ BA có sự khác biệt thống kê (P<0.01) với liên quan đến số chồi trên mẫu sau 8 tuần nuôi cấy. Số chồi mới hình thành trên môi trường MS với 5 hoặc 7 mgL-1 BA. Các chồi này khỏe hơn (Hình 2C &G) và có thể chuẩn bị để tạo chồi. Chúng được nhân trên môi trường tương tự trong 6 tháng và chồi đạt được từ hướng này được ghi nhận là bình thường. Kết quả trình bày tương tự các kết quả khác trên P. asiatica L. (Tu, 1996), P.major (Li và Li, 2005).
3.4. Hiệu quả của nồng độ NAA trong cảm ứng tạo rễ cây mã đề
Các nồng độ NAA (0, 0.5, 1, 2 và 4 mgL-1) trong môi trường MS (1/2 MS và MS) được kiểm tra để tối ưu nồng độ chất điều hòa tăng trưởng và khoáng chất để hình thành rễ.

Theo Makowczynska và Andrzejewska – Golea, 2003, mặc dù P.major có thể tạo rễ trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng, trong kết quả của chúng tôi, chúng tôi quan sát thấy số rễ cao nhất trên môi trường ½ MS chứa NAA 1 mgL-1, và sự kết hợp này có ý nghĩa hơn các nghiệm thức khác tại mức 0.01, ngoại trừ nghiệm thức môi trường ½ MS bổ sung 2 và 4 mgL-1NAA hay môi trường MS bổ sung 2 mgL-1 (Bảng 3). Không có callus hay hiện tượng hóa nâu của mẫu trong giai đoạn hình thành rễ. Điều này cũng được báo cáo trên các loài khác khi không đáp ứng trên theo hướng giống nhau trong suốt quá trình thiết lập nhân giống, nhân nhanh và tạo rễ in vitro (Van Huylenbroeck và Debergh, 1996). Như được liệt kê trong bảng 3, môi trường ½ MS có hiệu quả hơn trong cảm ứng tạo rễ hơn môi trường MS, tương ứng 13.8 và 9.7 rễ. Khác biệt có nghĩa ở mức 0.01. Kết quả cho thấy chi phí hóa chất giảm đáng kể. Phát triển tối ưu và hình thái học của mô có thể thay đổi khác với cây tùy theo nhu cầu dinh dưỡng của cây. Mô từ các phần khác nhau trên thực vật có nhu cầu khác nhau để phát triển đúng nhu cầu (George, 1993). Trong giai đoạn tạo rễ, chất lượng cây con được cải thiện khi giảm nhu cầu đa lượng, đặc biệt nồng độ nitrogen thấp (Driver và Suttle, 1987).
3.5. Hiệu quả của cơ chất lên cây tái sinh
Thành công cuối cùng của quá trình vi nhân giống ở quy mô thương mại phụ thuộc vào khả năng chuyển cây khỏi nuôi cấy quy mô lớn, giá thành thấp và khả năng sống cao (Chandra et al., 2010). Bekman và Lukens (1997) đã đề cập đến vật liệu hỗ trợ có vai trò quan trọng và có thể ảnh hưởng đến phần trăm sống sót, tăng trưởng và phát triển trong giai đoạn thuần hóa. Kết quả cho thấy khả năng sống và số lá mới và số chồi cao nhất với tất cả các cơ chất, không có sự khác biệt có nghĩa tại P=0.05 (Bảng 4). Phần trăm cao của cây con khi chuyển vào chậu đất và phát triển bình thường trong nhà kính với 93.3-100% sống sót sau 4 tuần. Các quan sát cho thấy không có biến đổi kiểu hình trong hình thái học của cây (Hình 2). Nuôi cấy in vitro P.major có thể cung cấp vật liệu thực vật cho phân tích hóa sinh. Vì vậy, chồi tái sinh của cây có thể chứa các biosubstance quan trọng như iridoid và các glycoside khác (Samuesen, 2000; Pourmorad et al., 2006; Souri et al., 2008).

Cảm ứng callus, tái sinh chồi và nhân nhanh từ lá non (A, B, C) và mẫu cuống lá (E, F, G). D: Rễ được tạo thành sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1-4 mgL-1 NAA. H: Cây P.major vi nhân giống sau 4 tuần trong chậu.

4. Kết luận
Chúng tôi thiết lập phương pháp tái sinh hiệu quả cho P.major và tìm thấy cuống và lá non của thân non cảm ứng tỉ lệ cao nhất trong cảm ứng tạo callus và hình thành mô sẹo nhỏ trên môi trường MS bổ sung 1 mgL-1 2,4 D và 0.5 mgL-1 BA sau 4 tuần nuôi cấy. Từ mô sẹo tái sinh, phôi soma có thể được cảm ứng trên môi trường MS bổ sung 1 mgL-1 TDZ hay 1 mgL-1 TDZ và 0.5 mgL-1 NAA. Môi trường tốt nhất để nhân chồi là MS bổ sung 5 mgL-1 BA; đối với môi trường MS rắn bổ sung 2 mgL-1 than hoạt tính và 2 mgL-1 NAA để đạt hiệu quả tốt nhất trong tạo rễ cây mã đề. Cây con tái sinh chuyển ra thành công trong chậu chứa hỗn hợp rơm rạ : tro trấu (1:1, v/v), cát:đất (1:1, v/v), đất hoặc cát. Cây con cho thấy tỉ lệ sống cao và phát triển bình thường trong điều kiện nhà lưới.

Tài liệu tham khảo:

N. V. Ay 1,2, M. V. Duy 2, O. Baatartsogt1, Kh. Altantsetseg1, V. Enkhchimeg1 1Dept of biotechnology and breeding, School of Animal Sciences and Biotechnology, Mongolian University of Life Science, Mongolian 2College of agriculture and applied biology, Can Tho University, Vietnam

Basma, M.A.R., Hiba A.H. and Muna K.M. (2012). The study of antibacterial activity of Plantago major and Ceratonia siliqua. The Iraqi Postgraduate Medical Journal, 11(1): 130 – 135.

Bekman P. and Lukens T. (1997). Simple step for pot calla success. Grower Talks, 60(12): 49 – 54. Chandra S., Bandopadhyay R., Kumar V. and Chandra R. (2010). Acclimatization of tissue cultured plantlets: from laboratory to land. Biotechnol Let, DOI 10.1007/s10529 – 010 – 0290 – 0, 32: 1199 – 1205.

Chatfield J.M. and Armstrong D.J. (1986). Regulation of cytokinin oxidase activity in callus tissues of Phaseolus vulgaris L. cv. Great Northern. Physiol. Plant, 80: 493 – 499.

Driver J.A. and Suttle G.R. (1987). Nursery handling of propagles. In: Cell and Tissue Culture in Forestry (Bonga J.M. & Durzan D.J., eds.). Dortrecht, Netherlands, pp. 320 – 335

Fons F., Gargadennec A. and Rapior S. (2008). Culture of Plantago species as bioactive components resources: a 20 year review and recent applications. Acta Bot. Gallica., 155(2): 277 – 300.

George E. F. (1993). Plant propagation by tissue culture (2nd. Ed.). Exegetic Ltd., UK. 709p.

Ho P.H. (2000). Illustrated Flora of Viet Nam. Youth Publication House, pp. 879 – 880.

Hutchinson J.M. and Saxena P.K. (1996). Acetylsalicylic acid enhances and synchronizes thidiazuron – induced somatic embryogenesis in geranium (Pelargonium ortorum Bailey) tissue cultures. Plant Cell Rep., 15: 512 – 51 5.

IAEA. (2004). Low cost options for tissue culture technology in developing countries. IAEA TECDOC – 1384, ISBN: 92 – 0 – 115903 – X, ISSN: 1011 – 4289

Kalia R. K., Singh R., Rai M. K., Mishra G. P., Singh S. R. and Dhawan A. K. (2011). Biotechnological interventions in sea buckthorn (Hippophae L.): current status and future prospects. Trees: DOI: 10.1007/s00468 – 011 – 0543 – 0, 25(4): 559 – 575.

Kende H. and Zeevaart J.A. A. (1997). The five classical plant hormones. The Plant Cell, 9: 1197 – 1210.

Kolak U., Boga M., Urusak E.A. and Ulubelen A. (2011). Constituents of Plantago major subsp. intermedia with antioxidant and anticholinesterase capacities. Turk J Chem, 35: 637 – 645

Li Y. and Li P. (2005). In vivo culture method of Plantago major. Patent written in Chinese CN 1701657, 9p. Makowczynska J. and Andrzejewska – Golec E. (2000). Somatic embryogenesis in in vitro culture of Plantago asiatica L. Acta Soc. Bot. Pol., 69: 245 – 250.

Makowczynska J. and Andrzejewska – Golec E. (2003). Micropropagation of Plantago asiatica L. through culture of shoot tips. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 72(3): 191 – 194.

Mok M.C., Mok D.W.S., Armstrong D.J., Shado K., Isogai Y. and Okomoto T. (1982). Cytokinin activity of N – phenyl N – 1,2,3 – thiadiazol – 5 – ylurea (thidiazuron). Phytochem, 21: 1509 – 1511.
Murashige T. and Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio – assays with tobaco tissue culture. Physiol. Plant., 15: 473 – 497.

Murthy B. N. S., Murch S. J. and Saxena P. K. (1995). Thidiazuron – induced somatic embryogenesis in intact seedlings of peanut (Arachis hypogaea): endogenous growth regulator levels and significance of cotyledons. Physiol. Plant., 94: 268 – 276.

Pourmorad F., Hosseinimehr S.J. and Shahabimajd N. (2006). Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants, African J Biotechnol, 5(11): 1142 – 1145.
Samuelsen A.B. (2000). The traditional uses, chemical constituents and biological activities of Plantago major L. A review. Journal of Ethnopharmacology, 71: 1 – 21.

Souri E., Amin G., Farsam H. and Barazandeh Tehrani M. (2008). Screening of antioxidant activity and phenolic content of 24 medicinal plant extracts, DARU, 16(2): 83 – 87.

Thomas J.C. and Ketterman F.R. (1986). Cytokinin activity induced by Thidiazuron. Plant Physiol., 81: 681 – 683.

Tu Y. (1996). Tissue culture of asiatic plantain (Plantago asiatica). Zhongcaoyao, 27: 296 – 298.

Van Huylenbroeck J.M. and Debergh P.C. (1996). Impact of sugar concentration in vitro on photosynthesis and carbon metabolism during ex vitro acclimatization of Spatiphyllum plantlets. Physiol. Plant., 96: 298 – 304.

Chân thành cảm ơn tác giả: Nguyễn Văn  Ây và Mai Vũ Duy,  Đại Học Cần Thơ
Kh. Altantsetseg  và V. Enkhchimeg, Mongolian University of Life Sciences
Thao khảo bài viết gốc ở link: https://www.researchgate.net/publication/316875600_PROPAGATION_OF_Plantago_major_L_BY_PLANT_TISSUE_CULTURE_TECHNIQUE

Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *