Nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ nuôi cấy invitro phần I

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là vận dụng những phương pháp, kỹ thuật để đưa mẫu thực vật vào điều kiện vô trùng, duy trì và phát triển chúng bằng môi trường thích hợp. Vì sao lại sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô? Vì chúng đem lại lợi ích rất nhiều như tạo ra số lượng nhân bản lớn, có thể thúc đấy quá trình ra hoa và lai tạo trong ống nghiệm với thời gian nhanh hơn, tạo ra cây giống mức độ đồng đều và sạch bệnh, quan trọng là nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô mà ta có thể chuyển gene vào cây nhằm tạo ra giống vượt trội hơn. Ví dụ như có khả năng chịu hạn, chịu rét, chịu mặn, hoặc giống cây giàu dinh dưỡng hơn, to hơn, phát triển nhanh hơn, vân vân.

Nội dung bài viết sẽ được trình bày như sau:

1. Nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ nuôi cấy invitro phần I
2. Nuôi cấy mô thực vật và thành phần môi trường nuôi cấy invitro phần II
3. Nuôi cấy mô thực vật và các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy phần II-a
4. Nuôi cấy mô thực vật và môi trường bổ sung các loại hormone phần II-b
5. Nuôi cấy mô thực vật và các loại kháng sinh trong môi trường nuôi cấy phần II-c
6. Nuôi cấy mô thực vật và các kỹ thuật nuôi cấy mô phần III

VIỆC CHỌN MẪU THÍCH HỢP

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thế của tế bào. Theo ông mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.Như vậy mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh.

Mặc dù tế bào bất kỳ của thực vật là toàn năng, nhưng trong các kỹ thuật nuôi cấy mô hiện nay, tuỳ theo loại cây người ta sẽ lấy mẫu ở những vị trí nhất định. Chọn đúng vị trí lấy mẫu sẽ tạo ra khả năng sống sót ở mẫu thực vật cao hơn. Ví dụ như ở lan, người ta chọn đỉnh sinh trưởng hoặc phát hoa để vô mẫu, vì vị trí hầu như không có virus gây bệnh và có khả năng sống sót cao. Hoặc có cây người ta chọn những đốt thân còn non. Mẫu nếu lấy ở phần rễ thì rất dễ bị nhiễm vì chúng là nơi cư ngụ của nhiều loại nấm mốc, vi sinh, vi khuẩn. Do đó, nếu ta lấy ở phần trên mặt đất thì việc vô trùng sẽ dễ dàng hơn, tỷ lệ nhiễm sẽ ít hơn. Những phần trên mặt đất như thân, cành, lá, chồi, vân vân.

Hoa lan nở hoa trong môi trường nuôi cấy
Mẫu hoa Lan được vô mẫu và cho nở hoa trong điều kiện nuôi cấy in-vitro
VÔ TRÙNG MẪU THỰC VẬT

Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già… Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn. Các mẫu cấy khi chọn lựa phải được rửa trước bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng

Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong cồn 70% trong 30 giây, sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn. Trong thời gian xử lí, mô cấy phải được ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Khi xử lí xong mô cấy được rửa nhiều lần trong nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú y để lại một lớp bọc ngoài khi ngân mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường.

Đối với những mẫu khó khử trùng thì việc xử lí mẫu phải được lặp lại sau 24-48 h trước khi cấy. Điều này cho phép những vi sinh vật chưa chết có thời gian phát triển đến giai đoạn nhạy cảm với thuôc khử trùng.

Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy.

Việc xử lí thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử lí trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm là bụi tóc, tay, quần áo vì vậy trong khi cấy phải rửa tay,lau bằng cồn 700 tới khủy tay, tay áo phải xoắn cao lên, kẹp tóc gọn.. Không nói chuyện hoặc nhảy mũi trong khi đang cấy. Khi cấy không nên chạm tay vào mặt trong của bình cấy cũng như các dụng cụ cấy. Không đưa vào tủ cấy các bình cấy đã bị nhiễm vì bào tử có thể phát tán trong tủ cấy.

môi trường nuôi cấy mô thực vật
Môi trường nuôi cấy mô thực vật bổ sung agar
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Dưới đây sẽ trình bày chuyên sâu về các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy thông thường người ta xài Murashige and Skoog medium, Knudson C Orchid medium, Woody Plant medium, Gamborg B5 medium…

Sau đây là bảng thành phần môi trường Knudson C Orchid:

Vi lượng mg/l µM
FeSO4.7H2O 25.00 89.92
MnSO4.H2O 5.68 33.61

 

Đa lượng mg/l mM
Ca(NO3)2 241.30 1.43
KCl 250.00 3.35
KH2PO4 250.00 1.84
MgSO4 122.15 1.02
NH4NO3 500.00 6.25
(NH4)2SO4 500.00 3.78

Sau đây là bảng thành phần môi trường Murashige and Skoog medium có chứa vitaminsvitamins

Thành phần vi lượng mg/l µM
CoCl2.6H2O 0.025 0.11
CuSO4.5H2O 0.025 0.10
FeNaEDTA 36.70 100.00
H3BO3 6.20 100.27
KI 0.83 5.00
MnSO4.H2O 16.90 100.00
Na2MoO4.2H2O 0.25 1.03
ZnSO4.7H2O 8.60 29.91

 

Thành phần đa lượng mg/l mM
CaCl2 332.02 2.99
KH2PO4 170.00 1.25
KNO3 1900.00 18.79
MgSO4 180.54 1.50
NH4NO3 1650.00 20.61

 

Vitamins mg/l µM
Glycine 2.00 26.64
myo-Inositol 100.00 554.94
Nicotinic acid 0.50 4.06
Pyridoxine HCl 0.50 2.43
Thiamine HCl 0.10 0.30

Còn tiếp, hãy đón xem ở phần II( Nuôi cấy mô thực vật và môi trường nuôi cấy)

 

Facebook Comments

3 Replies to “Nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ nuôi cấy invitro phần I”

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *