Nuôi cấy mô trên hoa Lily Lilium speciosum Thunb. Var

Giao thức nuôi cấy mô để nhân giống thực vật quý hiếm, Lilium speciosum Thunb. Var.: Mẫu hoa địa phương Lilium speciosum Thunb. Var. gloriosoides Baker tạo ra mô sẹo toàn năng có thể cấy chuyền trên môi trường cơ bản Murashige và Skoog bổ sung 3mg/L 2,4-dichloropheoxyacetic acid(2,4D) và 0.25mg/L benzyladenine (BA).

Mô sẹo có thể hình thành củ, sau đó phát triển thành cây trên môi trường MS với 0.1mg/L naphthalene acetic acid(NAA), 1g/L than hoạt tính và 170 mg/L NaH2PO4. Giống lily quý hiếm nhân nhanh in vitro nhờ phương pháp chu trình nhân giống vảy củ giống với hệ số nhân là 8 lần trong khoảng thời gian 3 tháng. Cuối cùng 6000 cây giống được tạo thành trong tháng. Chúng tôi thiết lập 200 cây trong nhà kính dưới điều kiện phun sương trong giai đoạn 4 tuần với tỉ lệ sống là 98%. Các cây phát triển tốt và kéo dài với hoa bình thường trong năm thứ hai.

Từ khóa: Bulblet, callus, Lilium speciosum Thunb. Var. gloriosoides Baker, rare plant, scale Viết tắt: 2,4-D, 2,4-dichloropheoxyacetic acid; BA, N6- benzyladenine; NAA, naphthalene acetic acid.

Giới thiệu

Có nhiều kỹ thuật có thể bảo tồn nguồn gen thực vật cho các loài quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng. Các kỹ thuật đó bao gồm vi nhân giống, nảy mầm hạt, tái sinh từ mô sẹo, cứu phôi, vi ghép và bảo quản lạnh (Nitzsche, 1983; Rick, 1984; Stanilova et al., 1994). Vi nhân giống thực vật có củ như sự thay thế phương pháp thông thường trong nhân giống thực vật thu hút nhiều sự chú ý, bởi vì những ưu điểm của nó. Cách này giúp tăng hệ số nhân giống gấp nhiều lần (Novak vaf Petru, 1981; Takayama vaf Misawa, 1982; Takayama vaf Misawa, 1983; Van Aartrijk et al., 1990; Van Aartrijk vaf Blom-Barnhoorn, 1981); Wickremesinhe et al., 1994) và có thể có được nguồn vật liệu sạch virus và sạch bệnh (Blom-Barnhoorn và Aartrijk, 1985, Van Aartrijk et al., 1990).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành trên giống Lilium speciosum Thunb. Var. gloriosoides Baker, một giống cây có củ lâu năm chỉ được tìm thấy ở độ cao 150-600m ở Bắc Đài Loan (Liu và Ying, 1978). Loài này cho hoa lớn màu trắng với những chấm đỏ tuôn ra từ trong cánh hoa, là loài hoa trang trí có giá trị. Không may, hầu hết củ đều được tận dụng trong dược liệu Trung Quốc, loài đặc hữu bản địa dần dần biến mất. Trong năm 1991, nhiều loài đạt tới mức loài hiếm với vùng phân bố nhỏ ở Đài Loan (Lai, 1991). Quy trình nhân giống nhân tạo cần thiết để cứu loài Lily hiếm này và duy trì nguồn gen.

Hiện tại, chúng tôi thiết kế quy trình nhân giống loài lily thông qua việc tạo củ con từ mẫu hoa và nhân nhanh quy mô nhờ nuôi cấy vảy củ in vitro. Cây giống nuôi cấy mô chuyển thành công ra nhà kính và cây bore hoa bình thường trong năm thứ hai. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Cảm ứng tạo sẹo và tái sinh cây

Hoa non (Hình 1a) của Lilium speciosum Thunb. Var. gloriosoides Baker thu từ cây cho mẫu phát triển trong nhà kính và được khử trùng với sodium hypochlorite 1%(v/v) trong 10 phút. Hoa được rửa lại 3 lần với nước vô trùng, cắt thành mẫu 2mm, đặt vào ống nghiệm chứa môi trường 0.22% gelritegelled cơ bản gồm môi trường MS cơ bản, myo-inositol (100mg/L); niacin (0.5 mg/L), pyridoxine HCl (0.5mg/L); thiamine HCl (0.1mg/L), glycine (2.0mg/L), casein hydrolysate (1g/L); sucrose (30g/L). Các chất bổ sung là 2,4-D (3mg/L) và BA (0.25mg/L) và pH môi trường chỉnh về 5.7 với KOH và HCl 1N trước khi hấp khử trùng tại 121°C trong 15 phút. Điều kiện nuôi cấy duy trì ở 20°C trong bóng tối.

nuoi cay mo lily
Cảm ứng tạo sẹo và tái sinh cây

Mô sẹo từ hoa được chuyển sang môi trường cơ bản MS bổ sung 0.1 mg/L NAA, 1g/L than hoạt tính và 170mg/L NaH2PO4 để tái sinh cây. Mẫu được nuôi cấy ở 20oC và dưới ánh sáng nhân tạo 28-36 molm-2s-1 (đèn huỳnh quang FL 30D/29, 40W, China Electric Co, Đài Bắc) với chu kỳ sáng tối là 16/8h.

Nhân giống quy mô lớn bởi nhân nhanh củ con

Vảy củ được cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung 0.1mg/L NAA trong bình ở 25°C dưới ánh sáng đèn huỳnh quang và chu kỳ sáng/tối là 16/8h.

Thiết lập cây con ngoài nhà kính

210 cây con có rễ được rửa dưới vòi nước chảy để làm sạch gel môi trường và chuyển vào khay 35 lỗ với perlite-than bùn trộn đất. Một cách khác để thuần hóa cây con ngoài nhà kính, cây được đặt trong điều kiện tưới phun sương trong 4 tuần. Tổng cộng 25 cây thuần hóa được cho vào chậu 5 inch chứa perlite-vermicuite-than bùn và đặt trong điềukiện nhà kính để ra hoa.

Kết quả và thảo luận
Cảm ứng mô sẹo và tái sinh cây

Mô sẹo được cảm ứng từ hoa trong 3 tháng trong môi trường cộng 2,4-D (3mg/L) và BA (0.25mg/L). Mô sẹo dạng nốt, màu vàng nhạt (Hình 1b). Chúng được cấy chuyền sang môi trường tương tự trong khoảng thời gian 6 tuần. Củ con (Hình 1c) và rễ được quan sát thấy trên cả callus ban đầu và khi cấy chuyền. Mô sẹo được chuyển sang môi trường chứa 0.1mg/L NAA, 1g/L than hoạt tính, và củ con sau đó hình thành trong 4 tuần (Hình 1d). Sau 2 tháng, cây con 5cm (Hình 1e) được tạo thành và có thể sử dụng để nhân in vitro quy mô lớn hay chuyển ra nhà kính.

Nhân giống quy mô bởi nhân nhanh vảy củ

Vảy củ từ mô sẹo được sử dụng như vật liệu nhân nhanh quy mô lớn. Củ bất định có là được tái sinh từ phần hướng trục của vảy củ (Hình 1f) (the adaxial basal part of the scale), và sau đó hình thành rễ để tạo cây giống hoàn chỉnh (Hình 1g). Trung bình hai cây giống từ một vảy trong 3 tháng, và mỗi cây giống tái sinh có 4 vảy trong lần nuôi cấy sau. Tỉ lệ nhân từ phương pháp vảy củ là 8 hold/3 tháng. Cuối cùng, 6000 cây giống được tạo ra trong 9 tháng nhờ quy trình nhân nhanh, và các cây giống có 1-2 lá, 3-6 rễ, củ 0.6-1.0 cm.

Thiết lập cây giống trong nhà kính

Tỉ lệ sống của cây giống có rễ đặt trong khay và thuần hóa trong 4 tuần dưới điều kiện tưới phun sương là 98%. Điều này chứng minh rằng tất cả cây được thuần hóa hiệu quả và dễ dàng từ điều kiện in vitro ra nhà kính (Hình 1h). Không có cây không hoạt động, chúng tiếp tục lớn lên trong cả in vitro và nhà kính.

Từ tháng 1 tới tháng 3 của năm thứ 2, các cây này kéo dài và biệt hóa nhiều lá dưới điều kiện ánh sáng ban ngày và 50% bóng râm. Trong tháng 9 và tháng 10, các cây lớn kéo dài 100-120 cm và có 25-35 lá với củ con trên phần đốt ban đầu. Một số cây ra hoa hoàn toàn với 2-11 hoa. Hoa (Hình 1i) nở hướng xuống với hình thái học bình thường, cũng như cây mẹ.

Mục tiêu của chúng tôi là kéo dài mầm lily quý hiếm, vì vậy chúng tôi cố gắng mở rộng vùng phân bố nhờ phương pháp nuôi cấy mô. Kết quả trình bày ở đây chứng minh quá trình thực tiễn với số lượng lớn cây con thuần (true-to-type) có thể hình thành từ mẫu hoa Lilium speciosum Thunb. Var. gloriosoides Baker. Cảm ứng mô sẹo và hoạt tính tái sinh cao có thể đạt được trong các loài khác của cùng một chi (Arzate-Fernandez et al., 1980; Chou, 1975; Okazaki và Koizumi, 1995; Stimart et al., 1980; Wickremesinhe et al., 1994). Chúng tôi cải tiến phương pháp nhanh và thiết kế quy trình nhân giống quy mô lớn của loài lily quý hiếm trong in vivo và in vitro. Chúng tôi nghiên cứu đặc tính canh tác của dòng thực vật và sẽ giới thiệu giống cây trong chương trình cây giống lily.

Lời cảm ơn. Công việc này được hỗ trợ bởi trợ cấp cho W. C. Chang từ Academia Sinica.

Tài liệu trích dẫn

gloriosoides Baker Chen Chang1, Chang-Tesrn Chen2, Yu-Ching Tsai3, Wei-Chin Chang 1,4 1Institute of Botany, Academia Sinica, Taipei 115 Taiwan 2Taoyuan Ditrict Agricultural Improvement Station, Taoyuan, Taiwan 3Taiwan Seed Improvement and Propagation Station, Hsinshe, Taichung, Taiwan 4Corresponding author. Tel: 886-2-27899590 ext. 120; Fax: 886-2-27827954; E-mail: wcchang@wcc.sinica.edu.tw
Arzate-Fernandez, A. M., T. Nakazaki, Y. Okumoto, and T. Tanisaka. 1997. Efficient callus induction and plant regeneration from filaments with anther in lily (Lilium longiflorum Thunb.). Plant Cell Rep. 16: 836-840.
Blom-Barnhoorn, G. J. and J. van Aartrijk. 1985. The regeneration of plants free of LSV and TBV from infected Lilium bulb-scale explants in the presence of virazole. Acta Hortic. 164: 163-168.
Chou, J.Y. 1976. Studies on the tissue culture of Lilium longiflorum Thunb. 2. Effects of the medium constituent, photoperiod and pH value on the growth, differentiation, and chlorophyll formation of callus. J. Chin. Soc. Hortic. Sci. 22: 161-168.
Lai, M.J. 1991. Criteria and Measure for Assessing Rare and Threatened Plant Species in Taiwan. The Council of Agriculture, ROC, Taipei, 76 pp.
Liu, T.S. and S.S. Ying. 1978. Lilium Tourn, ex L. In H.L. Li, T. S. Liu, T.C. Huang, T. Koyama, and C.E. Devol (eds.), Flora of Taiwan 5. Epoch Publishing, Taipei, pp. 57-62.
Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-479.
Nitzsche, W. 1983. Germplasm preservation. In D.A. Evans, W.R. Sharp, P.V. Ammirato, and Y. Yamada (eds.), Handbook of Plant Cell Culture. V1. Collier Macmillan Publishers, London, pp. 782-805.
Novak, F.J. and E. Petru. 1981. Tissue culture propagation of Lilium hybrids. Sci. Hort. 14: 191-199.
Okazaki, K. and M. Koizumi. 1995. Callus formation and regeneration of some species of Lilium. Acta Hortic. 392: 97-106.
Rick, C.M. 1984. Plant germplasm resources. In P.A. Ammirato, D.A. Evans, W.R. Sharp, and Y. Yamada (eds.), Handbook of Plant Cell Culture V2. Collier Macmillan Publishers, London, pp. 9-37.
Stanilova, M.I., V.P. Ilcheva, and N.A. Zagorska. 1994. Morphogenetic potential and in vitro micropropagation of endangered plant species Leucojum aestivum L. and Lilium rhodopaeum Delip. Plant Cell Rep. 13: 451-453.
Stimart, D.P., P.D. Ascher, and J.S. Zagorski. 1980. Plants from callus of the interspecific hybrid Lilium‘Black Beauty’.  HortScience 15: 313-315.
Takayama, S. and M. Misawa. 1982. Regulation of organ formation by cytokinin and auxin in Lilium bulbscales grown in vitro. Plant Cell Physiol. 23: 67-74.
Takayama, S. and M. Misawa. 1983. A scheme for mass propagation of Lilium in vitro. Sci. Hortic. 18: 353-362.
Van Aartrijk, J. and G.J. Blom-Barnhoorn. 1981. Growth regulator requirements for adventitious regeneration from Lilium bulb-scale in vitro, in relation to duration of bulb storage and cultivar. Sci. Hortic. 14: 261-268.
Van Aartrijk, J., G.J. Blom-Barnhoorn, and P.C.G. van der Linde. 1990. Lilies. In P.V. Ammirato, D.A. Evans, W.R. Sharp, and Y.P.S.
Bajaj (eds.), Handbook of Plant Cell Culture V5. Collier Macmillan Publishers, London, pp. 535-576.
Wickremesinhe, E.R. M., E.J. Holcomb, and R.N. Arteca. 1994. A practical method for the production of flowering Easter lilies from callus cultures. Sci. Hort. 60: 143-152.

Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *