Nuôi cấy mô thực vật và thành phần môi trường nuôi cấy invitro phần II

Ở phần I, bài viết về nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ việc nuôi cấy có đề việc chọn mẫu mô thực vật nào tốt? kỹ thuật vô trùng và môi trường nuôi cấy phổ biến hay dùng trong nuôi cấy mô. Trong nội dung bài II sẽ đề cập chuyên sâu hơn về các thành phần trong môi trường nuôi cấy mô thực vật.

Nội dung bài viết sẽ được trình bày như sau:

1. Nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ nuôi cấy invitro phần I
2. Nuôi cấy mô thực vật và thành phần môi trường nuôi cấy invitro phần II
3. Nuôi cấy mô thực vật và các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy phần II-a
4. Nuôi cấy mô thực vật và môi trường bổ sung các loại hormone phần II-b
5. Nuôi cấy mô thực vật và các loại kháng sinh trong môi trường nuôi cấy phần II-c
6. Nuôi cấy mô thực vật và các kỹ thuật nuôi cấy mô phần III

Môi trường nuôi cấy mô thực vật- plant tissue culture
Mẫu mô thực vật được cấy vào môi trường và xếp trên các kệ sáng
THÀNH PHẦN TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy.

Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

  1.  Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
  2. Các vitamins
  3. Các amino acid
  4. Nguồn carbon: một số loại đường
  5. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
  6. Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô.
  7. Chất làm thay đôi trạng thái môi trường: các loại thạch agar

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.

Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

  1. Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường.
  2. Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…)
  3. Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).
môi trường nuôi cấy mô thực vật Biospace
Các chất khoáng vi lượng và đa lượng, vitamins, than hoạt tính… được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
 Các chất khoáng

Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino axít, vitamin, protein và các axít nucleic. Tương tự, Fe, Zn và Mo cũng là thành phần của một số enzym. Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5.Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật:

  1. Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P….) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các axít nucleic và nhiều chất hữu cơ khác. Canxi và axít boric được tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh học.
  2. Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzym (là các cofactor): Magie, kẽm, sắt… và nhiều nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các enzym.
  3. Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật. Ví dụ, K và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym.
Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng:

– Các chất dinh dưỡng đa lượng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau. Tất cả các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật. Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate và potassium. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy nguồn N cung cấp trong môi trường dưới cả 2 dạng nitrate và amonium (2-20 mmol/L) là tốt hơn cả. Trong trường hợp chỉ dùng amonium, thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch vòng (cycle acids), tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa (dạng muối), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưởng độc do nồng độ của amonium vượt quá 8 mmol/L trong môi trường được giảm bớt. Khi các ion nitrate và amonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3 mmol/L.

Các nguyên tố đa lượng

a. Nguồn carbon (C)

Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả năng quang hợp. Khi khử trùng, đường sucrose bị thuỷ phân một phần, thuận lợi hơn cho cây hấp thụ. Trong một số trường hợp, ví dụ nuôi cấy mô cây một lá mầm, đường glucose tỏ ra tốt hơn so với sucrose. Mô thực vật có khả năng hấp thu một số đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loại đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật.

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước).
Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn fructose cho hiệu quả kém hơn. Sucrose, trong khi khử trùng môi trường, bị biến đổi thành glucose và fructose. Trong tiến trình này, đầu tiên glucose sẽ được sử dụng và sau đó là fructose. Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt.
Các dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thể dùng cho nuôi cấy, tuy nhiên những loại tế bào được nuôi trên môi trường có chứa một trong các polysaccharide trên nhất định phải thể hiện khả năng thủy phân thông qua các enzyme chẳng hạn như amylase. Có những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trường chứa tinh bột khá nhiều amylase. Chuyển chúng lên môi trường chỉ chứa sucrose lượng amylase thải ra sẽ giảm ngay.
Glycerin cũng có thể được tế bào sử dụng. Mannitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu, hoặc tương tự sucrose chúng cũng được dùng để cảm ứng stress nước. Các loại rượu như ethanol, methanol ít hiệu quả, còn propanol và butanol thì rất độc.
Acid hữu cơ thường không phải là nguồn carbon thích hợp cho tế bào nuôi cấy. Thí nghiệm với các acid: folic, succinic, pyruvic và keto-glutaric chỉ đạt 15% sinh trưởng so với sucrose. Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡng và vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng. Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡng carbon. Việc bổ sung nguồn carbon bên ngoài vào môi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi xanh.

Sự thủy phân từng phần sucrose xuất hiện khi môi trường được khử trùng. Các tế bào và mô nuôi cấy đã sinh trưởng trên môi trường có sucrose được khử trùng bằng autoclave tốt hơn trên môi trường có sucrose được khử trùng bằng màng lọc (filter). Điều này cho thấy các tế bào thích hợp với nguồn dự trữ có sẵn của glucose và fructose do thủy phân sucrose khi khử trùng bằng autoclave. Sử dụng fructose được khử trùng bằng autoclave không được đề cập đến vì nó có thể gây bất lợi cho sinh trưởng của mô.

b. Nguồn Nitơ (N):

Mô , tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như aminonium và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid. Tỉ lệ amonium và nitrate thay đổi tùy theo loài và trạng thái phát

triển của mô. Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3. Amonium được cung cấp dưới

dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3. Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ của NO3+ và NH4+ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên cứu. Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ. Nitrat có thể được vận chuyển theo mạch xylem đến các bộ phận của cây, tại đó nó sẽ tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ. Nitrat có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng.

c. Nguồn  Phospho (P):

Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật . Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng. Trong môi trường nuôi cấy, Photpho được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium. Ion photphate hóa trị 1 và 2 có thể chuyển đổi lẫn nhau tùy theo pH. Ion H2PO4- chiếm ưu thế ở pH nhỏ hơn 7, đây là đặc tính của hầu hết môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật cũng là ion dễ được thực vật hấp thụ nhất.

Photpho thường được cung cấp dưới dạng photphate hòa tan hạn chế. Nồng độ photphate hòa tan cao trong môi trường sẽ làm giảm sự tăng trưởng của mô, có thể do calcium và một số nguyên tố vi lượng bị kết tủa trong môi trường hoặc bị giảm hấp thu vào trong mô. Nồng độ ion photphate cho vào môi trường cao nhất là 18,9 mM, trung bình là 1,7 mM, hầu hết các môi trường chứa photphate khoảng 1.3 mM.

Axit nucleic : P là một nguyên tố thiết yếu trong cấu tạo của DNA và RNA để nối các đơn phân tử axít ribonucleic để tạo thành đại phân tử.
Phospholipid: Phospholipid của màng sinh học cũng có chứa một lượng lớn P. Trong những phospholipid này, P (qua liên kết este) tạo nên cầu nối giữa diglyxerit với một amin, axit amin hoặc một rượu. Phospholipid có một đầu háo nước, phân tử 3-diglyxerit và một đầu kỵ nước có chứa PO . Cả hai đều có chức năng quan trọng trong 4 việc giữ ổn định màng tế bào. Màng tế bào bao gồm hai lớp phospholipid đơn ghép lại tạo thành lớp màng kép lipid.
Đầu ưa nước của lớp phospholipid quay ra ngoài hướng về phía các phân tử nước trong khi đuôi kỵ nước lại quay vào phía trong giữa hai lớp của màng tế bào và tương tác lẫn nhau.
Quá trình chuyển hoá năng lượng: Phospho ở dạng liên kết este cao năng (C-P) rất quan trọng đối với quá trình chuyển hoá năng lượng và tổng hợp sinh học ở thực vật. Đóng vai trò quan trọng hơn nữa là các liên kết cao năng giữa hai nguyên tử P như trong phân tử ATP (P-P = 30 kJ). Năng lượng giải phóng trong suốt quá trình thuỷ phân glucoza, quá trình oxi hoá, phosphoryl hoá hoặc quang hợp được sử dụng để tổng hợp ATP. Ngược lại năng lượng này khi cần lại được giải phóng ra qua phản ứng thuỷ phân ATP thành ADP và P vô cơ. Vì vậy ATP được chuyển hoá và tổng hợp mới liên tục. Một gram đỉnh rễ đang trong giai đoạn trao đổi chất mạnh có thể tổng hợp 5g ATP/ ngày với tốc độ tổng hợp trung bình là 30 giây.
Vùng dự trữ P (phosphat): Trong tế bào bao gồm hai vùng dự trữ phosphat khác nhau. Vùng trao đổi, chủ yếu phosphat ở dạng este, nằm trong tế bào chất và ty thể. Vùng không trao đổi, chủ yếu là dạng P vô cơ, nằm trong không bào. Nếu ngừng cung cấp P cho cây, nồng độ P vô cơ trong không bào ngay lập tức sẽ giảm trong khi ở vùng trao đổi tốc độ giảm chậm hơn nhiều. Khi tăng cường cung cấp P, nồng độ P chứa trong các cơ quan của tế bào cũng tăng theo, tuy nhiên khi tăng quá mức bình thường thì chỉ có P vô cơ trong không bào tăng lên. Vì vậy có thể nói, P dư thừa được dự trữ ở không bào dưới dạng P vô cơ.
Các enzym: P vô cơ cũng có khả năng điều chỉnh tốt trong nhiều quá trình trao đổi chất của thực vật. Vậy nên sự phân bố P là cần thiết để điều chỉnh quá trình trao đổi chất của tế bào. Ở cà chua, sự giảm P vô cơ ở không bào trong tế bào chất kích thích hoạt tính của enzym phosphofructokinaza. Enzym này là enzym quan trọng trong sự phân giải cơ chất của phản ứng thuỷ phân glyco và làm tăng sự hô hấp của tế bào trong quá trình chín. Cũng trong thời gian này, sự thiếu hụt P có thể làm chậm quá trình chín của quả.
Trong quá trình tổng hợp tinh bột của lục lạp, P cũng đóng một vai trò quan trọng. Chỉ với nồng độ thấp, P vô cơ đã có thể gây ức chế quá trình tổng hợp tinh bột. Sở dĩ như vậy là do ADP-gluco-pyrophosphorylaza, enzym quan trọng nhất trong quá trình tổng hợp tinh bột, bị kìm hãm bởi P vô cơ và được kích thích nhờ các triossephosphat. Vì thế, sự cân bằng giữa các hợp chất có chứa P là rất quan trọng trong điều hoà tổng hợp tinh bột ở lục lạp. Ngoài ra, P vô cơ cũng tham gia quá trình này theo một con đường khác. Các phân tử vận chuyển phosphat ở màng tế bào sẽ mang P vô cơ vào tế bào và các triosephosphat ra ngoài tế bào, làm nồng độ P vô cơ trong lục lạp tăng, triosephosphat giảm. Điều này lại tác động đến quá trình tổng hợp tinh bột theo cơ chế đã trình bày ở trên.

d. Lưu huỳnh (S): 2- Lưu huỳnh như SO được hấp thụ ở rễ cây với tốc độ chậm. Giống như nitrat,4 lưu huỳnh phải được khử trước khi sử dụng để sinh tổng hợp các hợp chất có chứa lưu huỳnh như amino axít, protein và enzym. Lưu huỳnh ở dạng chưa khử được kết hợp trong các sulpholipid và các polysaccharid.

Sự đồng hoá lưu huỳnh: Bước đầu tiên trong quá trình đồng hoá lưu huỳnh là sự 2- hoạt hoá gốc SO nhờ enzym ATP sulfurylaza. Phản ứng này tạo ra adenosine 4 phosphosulfate (APS) và P vô cơ. Tiếp theo là hai quá trình hoá học hoàn toàn khác nhau. Một quá trình không diễn ra sự khử lưu huỳnh mà tạo liên kết với các polysaccharide trong sulpholipid. Trong quá trình thứ hai, lưu huỳnh được khử thành nhóm –SH (nhóm thiol) và nhóm sulfuryl của APS được vận chuyển tới gluthantione (Glut-SH). Sau đó nhóm –SH được vận chuyển tới cho acetylserine và phân tách thành acetat và cystein. Cystein là sản phẩm bền đầu tiên trong quá trình đồng hoá và là tiền chất của tất cả các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh trong thực vật, ví dụ như: protein, co-enzym, các hợp chất trao đổi chất thứ cấp… Quá trình đồng hoá lưu huỳnh chủ yếu diễn ra ở lục lạp. Khi thiếu lưu huỳnh, sinh tổng hợp protein bị kìm hãm, lượng diệp lục tố trong lá cây bị giảm sút.

Các protein: Lưu huỳnh có mặt trong các protein có chứa cystein và methionin. Cả hai axít amin này đều là tiền chất của tất cả các hợp chất có chứa lưu huỳnh trong thực vật. Lưu huỳnh, cấu tử hợp thành của nhiều coenzym và các nhóm prosthetic, có chức năng quan trọng trong rất nhiều phản ứng oxy hoá khử, được biểu diễn như sau: R-SH + HS-R → R-S-S-R.

Gốc R có thể là phần còn lại của phân tử cystein nhưng cũng có thể là tripeptit gluthatione. Gluthatione tan được trong nước và do đó, nó đóng vai trò như một hệ oxi hoá khử ở lục lạp và dịch bào. Cầu lưu huỳnh giữa hai phân tử cystein rất quan trọng trong cấu trúc bậc ba của phân tử protein và hoạt động của enzym. Nhóm –SH, như đã đề cập ở trên có trong thành phần của các coenzym và APS, tạo thành một phần của nhóm chức năng trong phân tử enzym. Các metallothionein: Các hợp chất phân tử lượng thấp có chứa lưu huỳnh- metallothionein, thường hay được tìm thấy trong thực vật. Hầu hết các chất này đều có chứa cystein. Đặc biệt, các kim loại như: đồng, cadimi và kẽm thường liên kết trong metallothionein. Gần như chắc chắn những phân tử protein nhỏ này tham gia vào sự bài tiết các ion kim loại trên khi chúng dư thừa, trước khi liên kết với nhóm chức năng –SH của các enzym.
Lưu huỳnh chưa bị khử: Lưu huỳnh ở dạng chưa bị khử là thành phần cấu tạo sulpholipid, là phần tử tạo thành cấu trúc của màng sinh học. Lưu huỳnh thường có mặt ở dạng hợp chất este của lưu huỳnh và đường 6 cacbon, ví dụ như glucoza. Sulpholipid có nhiều trên màng thylakoid của lục lạp và tham gia vào quá trình vận chuyển ion qua màng sinh học. Hơn nữa, sự có mặt của sulpholipid trên màng tế bào chắc chắn liên quan đến khả năng chịu muối của thực vật. Mùi vị đặc trưng của một số loài như: hành, tỏi chủ yếu có liên quan đến sự có mặt của các hợp chất có chứa lưu huỳnh dễ biến đổi. e. Kali (K): K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ. Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước. K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3 , KCl. 6H2O, KH2PO4+

Trong thực vật, K là một cation có tính linh động cao, ở cả mức độ tế bào cũng như trong quá trình vận chuyển qua các khoảng cách dài trong mạch xylem hoặc mạch libe. Trong tất cả các nguyên tố, kali là nguyên tố có mặt với nồng độ cao nhất, ở tế bào chất từ 100 – 200 mM, ở lục lạp từ 20 – 200 mM. Muối kali có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh tính thấm của tế bào. Đối với sự + giãn tế bào cũng như các quá trình khác được điều chỉnh nhờ sức trương của tế bào, K có vai trò như một ion trung hoà các ion vô cơ và hữu cơ hoà tan trong dung dịch, đồng thời duy trì pH trong khoảng 7 –8 là pH thích hợp cho hoạt động của hầu hết các enzym. + + Vai trò của K đối với các enzym: K cần thiết cho hoạt động của nhiều enzym. + +Trên 50 enzym của thực vật hoạt động với sự tham gia của K hoặc bị kích thích bởi K

e. Canxi (Ca):

Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây nhưng cách thức không giống như K+ và Mg+ vì Ca2+ không phải là ion linh động. Calciun có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào . Sự hoạt động của nhiều enzim khác của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca2+ vì calcium là đồng yếu tố với những enzim phân giải ATP. Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin.
f. Vai trò Mg của đối với quang hợp:

Mg là nguyên tử trung tâm trong phân tử chlorophyl của hệ quang hợp I và II. Trong phân tử chlorophyl, các photon được hấp thụ tạo ra dòng điện tử, từ đó tạo ra ATP và NADPH đóng vai trò quan trọng đối với cố định ở lục lạp. Nồng độ cao các ion Mg và K là cần thiết để duy trì pH khoảng 6,5 – 7,5 trong lục lạp và tế bào chất, trái với ở không bào pH chỉ vào khoảng 5- 6. Trong một chừng mực nào đó, pH xác định cấu trúc của protein và enzym nên nó ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein và chức năng của lục

Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn…)

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật được gọi là các nguyên tố vi lượng. Đó là các ion: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo). Fe dường như thích hợp hơn khi được cung cấp dưới dạng chelate Fe, và Zn được dùng bình thường trong các môi trường nuôi cấy. Các dạng muối tatrate và citrate Fe khó hòa tan và thường hay kết tủa trong môi trường. Vấn đề này có thể khắc phục bằng cách dùng diaminetetraacetic acid (EDTA)-chelate Fe thay cho citrate Fe, đặc biệt đối với quá trình tạo phôi. Tuy nhiên, các dạng chelate EDTA không hoàn toàn ổn định trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng.
Một số môi trường nuôi cấy được làm giàu bằng cobalt (Co), iodine (I) và sodium (Na), nhưng các yêu cầu nghiêm ngặt về các nguyên tố này cho sinh trưởng của tế bào đã không được thiết lập. Nói chung, nồng độ thường được sửdụng đối với Cu và Co là 0,1 μmol/L, Fe và Mo là 1 μmol/L, I là 5 μmol/L, Zn là 5-30 μmol/L, Mn là 20-90 μmol/L và B là 2-5100 μmol/L được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm.

Việc chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng chủ yếu dựa trên nhu cầu của thực vật đối với các chất này. Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng là lớn hơn, với nồng độ > 0.5 mM. Các nguyên tố vi lượng được sử dụng trong môi trường ở nồng độ < 0.5 mM. Nhu cầu của cây đối với nguyên tố vi lượng là rất thấp. Do vậy những nguyên tố này cũng có mặt trong môi trường ở các nồng độ tương ứng. Hầu hết các nguyên tố vi lượng sử dụng ở lượng nmol. Một số nguyên tố vi lượng có nhu cầu nhỏ hơn có thể thay thế dễ dàng bằng sự lẫn tạp ngẫu nhiên của chúng trong các thành phần của môi trường như agar, các chất bổ sung như nước dừa, dịch chiết nấm men (yeast extract), các muối và nước. Tầm quan trọng của một số nguyên tố vi lượng trong thành phần môi trường còn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Co, Al, Ni… có thể có lợi đối với thực vật nhưng cũng có thể là không cần thiết. Trong thực tế, hầu hết các nguyên tố vi lượng chỉ có phần khoáng của muối (cation) là quan trọng, còn vai trò các anion có thể là không cần thiết.

a. Các protein sắt-lưu huỳnh:

Nhóm protein chứa sắt thứ hai là các protein sắt- lưu huỳnh. Sắt được gắn trong nhóm thiol (-SH) của cystein và lưu huỳnh vô cơ. Ferridoxin là protein chứa sắt lưu huỳnh phổ biến nhất và là chất mang trong các phản ứng truyền + điện tử được xúc tác bởi nitrit reductaza, sulphat reductaza, quá trình tổng hợp NADP trong quang hợp và khử nitơ được thực hiện nhờ phức hệ nitrogenaza. Ba loại protein sắt lưu huỳnh khác nhau, hoạt động liên tiếp nhau, đều nằm trong chuỗi truyền điện tử của phức hệ nitrogenaza. Bên cạnh hai nhóm này, thực vật còn có những enzym khác có chứa sắt. Nguyên tố này cần cho các phản ứng oxi hoá khử và sự định vị của các phức hợp enzym – cơ chất.
Sắt rất quan trọng trong sinh tổng hợp chlorophyl: Trong lá xanh 80% sắt nằm trong lục lạp. Khi thiếu sắt, toàn bộ sắt sẽ tập trung ở lá. Trong lá non, thiếu sắt sẽ dẫn đến sự giảm nhanh nồng độ chlorophyl do quá trình tổng hợp protein bị ngưng lại. Số lượng ribosom cũng giảm mạnh. Thiếu sắt ở rễ kéo theo những thay đổi hình thái. Sự dài rễ giảm nhưng diện tích và số lượng lông rễ tăng.

b. Bo (B):

Vai trò của nguyên tố B trong sinh hóa học và sinh lí học thực vật chưa được biết nhiều. B cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh trưởng bởi vì nó có mặt trong sự sinh tổng hợpcác base nitơ đặc biệt là uracil, cũng như cần thiết cho sự sinh tổng hợp lignin và acid phenolic. Người ta có thể sử dụng nhiều nồng độ B khác nhau trong môi trường nuôi cấy từ 50-100 m. Thiếu B sẽ làm giảm sự sinh tổng hợp cytokinin. Sự phân chia tế bào bị kìm hãm do có sự giảm sinh tổng hợp ARN trong nhân. Bo được hấp thu bởi rễ và được chuyển tới các bộ phận của cây nhờ các xylem. ở các màng tế bào, Bo có mặt chủ yếu ở dạng liên kết este. Không có bất cứ một enzym đã biết nào có chứa hoặc được hoạt hoá bởi Bo. Có những chỉ dẫn cho biết Bo có mặt ở trên hoặc bên trong các màng, có thể ảnh hưởng tới hoạt động của các enzym liên kết màng. Các chức năng chủ yếu của Bo là ở ngoại bào, được phát sinh trong quá trình hoá gỗ của thành tế bào và sự phân hoá xylem. Thành tế bào: Những liên kết este đường- Bo là một phần cấu trúc của các hemicellulose trong thành tế bào. Hầu hết Bo trong thực vật tồn tại ở dạng este trong thành tế bào của cây. Yêu cầu về Bo đối với cây hai lá mầm cao hơn so với cây một lá mầm. Có thể giả định rằng B, cũng giống như calci, có chức năng điều hoà quá trình tổng hợp thành tế bào cũng như ổn định các thành phần của thành và màng tế bào. Sự thiếu hụt Bo ngay lập tức ức chế quá trình phát triển chiều dài của các rễ sơ cấp và thứ cấp. Hơn thế, Bo góp phần điều hoà quá trình trao đổi phenol và tổng hợp lignin.

c. Đồng (Cu):

Đồng hiện diện trong hệ thống enzim cytochrome oxidase của chuổi vận chuyển điện tử hô hấp. Trong thực vật, đồng tồn tại dưới dạng ion hóa trị 1 và 2. Nồng độ đồng cao sẽ gây độc cho mô. Hầu hết các môi trường nuôi cấy có Cu2+ với hàm lượng 0,1-10 μm. Các ion đồng được bổ sung vào dưới dạng sulfate đồng, đôi khi người ta cũng có thể bổ sung đồng dưới dạng CuCl 2 hoặc CuNO3.

Thực vật hấp thu Mo dưới dạng MoO4 2-, thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ đến 1 μm.2+Đồng là một cation hoá trị 2 và được hấp thu vào cây dưới dạng Cu hay dưới dạng 2+ phức chất của nó. Nếu nồng độ Cu và phức đồng tương đương nhau, cây dường như ưa ion đồng tự do hơn.Trong xylem và phloem, đồng hầu như tồn tại dưới dạng phức, và chủ yếu là dạng một phức amino axit- đồng.

Trong tế bào, đồng chủ yếu là thành phần của phức hệ enzym2+ +và rất quan trọng trong các phản ứng oxi hoá khử [(Cu )/(Cu )] được thực hiện nhờ những enzym này. Thiếu đồng lập tức dẫn đến sự giảm hoạt độ của các enzym chứa đồng.

Vai trò của đồng đối với quang hợp: Khoảng 50% đồng trong lục lạp được gắn với plastocyanin, ở giữa chuỗi truyền điện tử, giữa quang hệ I và quang hệ II, có chứa 1 nguyên tử đồng trên 1 phân tử. Trong trường hợp thiếu đồng, nồng độ các plastocyanin sẽ bị giảm. Cũng giống như plastocyanin, các plastoquinone đóng vai trò quan trọng trong truyền điện tử giữa quang hệ I và quang hệ II. Khi đồng bị thiếu, màng lục lạp sẽ thiếu 2 protein điều hoà chuyển động của các plastoquinone. Để tổng hợp các plastoquinone cần phải có enzym laccase, đây là một enzym chứa đồng và hoạt động của nó sẽ bị giảm ngay khi thiếu đồng. Do đó, hiện tượng thiếu đồng nhanh chóng kéo theo hiện tượng giảm quang hợp.

Cảm ơn bạn đã theo dõi, hãy đón xem phần III( Nuôi cấy mô thực vật và các kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật)

d. Coban (Co):

Cobalt có mặt trong khoảng một nửa số lượng môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật . nồng độ sử dụng là 1 μm, đôi khi người ta có thể sử dụng nồng độ Cobalt cao gấp 10 lần. Cobalt là thành phần kim loại trong vitamin B12 có liên quan đến sự sinh tổng hợp acid nuclêic nhưng chưa có bằng chứng nào về tác động của nó lên sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của mô trên môi trường nuôi cấy.

Một trong những mục đích của việc bổ sung cobalt vào môi trường nuôi cấy có lẽ là chống lại sự gây độc của các chelat kim loại và có thể ngăn cản các phản ứng oxi hóa gây ra bởi đồng và sắt. Coban đóng vai trò quan trọng trong quá trình cố định nitơ ở rễ cây họ đậu. Coban là thành phần cần thiết của enzym cobalamin. Co (III) là thành phần kim loại định vị giữa 4 nguyên tử nitơ trong cấu trúc porphyrin. Ba hệ thống enzym của vi khuẩn Rhizobium được biết tới có chứa Co. Người ta thấy rằng có mối liên hệ giữa nồng độ Co với sự cố định nitrogen và sự phát triển rễ củ. Co có vai trò trong quá trình tổng hợp methyonine ở vi khuẩn, tổng hợp ribonucleotide và enzym methymalonyl-coenzyme A mutaza, một enzym cần thiết cho sự tổng hợp leghemoglobin.

Không ai biết chắc rằng liệu Co có giữ vai trò gì ở thực vật bậc cao hay không. Chỉ có một enzym phụ thuộc cobalamin đã được biết tới là leucine-2,3-aminomutase ở khoai tây. Đối với thực vật bậc thấp, Co là yếu tố cần thiết và có mặt trong một số cấu trúc dưới tế bào và thylakoid ở lục lạp.

e. Molybden (Mo):

Thực vật hấp thu Mo dưới dạng MoO4 2-. Molydate thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ đến 1 2 μm.

f. Kẽm (Zn):

Thiếu kẽm thì sự sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và diệp lục tố sẽ bị giảm đi. Thực vật có đốt thân ngắn, lá nhỏ,đồng thời tế bào trần cũng kém phát triển. Trong thực vật có mối quan hệ gần gũi giữa Zn và nồng độ auxin nội sinh. Người ta cho rằng , kẽm là một thành phần trong enzim có liên quan đến sự tổng hợp tiền chất của IAA là trytophan. Nồng độ của kẽm bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 0,1-70 μm, như vậy sự dư kẽm trong môi trường nuôi cấy ít gây độc cho mô.

Kẽm được hệ rễ hấp thu dưới dạng Zn . Trong mạch xylem nó được chuyển vận dưới dạng ion Zn 2+ hoặc muối kẽm của một axit hữu cơ. Nguyên tố này là một hợp phần kim loại của một số enzym. Nó có thể là một cofactor cấu trúc cũng như cofactor điều hoà của phức hệ enzym.

h. Chlor (Cl):

Ion Cl- cần thiết cho sự tăng trưởng của thực vật nhưng nó ít có mặt trong các phản ứng sinh học và có vai trò với một lượng rất nhỏ. Thông thường trong môi trường nuôi cấy mô, nồng độ Cl- cần thiết là 3mM trung bình là 6mM. Một số loài thực vật nhạy cảm với Cl-.
Chlo có ở thực vật dao động từ 70 đến 700 mM trong 1 kg trọng lượng khô (2000 đến – 20000 mg/kg trọng lượng khô). Chlo được hấp thu dưới dạng Cl và rất cơ động trong cây. Chức năng chính của ion này là điều hoà thẩm thấu và bổ sung các chất mang.
Trong lục lạp có chứa hàm lượng chlo lớn. Người ta cho rằng chlo đóng vai trò hết sức quan trọng trong quang hợp. Các lục lạp của rau chân vịt và củ cải đường chứa chlo ở nồng độ xấp xỉ 100mM nhưng trong lá, chỉ có dưới 10mM , cho thấy ưu thế rõ ràng của chlo tập hợp trong lục lạp.

Năng lực thẩm thấu: Ion Cl điều hoà sự đóng, mở khí khổng. Tình trạng thiếu chlo làm khí khổng mở mãi, có thể gây tình trạng mất nước nghiêm trọng.mChlo rất quan trọng trong điều hoà năng lực thẩm thấu của các không bào và với các quá trình liên quan đến sức

trương. Sự trao đổi nitơ: Chlo hoạt hoá enzym tổng hợp asparagin, một enzym quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ.

Enzym này chuyển hoá glutamin thành asparagin và -axit glutamic. Trong điều kiện có Cl , tốc độ của phản ứng tăng lên gấp 7 lần. Bởi thế, chlo đã thực hiện một chức năng quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ ở các loài thực vật sử dụng asparagin như chất mang.

Các vitamins:

Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá. Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô dược nuôi cấy in vtrro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamin thường được sử dụng với nồng độ biến thiên từ 0,1-10 mg/l. Acid nicotinic và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cấn thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loài thực vật. Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng độ 0,1-5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1-10 mg/l. Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dù đây là một carbohydrate chứ không phải là vitamin, nó cũng được chứng minh kích thích cho sự tăng trưởng của tế bào đa số loài thực vật. Người ta cho rằng myo-inositol được phân tách ra thành acid ascorbic và peptine và được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào. Myo-inositol thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l.
Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy. Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói chung không quan trọng và chúng cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào. Nói chung các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ khi nồng độ thiamin thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế bào có thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp.
Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HCl (B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic axít, trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết cho cho sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS. Các tác giả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của B1 trong nuôi cấy mô.
Inositol thường được nói đến như là một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp. Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic axit (vitamin B ), canxi pantothenate (vitamin B ) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy. Anh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau hoặc thậm trí còn có hại (gây độc).

a. Vitamin B1 (Thiamine.HCl, Aneurin)

Là một chất bổ sung rất cần cho môi trường nuôi cấy. Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vit B1 bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol là hai cấu tử của vit B1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp lại chúng thành phân tử vit B1. Vì vậy không nhất thiết phải khử trùng bằng phương thức khác như lọc chẳng hạn.

b. Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin)

Có thể khử trùng bằng nhiệt, nhưng lại dễ bị ánh sáng phân huỷ. Đối với nuôi cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng đối với nuôi cấy trong tối có thể tăng lên 10-50 ppm.

c. Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin)
Là tiền chất của pyridoxal-phosphate-cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và transaminase. Khi khử trùng ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra như sau: Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphate

d. Myo-Inositol (Bios I)
Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, cụ thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic và pectine. Inosit là chất bền vững khi khử trùng. Thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 ppm. Khi phân tích thành phần của nước dừa người ta thu được inosit trong một phân đoạn trung tính.

e. Biotin (Bios II)
Cần thiết cho sự phân bào của một số loại mô. Chỉ sử dụng ở nồng độ rất thấp từ 0,001-0,01 ppm.

f. Acid pantothenic (Bios III, Vit B5)
Được sử dụng để làm thành phần của coenzyme A .
g. Nicotinic acid và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng có thể thay thế bằng các vitamin khác cho sự sinh trưởng của tế bào ở nhiều loài. Các vitamin khác như folic acid, ascorbic acid, vitamin E (tocophenol), và ρ-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào, đặc biệt khi tế bào sinh trưởng ở mật độ quần thể rất thấp.

Nói chung, các vitamin này được bổ sung trong khoảng 0,1-10,0 ppm.

 

Facebook Comments

4 Replies to “Nuôi cấy mô thực vật và thành phần môi trường nuôi cấy invitro phần II”

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *