Nuôi cấy mô và chuyển gen trên hoa Cúc

Một phần trong Chi Tagetes bao gồm phục vụ cho nghề trồng hoa (hoa cắt cành) và cây trang trí (chậu và vườn), cũng tốt như một loài cây thuốc và được quan tâm trong y học dân tộc. Mặc dù các cây này có nhiều lợi ích trong khai thác hợp chất thứ cấp quan trọng và các loại tinh dầu, cần sự nhấn mạnh công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô in vitro và vi nhân giống chúng.

Một số nghiên cứu đã tiến hành chuyển gen, chủ yếu hướng đến việc gia tăng sản phẩm của các hợp chất trong cây. Tuy nhiên, ứng dụng của phương pháp chuyển gen yêu cầu sự phát triển của các kỹ thuật hiệu quả, không chỉ trong việc chuyển các gen ngoại lai vào tế bào thực vật mà còn trong việc tái sinh cây hoàn chỉnh, cây fertile từ các tế bào chuyển gen. Vì vậy, sự phát triển các phương pháp thích hợp trong tái sinh là một trong những điều kiện tiên quyết chính trong cải tiến bộ gen bởi ý nghĩa công nghệ sinh học. Mục đích của bài tổng quan của chúng tôi là mô tả các ứng dụng, thông qua tái sinh cơ quan hay tái sinh phôi, để áp dụng trong tái sinh cây cúc hoàn chỉnh (Tagetes erecta L.) và trạng thái hiện tại của gen mục tiêu, liệu thông qua Agrobacterium tumerfaciens hay biobalistics. Những tiến bộ, ứng dụng và hạn chế của công nghệ sinh học trên cây cúc cũng được thảo luận.

Từ khóa: Agrobacterium tumerfaciens, carotenoids, embryogenesis, glicuronidase, lutein, microparticle bombardment, organogenesis

Giới thiệu

Chi Tagetes thuộc Họ Asteraceae (trước đây là Compositae). Chi này bao gồm 55 loài phổ biến rộng lớn ở Mỹ. Hơn một nửa mọc tự nhiên đến vùng Mexico.
Tagetes erecta L. thường được gọi là cúc African, cúc Aztec, cúc lớn hay cempoalxochitl (từ nahuatl, hoa với 20 cánh) là loài cây cỏ thảo mộc, chu kỳ sống trong một năm. Hoa có màu sáng, trong khoảng vàng đến đỏ sậm, vì sự hiện diện của carotenoids trong cụm hoa – được nhóm lại với nhau và vì vậy hình thành một hoa đơn (Serrato-Cruz et el., 2000; Serrato-Cruz, 2004).

Nó được đưa đến châu Âu trong thế kỷ 16 và một số giống được phát triển từ đó, như là: Atlantis, Cortez, Discovery, Galore, Jubilee, Ladies, Piezas de Oro và Vanilla (Serrato-Cruz, 2004). Đem đến sự đa dạng loài ở Mexico, đất nước này cũng được cân nhắc là trung tâm nguồn gốc của loài. Nghịch lý với đa dạng di truyền ở Mexico, liên kết với tiến trình thuần hóa cho thấy bởi những nhóm bản xứ Mesoamerican, không có nghiên cứu nào mô tả các đặc điểm khác nhau của chúng (mức carotenoids, chiều cao cây, cấu tạo cây, tính kháng bệnh …) liên kết với vùng địa lý đa dạng nơi chúng phát triển.

Như kết quả cho thấy không có hệ thống tài liệu về cải thiện di truyền. Thực tế, sản xuất hoa cúc ở Mexico giảm dần trong những năm trở lại đây, vì vậy nhu cầu nguồn carotenoids gia tăng, nhu cầu ở Mỹ và châu Âu được đảm bảo bởi các giống từ Trung Quốc, Ấn Độ và Peru.

Các giống khai thác thương mại, Sweet Cream, Inca, Antigua, Marvel và Perfection được đại diện bởi cây cao 30-40 cm với hoa lớn. Các giống này là kết quả của lai chéo các dòng hay của nhân giống in vitro thực vật.
Không có dữ liệu trong chiến dịch cải thiện di truyền hay tách biệt các đặc tính quan trọng có sẵn trong các bài báo khoa học, vì vậy các công ty như Sakata Seed Corporaton, Park Seeds, Ball Horticultural Company, Goldsmith Seeds và Pan American Seed trong số những công ty khác đang cung cấp (nghĩa gốc là bao gồm) nhu cầu hạt giống cải tiến (Serrato-Cruz, 2004).

Ở Mexico, Tagetes erecta có vai trò rất thích hợp trong văn hóa và kinh tế. Hoa được sử dụng từ thời kỳ Prehispanic trong các lễ nghi liên quan đến tưởng niệm người chết. Trong suốt “Día de Muertos” (01 tháng 11), các phần mộ trong nghĩa trang và bàn thờ được trang trí với những bông hoa này, vì họ tin rằng màu sắc sáng sẽ chiếu sáng cuộc hành trình của các linh hồn để đến thăm những người thân còn sống (Serrato-Cruz, 2004). Họ cũng sử dụng trong dược liệu cổ truyền để chữa bệnh liên quan đến vi khuẩn và nấm. Một số ứng dụng khác như phân ủ xanh (Serrato-Cruz, 2004), thuốc trừ sâu (pyrethrins), kháng sinh, tuyến trùng, thuốc diệt nấm (thiophenes) (Vasudevan et al., 1997; Romagnoli et al., 2005).

Tuy nó được sử dụng trong kiểm soát dịch hại, cúc cũng là mục tiêu của nhiều mầm bệnh. Bọ đốm thực vật kích thích xuất hiện hoa và lá méo mó, trong khi rầy trên lá dẫn đến cúp và làm cong mép lá. Một thành phần của chi Alternaria gây ra sự giảm sút ở cây con, được đặc trưng bởi sự xuất hiện của các đốm hoại tử trên lá. Thân cây chuyển sang nâu và héo tại mặt đất, làm chết cây (Gilman và Howe 1999).
Hoa Tagetes erecta được trồng thương mại, thu hoạch và quy trình trong quy mô công nghiệp như nguồn màu carotenoid vàng-cam (Sowbhagya et al., 2004), với giá trị khoảng từ 0.17 đến 5.7 gram trong tổng carotanoid trên kilogram hoa tươi (Piccaglia et al., 1998). Dịch hoa thô được sử dụng chính như thành phần của thức ăn gia cầm để cải thiện màu vàng đậm của da và lòng đỏ trứng (Hencken 1992, Delgado-Vargas et al. 1998).

Các loài màu cam đậm của cúc chứa các thành phần carotenoid gấp 20 lần so với lá cúc, và 20 lần thành phần của carotenoid tìm thấy trên trái cà chua chín (Moehs et al. 2001). Hoa cúc tập trung chủ yếu nguồn carotenoid chung, với lutein, dihydroxylated carotenoid, tính cho 85% tổng carotenoid hiện diện trong hoa. Carotenoid trong hoa đa phần este hóa với lauric, myristic, palmitic và stearic acid ở các tỉ lệ khác nhau, làm chúng dễ hòa tan trong hexane (Barzana et al. 2002).

Lutein thuộc nhóm sắc tố thực vật xanthophyll (carotenoid chứa oxy). Không như carotenoid khác như -carotene, lutein không là tiền thân vitamin A, tuy nhiên, phytochemical màu cam được tìm thấy có hiệu quả có lợi cho sức khỏe. Chế độ ăn uống giàu lutein có liên quan đến việc giảm nguy cơ giảm thị lực vì thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi tác, dẫn đến mù không hồi phục ở người lớn tuổi. Nó cũng là chất kháng oxy mạnh, hơn so với -carotene và lycopene, điều này dập tắt tính phản ứng oxy và sản sinh gốc tự do trong tiến trình chuyển hóa trong tế bào, hay từ chất ô nhiễm môi trường (Edge et al. 1997). Lutein cũng từng được tìm thấy trong bảo vệ da gây ra bởi tia UV, và ngăn cản xơ cứng tim mạch gây ra bởi tuổi tác, bệnh tim mạch vành và ung thư (Wang et al. 2006).

Mặc dù dịch hoa cúc được sử dụng trong thức ăn động vật nhưng tiềm năng sử dụng của cúc như màu thực phẩm tự nhiên chưa được khai thác trong toàn thể phạm vi vì thiếu thông tin an toàn, sự ổn định và tính tương thích (Sowbhagya et al. 2004). Hiện tại, thực phẩm chức năng chứa lutein đang được phát triển để giúp người nghèo có đủ lượng lutein thông qua việc bổ sung.

Lutein cũng trong 10 phytochemical được đề nghị bởi FDA cũng như GRAS (generally regarded as safe) bổ sung dinh dưỡng (Wang et al. 2006). Carotenoid nhất định, như -carotene, được thấy rằng làm tăng tỉ lệ ung thư phổi ở liều cao, đặc biệt trong thuốc lá. Ngược lại, các nghiên cứu hiện tại với chủng Salmonella typhimurium và tế bào buồng trứng chuột lang Trung Quốc, cho thấy lutein không gây đột biến tại tất cả liều lượng và có hiệu quả kháng đột biến ở cách thức liều phụ thuộc. Tương tự kết quả được tìm thấy trên tổn thương nhiễm sắc thể cảm ứng bởi đột biến, gợi ý tiềm năng an toàn của lutein khi dùng trong thực phẩm chức năng ở liều cao (Wang et al. 2006).

Gia tăng sự quan trọng của carotenoid cho sự tiêu thụ của con người là hiển nhiên từ giá cả của chúng trên thị trường quốc tế. Ví dụ, thị trường thế giới 1999 cho carotenoid là 750-800 triệu US$ và dự báo ước tính khoảng 1 tỷ US$ trong 2005, khi thị trường thế giới hàng năm cho astaxanthin ước tính ở 200 triệu US$ với giá trung bình là 2500 US$/kg. Nó hiện tại nổi trội bằng dạng màu nhân tạo, vốn sản xuất bởi BASF (Ludwigshafen, Germany) và Hoffman-La Roche (Basel, Switzerland). Astaxanthin tự nhiên được sản xuất bằng Haematoccocus pluvialis trong quá trình nuôi cấy hai giai đoạn và nồng độ của nó có thể đạt đến 1.5% tới 3% khối lượng khô. Đem đến giá thành sản phẩm cao, astaxanthin từ Haematoccocus pluvialis không thương mại hóa hoàn toàn với dạng nhân tạo. Tuy nhiên, cho một số ứng dụng cụ thể, như mức sử dụng ở gà và cá, astaxanthin tự nhiên được ưa thích vì tăng cường lắng đọng màu tự nhiên trong tế bào, các yêu cầu quy định và nhu cầu người tiêu thụ cho các sản phầm tự nhiên.
Lượng -carotene tự nhiên ước tính cho thị trường là 100 tấn/năm (Pulz et al. 2001), và giá dịch -carotene từ Dunaliella salina cho con người sử dụng thay đổi trong 300-3000US$ (Spolaore et al. 2006).

Nuôi cấy mô Tagetes erecta

Sự tiêu thụ đa dạng của Tagetes nhấn mạnh tầm tăng trưởng quan trọng và nhu cầu cải tiến hạt thỏa mãn nhu cầu thị trường. Tuy nhiên, nhu cầu này không được đáp ứng được từ người trồng, bởi khả năng sống thấp của hạt và tỉ lệ nảy mầm thấp, làm giảm tuổi hạt.

Cây được tái sinh từ nuôi cấy tế bào thông qua hai phương pháp, phát sinh phôi soma hay phát sinh cơ quan. Cả hai đều được điều chỉnh bằng chất điều hòa tăng trưởng và các yếu tố khác thêm vào môi trường nuôi cấy. Phát sinh phôi soma là tái sinh phôi từ tế bào soma, như phôi, hạt phấn hay lá. Phát sinh cơ quan là sự tái sinh cơ quan, thường là chồi từ các loại tế bào.

Trong Bảng 1, tổng quát của các quy trình có sẵn cho việc tái sinh của Tagetes được thể hiện và chi tiết hơn thì được thảo luận trong phần tiếp theo.

Mẫu. Hai nguồn mẫu được sử dụng: cây trưởng thành từ vườn thực vật học hay cánh đồng (Kothari và Chandra 1984, 1986; Misra và Datta 1999) hay cây giống từ gieo hạt in vitro (Belarmino et al 1992, Misra và Datta 2001; Vanegas et al. 2001; Miranda-Ham et al. 2006). Trong trường hợp cây trưởng thành, Kothari và Chandra (1984, 1986) sử dụng capitula chưa mở hay lá, được khử trùng bề mặt trong 5 phút trong dung dịch thủy ngân chloride 0.1% và rửa 3 lần với nước cất vô trùng; trong khi Misra và Datta (1999, 2001) sử dụng đỉnh chồi hay lá từ cây trưởng thành trên đồng. Các mẫu được rửa dưới vòi nước chảy trong 30 phút, xử lý với dung dịch teepol 5%, và rửa với nước cất. Nhúng nhanh với cồn 70% và sau đó là HgCl2 0.1% trong 1-3 phút tùy thuộc vào tuổi và độ mềm của mẫu. Mẫu được rửa sạch ít nhất ba lần trong 5 phút cho mỗi lần rửa với nước cất vô trùng.

Khi sử dụng mẫu từ cây giao hạt in vitro, quá trình khử trùng thường nhẹ hơn, rửa nhanh với dung dịch hyplochlorite (1-2.5%), với Tween 20 như chất hoạt động bề mặt, và ethanol (70-80%). Rửa sạch triệt để với nước cất vô trùng sau mỗi lần xử lý. Trong mọi trường hợp, hạt khử trùng được cho nảy mầm trên môi trường MS không có chất điều hòa tăng trưởng (Belarmino et al. 1992; Vanegas et al. 2002) hay môi trường MSB không có chất điều hòa tăng trưởng (môi trường MS với cải tiến nguồn nitrogen, sự cải tiến gồm có sự giảm nitrogen tổng là 28mM với tỉ lệ NO3/NH4 là 4.6:1; Robert et al. 1987) (Mirande-Ham et al. 2006). Cây gieo hạt ba tuần tuổi là nguồn của hypocotyl và mẫu lá sử dụng bởi Belarmino et al. (1992) và Vanegas et al.(2002), tương tự, khi cây gieo hạt 2 tuần tuổi được sử dụng để thu được đỉnh chồi thực hiện bởi Mirande-Ham et al. (2006).

Vấn đề thông thường trong các loại thí nghiệm này là mẫu hóa nâu, dẫn đến chết mẫu hay khó tạo sẹo. Để hạn chế sản sinh phenolic, Belarmino et al. (1992) báo cáo rằng nhúng mẫu trong acid ascorbic 1% được lọc vô trùng trong 1 phút trước khi đặt vào môi trường MS.
Môi trường nuôi cấy và chất điều hòa tăng trưởng. Hầu hết các báo cáo sử dụng môi trường MS để cảm ứng quy trình tái sinh và phối hợp khác nhau của 6-benzylaminopurine (BAP), 3-indoleacetic acid (IAA), indole-3-butyric acid (IBA), kinetin (KIN), 2-4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), α-naphthaleneacetic acid (NAA), và Gibberellic Acid (GA3).

Để tái sinh cây từ đĩa hoa, Kothari và Chandra (1984) thăm dò các nồng độ khác nhau của BAP và IAA (3, 4 và 5 mg/L); sự phối hợp tơi ưu là 5 mg/L BAP và 3mg/L IAA, tạo được 15-20 búp chồi. Các tác giả trong năm 1985, sử dụng môi trường MS bổ sung với 2 cytokinin (KIN và BAP) và 4 auxin (IAA, IBA, NAA và 2,4-D) để cảm ứng từ mô sẹo từ lá. Kết quả cho thấy sử dụng KIN đơn lẻ hay kết hợp với bất kỳ một trong bốn auxin có thể cảm ứng tái sinh, khi BAP và IAA hay NAA cũng giống vậy. Chồi bất định đạt được chỉ với 7mg/L BAP và 5mg/L IAA, bất kỳ sự kết hợp khác đều không thành công.

Khi sử dụng mô sẹo từ hypocotyl, Belarmino et al. (1992) có thể tái sinh chồi cây với các sự kết hợp sau: NAA (0.2 mg/L) và BAP(2 và 5 mg/L), NAA (0.5 mg/L) và BAP(1, 2 và 5 mg/L), và NAA (1 mg/L) và BAP(0.5 và 1 mg/L). chỉ có rễ được cảm ứng từ mô sẹo lá khi sử dụng tất cả để kiểm tra sự kết hợp chất điều hòa tăng trưởng.
Để cảm ứng chồi từ đỉnh chồi từ cây trưởng thành, môi trường MS và các sự kết hợp sau được sử dụng: BAP (0.1-10 mg/L), KIN (0.1-1 mg/L), IAA (0.1-2 mg/L), NAA (0.1-2 mg/L), GA3 (0.5-5 mg/L) và 2,4-D (1-10 mg/L). Liều cao của KIN hay GA3 hay BAP cảm ứng chồi nhưng chúng cho thấy các màu vàng đến nâu. Điều kiện tốt nhất được tìm thấy là 5mg/L BAP trong 7 ngày, và sau đó chuyển qua 0.1 mg/L BAP, cho 10 chồi/mẫu (Misra và Datta 1999). Trong trường hợp của lá, các tác giả (Misra và Datta 2001) nuôi cấy mẫu với mặt dưới trên môi trường MS bổ sung với BAP(2.2-8.8 µM), thidiazuron (2.27-9.08 µM), 2,4-D (4.52-22.62 µM), tri-iodobenzoic acid (2-10 µM), acid abscisic (ABA, 0.19-0.95 µM) và GA3 14.43-57.74 µM) để cảm ứng hình thành chồi trực tiếp mà không cảm ứng mô sẹo. Điều này đạt được khi dùng 14.3 µM GA3 và 4.44 µM BAP (2-5 búp chồi được cảm ứng sau 4 tuần). Mẫu lá cho kết quả số chồi cao nhất là điểm cuối cuống lá (basal petiolar). Khi nhân nhanh chồi, chúng được thay đổi sang môi trường chứa 1.1 µM BAP và 29.41 µM AgNO3. Các điều kiện cho 15-20 chồi khỏe mạnh.
Vanegas et al. (2002) thực hiện các auxin NAA (0, 2.7, 5.4 và 8.1 µM) và IAA (0, 2.9, 5.7 và 17.1 µM) và cytokinin BAP (0, 2.2, 4.4, 6.7 và 13.3 µM) để cảm ứng tái sinh cho mẫu lá. Chúng cho chồi trong tất cả các sự kết hợp. Tuy nhiên sử dụng 8.1 µM NAA và 4.4 µM BAP cho kết quả chỉ số năng suất hình thành chồi (BFC) cao nhất (0.62) (có nghĩa 1.6 chồi/mẫu). Tuy nhiên, sự kết hợp của 17.1 µM IAA và 13.3 µM BAP, cho chỉ số BFC là 1.39 (có nghĩa 2 chồi/ mẫu), khi mẫu được nuôi cấy 13 ngày.
Hình dạng chồi được sử dụng để đạt được sự tái sinh của T.erecta trong môi trường MSB, bổ sung các sự kết hợp khác nhau của IAA(0, 10, 30 µM) và BAP (0, 30, 50 và 70 µM). Tuy nhiên tất cả các kết hợp được kiểm tra để cảm ứng hình thành chồi, 10 µM IAA và 70 µM BAP sau 10 tuần, cho thấy chỉ số BFC là 46.2 (66±12 chồi/ mẫu). Chồi hơi cứng, điều kiện bị đảo ngược một lần chúng được chuyển sang môi trường MSB không có chất điều hòa tăng trưởng trong 3-4 tuần (Mirande-Ham et al. 2006).
Thực hiện cấy chuyền. Kothari và Chandra (1984) đề nghị cấy chuyền chồi đạt được từ đĩa hoa trên môi trường MS với 3mg/L BAP, 5mg/L IAA và 5mg/L GA3 mỗi hai tuần, để giữ năng suất morphogenetic trong cả tháng. Ngược lại, mô sẹo lá mất tiềm năng của chúng sau 3 lần cấy chuyền (75 ngày) (Kothari và Chandra 1986).

Phần chồi cơ bản nhân nhanh từ đỉnh chồi có thể sử dụng để thu được nhiều chồi hơn trên môi trường MS với 5mg/L BAP và 5mg/L adenine sulphate ít nhất là 5-6 lần. Sau đó các chồi có sự suy giảm tiềm năng hình thái học (Misra và Datta 1999).

Cả Vanegas et al. (2002) và Mirande-Ham et al. (2006) báo cáo rằng chồi có nguồn gốc từ mẫu lá hay đỉnh chồi được cảm ứng tạo sẹo được chuyển sang môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng, nơi chúng được kéo dài. Không mất đi tiềm năng hình thái học đã được đề cập sau khi cấy chuyền.

Tạo rễ. Kothari và Chandra (1984, 1986) báo cáo tạo rễ của chồi từ đĩa hoa và mô sẹo lá sử dụng môi trường MS với 5mg/L IBA và 0.5mg/L GA3, trong khi Misra và Datta (1999, 2001) thực hiện ở nồng độ IBA thấp hơn (0.05mg/L) hay NAA(0.1 mg/L). Mặc dù vậy 100% mẫu phản ứng tạo rễ với cả IBA và NAA, thứ hai thường được ưa dùng hơn vì không cảm ứng hình thành sẹo. Sau khi rễ bắt đầu xuất hiện, chồi được chuyển sang môi trường không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng để hoàn thành sự hình thành cây.

Trong trường hợp chồi hình thành từ mẫu lá và đỉnh chồi bắt nguồn từ mô sẹo, không sử dụng chất điều hòa tăng trưởng trong quá trình tạo rễ, khi chuyển sang môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng thì cây cứng cáp và khỏe hơn với hệ thống khung hoàn chỉnh, sẵn sang cho chuyển ra và thuần hóa (Vanegas et al. 2002; Miranda-Ham et al. 2006).

Thuần hóa. Misra và Datta (1999, 2001) báo cáo rằng cây con được thuần hóa lần thứ nhất trong dung dịch Knopf và sau đó chuyển ra chậu đất trong vườn ươm. Chế độ tưới nước được giảm bớt trong 15 ngày trước khi chuyển ra đồng. Hiệu quả chuyển cây là 75%, khi cây khá nhạy cảm với điều kiện nhạy cảm bên ngoài. Cây nở hoa sau 30-45 ngày.
Vanegas et al. (2002) đề cập đến cây con được chuyển sang đất khử trùng và giữ trong phòng tăng trưởng trong một tuần. Chúng được tưới nước hai lần trong thời gian này với môi trường ½ MS có sucrose. Sau thời gian này, cây được lấy ra nhà kính, nơi chúng hoàn thành chu trình sống (kể cả ra hoa). Chúng cho thấy tần số sống sót là 100%.

Mặc khác, Miranda-Ham et al. (2006) báo cáo rằng cây con cao 4 cm, được chuyển ra chậu chứa hỗn hợp đất vô trùng và vermiculite (1:1) cho sự thuần hóa. Các chậu được phủ túi polyethylene trong suốt và giữ trong nhà kình ở nhiệt độ phòng (25-30°C), dưới chiếu sáng tự nhiên ở chỉ số photon flux là 310 mol m-2 s-1. Để ngăn ngừa sự ngưng tụ, các túi được tạo lỗ sau 1 tuần, chúng được chuyển. Ba tuần sau, cây được chuyển ra nhà ươm, đầu tiên dưới bóng râm (572 mol m-2 s-1), và ba tuần sau, tiếp xúc với ánh sáng mở (1985 mol m-2 s-1). Cây được tưới hằng ngày, và bổ sung dung dịch Hoagland mỗi ba tuần. Trong điều kiện này, tần số sống sót cao hơn 80%.

Từ các tài liệu được xem xét lại về quy trình tái sinh ở Tagetes, hiển nhiên the bottleneck là số chồi đạt được trên một mẫu, từ đó sự quan trọng cho xác định hiệu quả của hệ thống tái sinh được tiến hành. Các bằng chứng chỉ ra rằng loại mẫu là sự thay đổi chính để điều khiển: 15-20 chồi/đĩa hoa (Kothari và Chandra 1984), 12 chồi/3.65g mô sẹo từ lá (Kothari và Chandra 1986), 10 chồi/đỉnh chồi từ cây trưởng thành (Misra và Datta 1999), 15-20 chồi/lá (Misra và Datta 2000), 5.2 chồi/lá (Vanegas et al. 2002) và 66.12 chồi/ chồi từ mô sẹo (Miranda-Ham et al. 2006).

Các hệ thống khác chưa khám phá ở T.erecta có thể nâng cao số chồi trên một mẫu. Một trong số chúng là vi nhân giống thông qua tế bào lớp mỏng (TCL). Lớp mỏng tế bào tuy đơn giản nhưng hiệu quả hệ thống dựa vào kích thước mẫu nhỏ có nguồn gốc từ số tế bào hạn chế của mô đồng nhất. TCL là hệ thống hiện đại, sẽ tìm ra ứng dụng ở nuôi cấy mô và cơ quan cao hơn và chuyển gen (Teixeira da Silva 2005).

Các hệ thống khác để khám phá có thể cảm ứng phát sinh phôi soma trực tiếp, khi đạt được cấu trúc giống phôi từ nuôi cấy mô sẹo từ lá (Kothari và Chandra 1984, Bespalhok và Hattori 1998).

Sự phát triển của quy trình tái sinh in vitro hiệu quả, thông qua hính thành cơ quan và phôi, là điều kiện tiên quyết cho sự cải tiến di truyền thông qua ý nghĩa công nghệ sinh học, từ khi lợi ích của kỹ thuật di truyền perse giảm hình thành chồi và phôi trong nuôi cấy.

Trong chuyển gen thực vật, hình thành phôi soma thích hợp phát sinh cơ quan hơn, trong một số trường hợp, phôi soma có nguồn gốc từ tế bào đơn và thực vật chuyển gen dạng khảm thường ít thích hợp hơn trong phát triển. Tuy nhiên, lợi ích của mô có khả năng phát sinh phôi có thể biểu hiện một số hạn chế: nó có thể sử dụng nhiều lao động để thiết lập và duy trì nuôi cấy và phục hồi thực vật có thể mất nhiều thời gian, với các nguy cơ hình thái bất thường và vô sinh. Hệ thống này cũng yêu cầu nguồn vật liệu ổn định để nuôi cấy cảm ứng phát sinh phôi mới. Lợi thế của quy trình phát sinh cơ quan và chồi thường có thể dễ hình thành rễ. Một số mô có thể thu được sự xuất hiện trong suốt và giòn với hàm lượng nước cao (hyperhydricity – thủy tinh thể). Sự xuất hiện của tình trạng thủy tinh thể có thể ngăn cản hay hạn chế bởi điều chỉnh nguồn đường, nồng độ calcium hay sử dụng tác nhân kháng thủy tinh thể như phloridzin (Hansen vaf Wright 1999).

Mức độ sử dụng Tagetes không phá vỡ tái sinh in vitro, nó cũng được sử dụng cho các nghiên cứu trên biệt hóa và thiophene hiện diện trên nuôi cấy mô sẹo lá (Ketel 1986), ghép sự tổng hợp thiophene vào tái sinh rễ từ vết chai thân cây (Croes et al. 1989), giải phẫu mô học của mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ lá mầm (Bespalhok vaf Hattori 1999), và quyết định pyrethrin trong mô sẹo (Sarin 2004).

 

Chuyển gen của Tagetes erecta

Sản xuất thực vật biến đổi gen với mẫu ổn định và có thể dự đoán biểu hiện gen từ lâu là mục tiêu chính cho các nghiên cứu. Trong thập niên gần đây, các nỗ lực lớn trực tiếp hướng đến sự thành công của thực vật chuyển gen với các đặc điểm nông học quan trọng như kháng côn trùng và bệnh, tăng khả năng chống chịu stress môi trường (nhiệt độ, đất ngập và nhiễm mặn), chịu thuốc diệt cỏ, cải thiện độ chín của trái và sắc tố trái, cải thiện thành phần dinh dưỡng (vitamin A và sắt) hay thành phần dược tính (sản xuất vaccine ăn được). Hình dạng, chiều cao, fenology, kéo dài là những đặc tính thích hợp cho việc chuyển gen. sử dụng Agrobaterium tumefaciens, bắn phá hạt (sinh học) hay bất kỳ kỹ thuật chuyển gen khác (chuyển protoflast), có thể cho khả năng biến đổi đặc tính dược và hương của các loài có giá trị kinh tế quan trọng. Dù Agrobaterium tumefaciens được dùng như vector chuyển gen của các loài hai lá mầm (Zupan et al. 2000, Gelvin 2003) và cho các loài một lá mầm (Cheng et al. 2004), gần đây tính sinh học chuyển hướng sang một kỹ thuật mạnh để chèn DNA lạ vào tế bào thực vật, bất kể thực vật một hay hai lá mầm (Taylor và Fauquet 2002).

Hiện tại chỉ có hai báo cáo chuyển gen của Tagetes erecta (Bảng 2), Godoy-Hernandez et al (2006) báo cáo chuyển tạm thời với gen cảm ứng GUS trong 4 mẫu (đỉnh chồi, lá sơ khởi, hypocotyl và mầm rễ) từ cây nảy mầm in vitro, dùng Agrobaterium tumefaciens dòng LBA4404 và vector nhị phân pCAMBIA 2301. Plasmid chứa gen marker nptII kháng kanamycin với viền T-DNA cho chọn lọc vi khuẩn. Mặc khác để ngăn cản sự cản trở của hoạt tính GUS vi khuẩn ở tế bào Agrobaterium tumefaciens, gen chứa trình tự intron của catalase. Acetosyringone được thêm trước dùng để tạo điều kiện chuyển gen. Trong thí nghiệm chuyển gen, cây 10 ngày tuổi được chọn lọc và các mẫu khác nhau (hypocotyl, mầm rễ (dài 10mm), lá (khoảng 0.25 cm2) và đỉnh chồi) được gây vết thương theo chiều dọc và lây nhiễm thấm hút chân không. Mẫu được đặt trên môi trường MS, bổ sung 1 M IAA, 5 M BAP, 100mg/L cefotaxime và 7.5 mg/L kanamycin (pH 5.7), cho sự phát triển sau này. Biểu hiện tạm thời của Gus được xét nghiệm histochemical ở ngày thứ 3 sau khi lây nhiễm,bằng cách nuộm với X-GLUC. Trước khi đánh giá số điểm xanh trên mẫu, chúng được rửa với methanol:acetone (3:1, v/v). Mỗi điểm xanh được đánh giá như một tập trung biểu hiện GUS tạm thời (Godoy-Heenandez et al. 2006).

Một cách khác, Vanegas et al (2006) báo cáo chuyển gen ổn định của mẫu lá với uidA thông qua bắn phá hạt. Cho việc bắn, họ thực hiện trên mẫu lá (0.025cm2), nuôi cấy trên môi trường tái sinh (MS cộng 17.1 M IAA và 13.3 1 M BAP), bổ sung sorbitol và/hay mannitol, cho 2, 4 và 6 giờ. Mô được bắn sử dụng ở 4 áp suất (413.7, 551.6, 689.5 hay 827.4 kPa) và khoảng cách (7.5, 10.5, 13.5 hay 16.5 cm). Hạt được giải phóng sử dụng xung 50ms trong phòng chân không (3.73kPa). Kết quả tốt nhất được ghi nhận với khoảng cách 10.5 cm và áp lực 551.6 kPa, tạo ra 25.7 Foci trên một sự kiện.

Mẫu bắn phá được đặt trên môi trường tái sinh với 100mg/L kanamycin. Hai lăm mẫu kháng kanamycin được phân lập sau khi bắn phá, với hiệu suất 16%. Sau vòng chọn lọc lần hai trên 200mg/L kanamycin, chỉ 15 cây con (60%) được chọn lọc, cuối cùng 9% trong tổng số.

Họ cũng tiến hành phát triển các mảng xanh như sự biểu thị của tế bào chuyển gen tạm thời. Trong các biểu hiện đa dạng của chuyển gen trên cây con tái sinh trên môi trường chọn lọc, gen nptII được khuếch đại bởi PCR. Để xác nhận sự xáp nhập gen nptII và xác định số bản sao, họ phân tích 9 cây PCR dương tính bởi phân tích Southern blot sử dụng gen như một probe. Từ 9 cây PCR dương tính, 5 mẫu phân tích Southern blot dương tính (4 cây với 1 bản sao của gen nptII và 1 với ít nhất 2 bản sao), với hiệu suất cuối là 3%. Không có tài liệu tham khảo nào cho thấy có thể làm bất hoạt gen chuyển (the posibility of transgene silencing), để ổn định sinh lý của thực vật chuyển gen trong nhà kính hay các đặc tính trong các thế hệ sau. Họ đề cập tới các nghiên cứu xa hơn cần được tiến hành để tối ưu hiệu suất chuyển gen (Vanegas et al. 2006).

Rễ tơ Tagetes erecta

Rễ tơ, tương phản với các mẫu không chuyển gen, tăng trưởng nhanh, tăng trưởng plagiotropic chậm và phân nhánh nhanh chóng trên môi trường không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng. Rễ chuyển gen biệt hóa cao và và có thể sản xuất liên tục và cách thức ổn định, có nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị khi so sánh với các loại nuôi cấy thực vật khác (Hu và Du 2006).

Hệ thống rễ chuyển gen đem đến tiềm năng lớn cho cảm ứng bổ sung gen cùng với gen Ri T-DNA cho kỹ thuật của hướng hợp chất và sản xuất thành phần được quan tâm (Giri và Narasu 2000). Nuôi cấy rễ tơ axenic tăng trưởng dưới điều kiện kiểm soát làm mô hình thuận tiện để nghiên cứu hợp chất rễ và đem đến cái nhìn chi tiết của những tiếp xúc giữa rễ và sự cộng sinh hay vi sinh vật ký sinh.

Tagetes spp. sản xuất hợp chất thơm chứa sulfur như thiophene trong rễ, là chất độc với tuyến trùng khi tiêu hóa. Rễ tơ của Tagetes erecta, đạt được qua chuyển gen với A.rhizogenes dòng TR105, sản xuất (the same thiophene profile) dẫn xuất thiophene như nuôi cấy rễ bình thường và rễ của cây nguyên vẹn (Mukudan và Hjortso 1990). Trong mối liên hệ, các dòng rễ tơ chuyển gen sản phẩm khi lây nhiễm với A.rhizogenes LBA 9402, cho thấy quang phổ thiophene khác nhau khi so sánh với cây tự nhiên (Jacobs et al. 1995).
Có vài nghiên cứu trên khuẩn lạc và đáp ứng lây nhiễm bởi nấm rễ mycorrhizal (Glomus intraradices, G. mosseae và G. deserticola) ở Tagetes erecta (Linderman và Davis 2004).

Ngược lại, hầu hết các nghiên cứu trên nuôi cấy rễ tơ được thực hiện trên Tagetes patula. Nuôi cấy rễ tơ của Tagetes patula được nghiên cứu hiệu quả của ứng dụng IAA ngoại sinh trên hình thái học rễ và hợp chất thứ cấp (Arroo et al 1995), để nghiên cứu quy tắc của sinh tổng hợp thiophene dưới sự hạn chế bổ sung sulphate (Arroo et al. 1997), hiệu quả của nước trong tảo xanh (Haematococcus pluvialis) và tảo xanh lam (Spirulina platensis) trong cảm ứng tích lũy thiophene (Ramachandra Rao et al. 2001), đễ ghi nhận tăng trưởng và sản xuất thiophene trong bioreactor phun sương (Suresh et al 2005), và cũng nghiên cứu sinh tổng hợp của các dẫn xuất benzofuran (Margl et al. 2005).

Kết luận

Theo các kiến thức của các tác giả, hiển nhiên chỉ có hai báo cáo chuyển gen trên cúc, thông qua A.tumefaciens (Godoy-Hernandez et al 2006) hay bắn phá mẫu (Vanegas et al 2006). Tuy nhiên, cả hai nghiên cứu cho thấy các hệ thống có thể biến đổi T.erecta với gen quan tâm, sử dụng hệ thống tái sinh in vitro thiết lập với đỉnh chồi từ mô sẹo (Miranda-Ham et al. 2006) và lá (Vanegas et al. 2002). Chiến lược chuyển gen thực hiện phụ thuộc vào thiết bị kỹ thuật và kinh nghiệm của các nhóm nghiên cứu, vì vậy phương pháp A.tumafaciens sẽ nhất quán để có chi phí hợp lý hơn.

Về tranh luận tiếp theo trong sử dụng các hợp chất từ thực vật chuyển gen hay các sản phẩm sản xuất với các hợp chất đó, dựa vào việc sử dụng gen kháng kháng sinh như marker chọn lọc, có căn cứ để mong chờ, đem đến ứng dụng của các gen khác, như phosphomanose isomerase (Joersbo et al. 1998), hay không marker (Daley et al. 1998).

Các mối quan ngại khác là ảnh hưởng sinh thái vì ô nhiễm gen của các loài khác thông qua hạt phấn cây chuyển gen, cũng như xoay vòng bởi cách tiếp cận của chuyển gen lục lạp (Bogorad 2000; Daniell et al. 2002; Maliga 2004).
Các quan điểm
Thành phần carotenoid trong các loài cúc có thể hiện diện 100 lần khác biệt, làm chúng thành hệ thống tốt để kiểm tra quy tắc luồng thông qua con đường này (Moehs et al. 2001). Sự quan tâm của một số nhóm nghiên cứu để nâng cao sản xuất astaxanthin (carotenoid có giá trị hơn lutein) thông qua chuyển gen với gen crtW, code cho ketolase từ A.aurantiacum, dùng biobalistics.
Phần quan tâm còn lại là chuyển gen của cúc với hai gen từ con đường plastidic MEP (methyl-D-erythritol 4-phosphate): clal, code cho 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) (Mandel et al. 1996) và gen isph-code cho 1-hydroxy-2-methyl-butenyl 4-diphosphate reductase, cả hai từ A.thaliana (Guavara-Garcia et al. 2005). Các enzyme này điều khiển các điểm điều hoà chủ đạo trên hướng này và vì vậy, có vai trò tăng sự chuyển biến đến tổng hợp plastidic isoprenoid (monoterpenes gibberellin, carotenoid, chlorophyll, tocopherole, plastoquinones, phylloquinones).

Tài liệu tham khảo

Gregorio Godoy-Hernández* • María de Lourdes Miranda-Ham
Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación Científica de Yucatán, Calle 43 # 130, Chuburná de Hidalgo, Mérida, Yucatán, 97200, México

Arroo RRJ, Develi A, Meijers H, van de Westerlo, Kemp AK, Croes AF,Wullens GJ (1995) Effect of exogenous auxin on root morphology and sec-ondary metabolism in Tagetes patula hairy root cultures. Physiologia Plan-tarum 93, 233-240
Arroo RRJ, Jacobs JJMR, van Gestel JAM, Henkel H, Jannink W, CoresAF, Wullens GJ (1997) Regulation of thiophene biosynthesis by sulphate inroots of marigolds. New Phytologist 135, 175-181
Barzana E, Rubio D, Santamaría RI, García-Correa O, Garcia F, Ridaura-Sanz VE, López-Munguía A (2002) Enzyme-mediated solvent extraction ofcarotenoids from marigold flower (Tagetes erecta). Journal of Agriculturaland Food Chemistry 50, 4491-4496
Belarmino MM, Abe T, Sasahara T (1992) Callus induction and plant regene-ration in African marigold (Tagetes erecta L.). Japanese Journal of Breeding 42, 835-841
Bespalhok FJC, Hattori K  (1998) Friable embryogenic callus and somatic em- bryo formation from cotyledon explants of African marigold (Tagetes erecta L.). Plant Cell Reports 17, 870-875
Bespalhok FJC, Hattori K  (1999) Histological analysis of the development ofa friable embryogenic callus of African marigold (Tagetes erecta L.) Plant Biotechnology 16, 141-146
Bogorad L (2000) Engineering chloroplasts: an alternative site for foreigngenes, proteins, reactions and products.Trends in Biotechnology 18, 257-263
Cheng M, Lowe BA, Spencer TM, Ye X, Armstrong CL (2004) Factors influ-encing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyedonous species. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant 40, 31-45
Croes AF, Aarts AM, Bosveld M, Breteler H, Wullens GJ(1989) Control ofthiophene accumulation in calli of twoTagetes  species. Physiologia Planta-rum 76, 205-210
Daley M, Knauf VC, Summerfelt KR, Turner JC (1998) Co-transformationwith one Agrobacterium tumefaciens strains containing two binary plasmidsas a method for producing marker-free transgenic plants. Plant Cell Reports17, 489-496
Daniell H, Khan MS, Allison L (2002) Milestones in chloroplast genetic engi-neering: an environmentally friendly era in biotechnology.Trends in PlantScience 7, 84-91
Delgado-Vargas F, Paredes-López O, Avila-González E(1998) Effects ofsunlight illumination of marigold flower meal on egg yolk pigmentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry46, 698-706
Edge R, McGarvey DJ, Truscott TG (1997) The carotenoids as antioxidants –a review. Journal of Photochemistry and Photobiology B41, 189-200
Gelvin SB (2003) Improving plant genetic engineering by manipulating thehost.Trends in Biotechnology21, 95-98
Gilman EF, Howe T (1999)Tagetes erecta. University of Florida. CooperativeExtension Service. Institute of Food and Agricultural Sciences. Fact SheetFPS-569, pp 1-3
Giri A, Narasu LM (2000) Transgenic hairy roots: recent trends and applica-tions. Biotechnology Advances18, 1-22
Godoy-Hernández G, Avilés-Berzunza E, Castro-Concha L, Miranda-HamML (2006) Agrobacterium-mediated transient transformation of marigold(Tagetes erecta). Plant Cell, Tissue and Organ Culture84, 365-368
Guevara-García A, San Román C, Arroyo A, Cortés ME, Gutiérrez-NavaML, León P(2005) Characterization of the Arabidopsis clb6  mutant illus-trates the importance of posttranscriptional regulation of the methyl-D-eryth-ritol 4-phosphate pathway.The Plant Cell17, 628-643
Hansen G, Wright MS(1999) Recent advances in the transformation of plants.Trends in Plant Science4, 226-231
Hencken H (1992) Chemical and physiological behavior of feed carotenoidsand their effects on pigmentation. Poultry Sciences 71, 711-717
Hu Z-B, Du M (2006) Hairy root and its application in plant genetic engineer-ing. Journal of Integrative Plant Biology48, 121-127
Jacobs JJ, Arroo RR, De Koning EA, Klunder AJ, Croes AF, Wullens GJ (1995) Isolation and characterization of mutants of thiophene synthesis inTa- getes erecta. Plant Physiology 107, 807-814
Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT (1998) Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet.Molecular Breeding 4, 111-117
Ketel DH (1986) Morphological differentiation and occurrence of thiophenesin leaf callus cultures fromTagetes species: Relation to the growth mediumof the plants. Physiologia Plantarum 66, 392-396
Kothari, SL, Chandra N (1984) Plant regeneration from cultured disc floretsofTagetes erecta L. Journal of Plant Physiology 117, 105-108
Kothari, SL, Chandra N (1986) Plant regeneration in callus and suspensioncultures ofTagetes erecta L. Journal of Plant Physiology 122, 235-241
Linderman RG, Davis EA (2004) Varied response of marigold (Tagetes spp.)genotypes to inoculation with different arbuscular mycorrhizal fungi.Scien-tia Horticulturae99, 67-78
Maliga P (2004) Plastid transformation in higher plants. Annual Review of Plant Biology55, 289-313
Mandel MA, Feldmann KA, Herrera-Estrella L, Rocha-Sosa M, León P (1996)CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highlyconserved in evolution.The Plant Journal 9, 649-658
Margl L, Ettenhuber C, Gyurján I, Zenk ME, Bacher A, Eisenreich W (2005) Biosynthesis of benzofuran derivatives in root cultures of Tagetes patula via phenylalanine and 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate. Phytochemis-try66, 887-899
Miranda-Ham ML, Castro-Concha L, Avilés-Berzunza E, Godoy-Hernán-dez G (2006) Plant regeneration from shoot apex-derived calluses of mari-gold (Tagetes erecta L.). HortScience41, 1518-1520
Misra P, Datta SK  (1999) In vitro propagation of white marigold (Tageteserecta L.) through shoot tip proliferation.Current Science77, 1141-1144
Misra P, Datta SK  (2001) Direct differentiation of shoot buds in leaf segmentsof white marigold (Tagetes erecta L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant 37, 466-470
Moehs CP, Tian Li, Osteryoung KW, Della Penna D(2001) Analysis of carot-enoid biosynthetic gene expression during marigold petal development. PlantMolecular Biology45, 281-293
Mukudan U, Hjortso MA (1990) Thiophene content in normal and trans-formed root cultures of Tagetes erecta: A comparison with thiophene contentin roots of intact plants.  Journal of Experimental Botany41, 1497-1501
Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioas-says with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum15, 473-497
Piccaglia R, Marotti M, Grandi S(1998) Lutein and lutein ester content in dif-ferent types of Tagetes patula  and T. erecta  Industrial Crops and Products8, 45-51
Pulz O, Scheibenbogen K, Grob W (2001) Biotechnology with cyanobacteriaand microalgae. In: Rehm HJ, Reed G (Eds) A Multi-Volume ComprehensiveTreatise Biotechnology (Vol 10), Wiley-VCH Verlag, Germany, pp 107-136
Ramachandra Rao S, Tripathi U, Suresh, Ravishankar GA (2001) Enhance-ment of secondary metabolite production in hairy root cultures of Beta vul- garis andTagetes patulaunder the influence of microalgal elicitors. Food Biotechnology 15, 35-46
Robert ML, Herrera JL, Contreras F, Scorer KN(1997) In vitro propagationof Agave fourcroydes Lem (Henequen). Plant Cell, Tissue and Organ Culture8, 37-48
Romagnoli C, Bruni R, Andreotti A, Rai MK, Vicentini CB, Mares D (2005)Chemical characterization and antifungal activity of essential oil of capitulafrom wild IndianTagetes patula L. Protoplasma 225, 57-65
Sarin R  (2004) Insecticidal activity of callus culture ofTagetes erecta Fitote-rapia75, 62-64
Serrato-Cruz MA, Hernández-Rodríguez M, Savidan Y, Bárcenas-OrtegaNM (2000) DNA content and ploidy level inTagetes spp. using flow cyto-metry. Agrociencia34, 729-734
Serrato-Cruz MA (2004) Cempoalxóchitl: Diversidad biológica y usos. Cien-cia y Desarrollo en Internet. Julio-Agosto, pp 1-6. Available online: http://www.conacyt.mx/comunicacion/revista/181/articulos/pdf/Cempoalxochit.pdf
Sowbhagya HB, Sampathu SR, Krishnamurthy N (2004) Natural colorantfrom marigold-chemistry and technology. Food Reviews International  20, 33-50
Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, Isambert A (2006) Commercial ap- plications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering 101, 87-96
Suresh B, Bais HP, Raghavarao KSMS, Ravishankar GA, Ghildyal NP (2005) Comparative evaluation of bioreactor design usingTagetes patula L.hairy roots as a model system. Process Biochemistry 40, 1509-1515
Taylor NJ, Fauquet CM(2002) Microparticle bombardment: a tool in plantscience and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology21, 963-977
Teixeira da Silva JA(2005) Simple multiplication and effective genetic trans-formation (four methods) of in vitro  grown tobacco by stem thin cell layers. Plant Science169, 1046-1058
Vanegas PE, Cruz-Hernández A, Valverde ME, Paredes-López O  (2002)Plant regeneration via organogenesis in marigold. Plant Cell, Tissue and Or- gan Culture69, 279-283
Vanegas PE, Valdez-Morales M, Valverde ME, Cruz-Hernández A, Pare-des-López O  (2006) Particle bombardment, a method for gene transfer inmarigold. Plant Cell, Tissue and Organ Culture84, 359-363
Vasudevan P, Kashyap S, Sharma S (1997)Tagetes: a multipurpose plant. Bio-resource Technology 62, 29-35
Wang M, Tsao R, Zhang S, Dong Z, Yang R, Gong J, Pei Y (2006) Antioxi-dant activity, mutagenicity/anti-mutagenicity, and clastogenicity/anti-clasto-genicity of lutein from marigold flowers. Food and Chemical Toxicology44,1522-1529
Zupan J, Muth TR, Draper O, Zambryski  (2000) The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens  into plants: a feast of fundamental insights.The Plant Journal 23, 11-28

Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *