Nuôi cấy in vitro từ rễ của nhân sâm Panax ginseng và nhân sâm P quinquefolium

Bài báo mô tả phương pháp hình thành, tái tổ hợp và tiếp tục phát triển các gốc, rễ ngẫu nhiên của nhân sâm Panax ginseng và nhân sâm P. quinquefolium. Kỹ thuật này đã tận dụng hoạt tính mạnh mẽ của một loại auxin tổng hợp mới: benzo [b] selenienyl acetic acid (BSAA). Sự bắt đầu phân bố rễ phụ thuộc vào mùa, loại và nồng độ của auxin.

Các gốc rễ của nhân sâm có thể được cấy dưới đất bằng cách chuyển 4 tuần một lần đến môi trường lỏng mới hoặc trong các bình hình nón hoặc trong máy phản ứng sinh học. Các điều kiện tối ưu cho phép nhân liên tục (lên đến 14 lần mỗi tháng) được xác định. Vấn đề thực tế duy nhất là hạn chế khối lượng tươi như chất gây bệnh, tỷ lệ nhân giống giảm với số lượng rễ tăng lên. Người ta cho rằng một chất ức chế sự tăng trưởng rễ đã được giải phóng ra môi trường bằng sự tăng trưởng rễ nhân sâm.

Các từ viết tắt: BSAA – benzo [b] selenienyl acetic acid; IAA – axit indoloacetic; IBA – acid indolebutyric; MS – Murashige and Skoog medium (1962).

1.GIỚI THIỆU

Gốc rễ nhân sâm đã được sử dụng trong y học phương Đông kể từ thời cổ đại. Chiết xuất gốc rễ được biết đến nhờ bổ, kích thích và tính chất thích ứng [8] do sự hiện diện của một loạt các saponin và sapogenins [21]. Trong những năm gần đây, nhân sâm còn trở thành thức ăn bổ dưỡng ở các quốc gia phương Tây. Do đó nhu cầu về nhà máy đã tăng lên đáng kể trên toàn thế giới.

Sâm thì rất đắt vì canh tác dài hạn, thông thường (5-7 năm) và canh tác khó khăn. Vì vậy các phương pháp công nghệ sinh học, như nuôi cấy mô nhân sâm đã được thử nghiệm cho sản xuất ginsenoside trong ống nghiệm. Furuya và Ushiyama [3], Lee et al. [19] và Mathur et al. [22] có thể cho thấy rằng ginsenosides được sản xuất trong chai cũng như trong tế bào nuôi cấy nhân sâm Panax ginseng và nhân sâm P. quinquefolium. Việc sản xuất ginsenosides bằng cách chuyển hóa (với Agrobacterium rhizogenes) bằng cách chuyển đổi (với Agrobacterium rhizogenes) nuôi cấy gốc (nuôi cấy lông rễ) đã được thử [9, 10, 11, 14, 16, 17, 26, 27]. Ưu điểm của nuôi cấy lông rễ là chúng giữ lại sự khác biệt trong khi thể hiện tốc độ tăng trưởng tương đương với các tế bào thực vật bị đình chỉ. Không giống như các chất chiết xuất thực vật thường sản sinh ra một lượng nhỏ các chất chuyển hóa thứ sinh, cấy rễ lông có thể có khả năng tổng hợp cao, thường so sánh với các rễ bình thường [1, 2, 25]. Các rễ lông của nhân sâm Hàn Quốc tổng hợp các saponin giống nhau (ginsenosides) như những gốc rễ ban đầu và lên đến khoảng 2 lần nhiều hơn nuôi cấy các rễ thông thường [26]. Hơn nữa, với các điều kiện nuôi cấy các nhà nghiên cứu [17] đã có thể tăng cường các hàm lượng saponin nhân sâm được tạo ra bởi sự nuôi cấy lông rễ. Tuy nhiên, trong thực tế các sinh vật biến đổi gen hoặc các bộ phận không hấp thụ tốt thì nó như thuốc thực vật. Vì vậy, mục tiêu hiện nay là tạo ra sự nuôi cấy giống như lông mà không biến đổi với Agrobacterium rhizogenes, mà chưa bao giờ được thử. Kỹ thuật mới tận dụng axit tổng hợp mới, axit benzo [2] selenienyl acetic, cho thấy hoạt tính mạnh mẽ trong một số quá trình tăng trưởng và quá trình phát triển không kiểm soát [4, 7, 12, 18].

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu cây trồng

Một năm trồng nhân sâm Panax ginseng và nhân sâm P. quinquefolium từ Ardennes Bỉ là bắt đầu vào tháng 9 và lưu trữ trong nhà kính đến tháng 12 trong cát. Toàn bộ rễ là dài 2-3 cm khi lát cắt ngang 3 mm (đường kính: 5 mm) bị phá vỡ.

2.2 Điều kiện nuôi cấy

Củ rễ đã được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong ethanol 70% trong 5 phút, trong 1% teepol (S.A. Bỉ Shell) và 3% sodium hypochlorite trong 20 phút và cuối cùng là 30 giây trong 0,1% clorua thủy ngân và sau đó rửa lại 3 lần trong 10 phút với nước vô trùng. Môi trường lỏng MS [23] được sử dụng làm môi trường cơ bản. Nó được bổ sung bởi một axit indoleacetic, IAA (từ Merck, Darmstadt, Đức) hoặc acid indolebutyric, IBA (từ Duchefa, Haarlem, Hà Lan) hoặc axit 3-benzo [b] selenienyl), BSAA (từ Acros Organics , Geel, Bỉ)], thêm vào trước khi hấp hơi (20 phút, 121 ° C, 1,2 Kg / cm 2). Môi trường chứa 30g / l sucrose (trừ khi được chỉ định) và pH được điều chỉnh đến 5,8. Các môi trường nuôi cấy (môi trường lỏng trong bình Erlenmeyer) được duy trì trong một buồng tăng trưởng trong bóng tối ở 24 ° C và khuấy ở tốc độ 80 vòng / phút. Trong một số trường hợp cụ thể, rễ đã được bao quanh trong túi gạc để cho phép dễ dàng thay đổi môi trường.

2.3 Phản ứng sinh học trong nuôi cấy

Tiêm vô trùng được đặt vô trùng vào một lọ sinh học Biolafitte 2l chứa 1,5l chất trung gian MS. Bồn thủy tinh kép có tường kép với nhiệt độ được duy trì ở 25 ° C. Nuôi cấy trong bóng tối với sự kích động là 80 vòng / phút. PO2 và pH được theo dõi trong quá trình nuôi cấy.

3. KẾT QUẢ

3.1 Xây dựng quy trình nuôi cấy rễ

Lát một củ rễ đã được nuôi cấy trong bóng tối trong MS chất lỏng bổ sung với auxin (IAA, BSAA) ở các nồng độ khác nhau (10-6 đến 10-9 M). Thử nghiệm tương tự đã được thực hiện vào tháng 9 và tháng 12. Chỉ trong trường hợp cuối cùng này và với sự có mặt của BSAA ở 10-6 M, 42% các bón phân của P.quinquefolium và 34% của P. ginseng phát triển tương ứng từ 3 đến 7 và 2 đến 4 rễ (± 1 cm) trong mot thang. Trong các điều kiện khác, không có rễ được hình thành nhưng các phế quản tăng lên và một số calli xuất hiện ở nồng độ auxins 10-7 và 10-8 M.

Rễ được cắt từ các chất thải và nuôi cấy trong cùng một môi trường lỏng MS bổ sung với BSAA ở 10-6 M. Trong một tháng, mỗi rễ phát triển ± 10 rễ mới. Chiều dài của chúng từ 1 đến 2 cm.

Đối với các nuôi cấy tiếp theo, ba loại phương pháp cắt gốc được kiểm tra (Bảng 1):

– Cắt từng gốc riêng biệt từ gốc ban đầu bằng kìm.

– Cắt ± 10 cành trên một cành cây ban đầu (cắt nhanh), bằng lưỡi dao cạo.

– Chuyển toàn bộ các phần rễ phát tiển vào một môi trường mới và không cắt.

Việc cấy truyền của các rễ phát triển vào một mới không tạo ra các rễ bên. Không có sự gia tăng trọng lượng của rễ cấy trong một tháng sau khi chuyển. Việc “depilation” là một kỹ thuật tiêu tốn nhiều lao động mà không cho kết quả tốt hơn (tỷ lệ nhân và khía cạnh) so với việc cắt nhanh. Tỷ lệ nhân lên đến khoảng 15, nhưng nhiều hơn đối với P. ginseng so với P. quinquefolium. Việc biểu hiện các kết quả theo số lượng hoặc bởi FW là tương tự. Trong các thí nghiệm tiếp theo, các chất thải được chuẩn bị bằng cách cắt nhanh và kết quả của tỷ suất nhân thể biểu hiện bởi FW.

Bảng 1. Ảnh hưởng của các phương pháp cắt lên tỷ lệ nhân (thể hiện bằng trọng lượng tươi và số lượng rễ mới) của rễ (0.4 gl-1) của Panax ginseng và P. quinquefolium sau một tháng nuôi cấy, trong môi trường MS lỏng bổ sung với BSAA 10-6 M trong bóng tối Panax ginseng và Panax

3.2 Ảnh hưởng của auxin ngoại sinh

Ảnh hưởng của ba auxin ngoại sinh (IAA, IBA và BSAA) ở các nồng độ khác nhau đã được kiểm tra trên tỷ lệ nhân giống của rễ lông. Bảng 2 cho thấy rằng kết quả tốt nhất thu được với BSAA ở 10-6 M. Hàm lượng BSAA cao hơn hoặc thấp hơn làm giảm tỷ lệ nhân. Với sự hiện diện của BSAA ở độ tuổi 10-5 M, rễ của chúng lớn hơn và ngược lại với BSAA ở 10-7 M, chúng mỏng. Trong sự hiện diện của IAA, không có sự hình thành của rễ mới, nhưng chỉ là một sự mở rộng của gốc, điều này giải thích sự tăng gấp đôi trọng lượng sau một tháng. Khi IBA (10-7 và 10-6 M) được sử dụng, kết quả tốt hơn nhưng gốc chỉ chủ yếu mở rộng và chỉ trong một vài trường hợp, các gốc rễ mới được hình thành.

Bảng 2. Ảnh hưởng của auxin được thêm vào môi trường MS lỏng vào tỷ lệ nhân (biểu hiện bằng FW) của rễ nhân sâm Panax và Panax quinquefolium (0,4 g.l-1 như đầu bón) sau một tháng trong bóng tối (n.d .: không xác định)

3.3 Ảnh hưởng của các loại đường

Fructose và glucose, thay cho sucrose, cũng đã được thử nghiệm trong môi trường MS bổ sung BSAA ở 10-6 M nhằm mục đích tăng tỷ lệ nhân giống của lông rễ Panax và Panax quinquefolium (Bảng 3). Fructose và glucose bằng cách nào đó làm tăng FW của gốc rễ đã được cấy. Sự hình thành rễ mới chỉ xảy ra khi có sucrose.

Bảng 3. Ảnh hưởng của các loại đường (30g.l-1) về tỷ lệ nhân (biểu hiện bằng FW) của rễ nhân sâm Panax ginseng và Panax quinquefolium (0.4 g.l-1) sau một tháng nuôi cấy, trong bóng tối

3.4 Ảnh hưởng của mật độ vật liệu

Các kiểm tra được thực hiện trong 250 ml bình Erlenmeyer chứa 100 ml môi trường MS bổ sung với BSAA 10-6 M. Số lượng rễ khác nhau được sử dụng: 0,04 g (± 30 gốc), 0,10 g (± 75 gốc) hoặc 0,25 g (± 180 gốc).

Tỷ lệ nhân lên gấp 10 lần với 0,04 g chất tươi / 100 ml nhưng giảm với sự gia tăng số lượng rễ. Trong điều kiện cuối cùng, chỉ có sự giãn nở gốc (hình 1).

Các thiết bị phản ứng sinh học (1,5 lít môi trường) được tiêm với 0.4 đến 3 g rễ Panax quinquefolium và môi trường không bị thay đổi trong suốt 4 tuần nuôi cấy.

Sau 4 tuần nuôi cấy, không có sự gia tăng trọng lượng. Như đã thấy trong các nền văn hoá Erlenmeyer, tỷ lệ nhân là cao hơn khi số lượng vi khuẩn nhỏ (khảo nghiệm 1, Bảng 5) và giảm khi vi khuẩn tăng lên. Vì vậy, nó thấp hơn trong bình Erlenmeyer. Sự hình thành rễ mới là rất nghèo; rễ cũ sưng lên.

3.5 Ảnh hưởng của các hợp chất hấp phụ

Đối với nuôi cấy rễ công nghiệp trong một lò phản ứng sinh học, có vẻ như 0,4 g rễ của môi trường, được xác định là lượng tối ưu, là quá nhỏ. Số lượng nhỏ này không thể tiêu thụ hoàn toàn một phần của môi trường. Chúng tôi đề nghị rằng rễ phát hành chất trong môi trường mà ức chế sự phát triển của rễ.

Polyvinylpyrrolidon (PVP, Fluka K30, Buchs, Zwitzerland) và than hoạt tính (AC, Vel, Leuven, Bỉ) đã được thêm vào môi trường để kiểm tra hiệu quả của các hợp chất hấp phụ đối với sự phát triển của lông củ của nhân sâm Panax và nhân Panax quinquefolium nhân tỷ lệ đạt được với BSAA trong 2 tuần đầu tiên cao hơn khi sử dụng BSAA trong 3 hoặc 4 tuần (ở điều 2 và 3). Các kết quả thu được khi BSAA đã có mặt trong tuần thứ 1 và thứ 3 tương tự như các thử nghiệm với BSAA hiện diện trong 2 tuần đầu tiên.

Hình 1. Ảnh hưởng của số lượng rễ (1: 0,04 g, 2: 0,10 g, 3: 0,25 g) nuôi cấy trong 100 ml môi trường MS bổ sung với BSAA 10-6 M trong suốt một tháng, trong bóng tối.

Bảng 5. Sản xuất rễ của Panax quinquefolium trong máy phản ứng sinh học. Trong kiểm tra cuối cùng, môi trường được đổi mới mỗi tuần.

3.6 Ảnh hưởng của việc tái tạo định kỳ

Trong những thí nghiệm này, để cho phép tái tạo dễ dàng môi trường trung bình, 0,06 g rễ đã được đặt trong túi gạc ở môi trường 100 ml. Khi môi trường thay đổi mỗi tuần (Bảng 6, điều kiện 2), một sự gia tăng nhỏ của tỷ lệ nhân là quan sát thấy (chỉ có 15% cho rễ Panax quinquefolium). Khi thử nghiệm tương tự được thực hiện trong máy phản ứng sinh học (khảo nghiệm 4, bảng 5), tỷ lệ nhân giống đã được cải thiện (trên 12).

Việc gia hạn trung bình hàng tuần cũng cho phép kiểm tra BSAA trong quá trình nhân bản gốc (Bảng 6). Có vẻ như BSAA cần thiết trong 2 tuần đầu tiên (điều 4); tỷ lệ nhân trong trường hợp này là tốt hơn so với khi BSAA đã được sử dụng chỉ trong một tuần (điều kiện 5). Hơn nữa, tỷ lệ nhân với BSAA trong 2 tuần đầu tiên cao hơn khi sử dụng BSAAtrong 3 hoặc 4 tuần (khoản 2 và khoản 3). Các kết quả thu được khi BSAA có mặt trong tuần thứ 1 và thứ 3 tương tự như các thử nghiệm của BSAA hiện tại trong 2 tuần đầu tiên.

Bảng 6. Ảnh hưởng của việc thay đổi môi trường (từ 2 đến 7) đối với tỷ lệ nhân (biểu hiện bằng FW) của rễ nhân sâm Panax ginseng và Panax quinquefolium trong một túi gạc(0,06 g) trong môi trường 100 ml (trong 250 ml bình Erlenmeyer). Thử nghiệm 1: không thay đổi môi trường;BSAA: môi trường MS bổ sung với BSAA 10-6 M; 0: môi trường MS không có BSAA.

4. KẾT LUẬN

Các nghiên cứu trước đây về Panax quinquefolium và Panax ginseng với gốc rễ [27], cánh hoa dẻo [27] hoặc lá mầm [20] đã chứng minh rằng rễ lông có thể thu được sau khi nhiễm trùng bởi A. rhizogenes hoặc A. tumefaciens. Tuy nhiên, rễ lông yêu cầu phytohormones trong môi trường cho sự tăng trưởng thỏa đáng [16]. Trong nghiên cứu này, sử dụng rễ phát triển, lông giống như rễ thu được mà không có nhiễm trùng do Agrobacterium. Cơ sở này phụ thuộc vào mùa và auxin được sử dụng trong môi trường ban đầu. Các cội rễ giống như lông cừu chỉ đạt được vào tháng 12 trên môi trường chất lỏng MS có chứa BSAA 10-6 M. BSAA là chất tổng hợp auxin có hiệu quả auxin như hoạt động [5, 7, 18]. Rễ được cấy dưới đất bằng cách chuyển 4 tuần một lần đến cùng môi trường tươi sau khi cắt nhanh (± 10 giâm hom). Tỷ lệ nhân được ghi nhận trong trường hợp này (Bảng 1) cao hơn nhiều so với tỷ lệ thu được sau khi nhiễm Agrobacterium bởi [26]. Các thử nghiệm khác nhau được thực hiện để tăng tỷ lệ nhân của rễ lông (loại và mức độ của auxins (Bảng 2) và đường (Bảng 3)) nhưng kết quả cho thấy môi trường tốt nhất là lần đầu tiên được sử dụng.

Một vấn đề đã được xác định khi mật độ của rễ lông được tăng lên. 0,4 g rễ trên một lít là số lượng tốt nhất trong môi trường flask Erlenmeyer (Bảng 4). Hiện tượng tương tự đã được quan sát thấy trong bioreactors (Bảng 5). Hai giả thuyết có thể giải thích hiện tượng này; thứ nhất là sự cạn kiệt chất dinh dưỡng của môi trường. Tuy nhiên, điều này không được giải thích bởi một lượng rễ thấp như vậy. Khả năng thứ hai là rễ thải độc chất vào môi trường. Để kiểm tra khả năng cuối cùng này, hai loại xét nghiệm được thực hiện:

– Các chất hấp phụ như polyvinylpyrrolidon hoặc than hoạt tính đã được thêm vào môi trường; điều này không có hiệu quả (Bảng 4);

– Các chất liệu đã được đổi mới mỗi tuần. Trong trường hợp này, tốc độ nhân tăng chậm (Bảng 6) với nhiều chất liệu hơn nhưng không thể so sánh với tỷ lệ nhân với một lượng rễ. rất nhỏ Hơn nữa, tỷ lệ nhân của rễ được đặt trong một túi gạc (đối với thử nghiệm thay đổi vừa) là rất nhỏ so với các thí nghiệm tương tự mà không có túi (3.5 cho 0,06 g rễ nhân sâm P. trong 100 ml trong túi gạc / 7,4 cho 0,1 g P. nhân sâm rễ trong 100 ml không có túi).

Ngược lại, hiệu quả của sự gia hạn trung bình trong một lò phản ứng sinh học là rõ ràng: tỷ lệ nhân là tốt hơn khi môi trường được thay đổi mỗi tuần. Trong bình Erlenmeyer, hiệu quả tích cực của việc tái tạo vừa phải có thể được chống lại bởi một hiệu ứng gần gũi của rễ trong túi.

Tỷ lệ nhân thấp quan sát thấy khi số lượng rễ tăng lên dẫn đến giả thuyết rằng một “chất độc hại” đã bị loại bỏ trong môi trường bằng rễ.

Các thử nghiệm gia hạn vừa cho thấy rằng BSAA không cần thiết trong suốt thời kỳ nuôi cấy. Kết quả tốt nhất thu được khi BSAA đã có mặt trong 2 tuần đầu và vắng mặt sau đó. Người ta biết rằng auxin là cần thiết cho sự phát triển của rễ nhưng chỉ trong giai đoạn khởi phát rễ [6, 13, 24]. Sau giai đoạn khởi phát, auxin không còn cần thiết nữa. BSAA là một chất tổng hợp auxin mạnh [4] được sử dụng để rễ cây bị rễ cứng [12]. Trong nuôi cấy nhân sâm in vitro, BSAA cũng là một auxin hiệu quả cho việc thành lập và nhân giống lông gốc. Sự có mặt của nó là cần thiết ngay từ đầu của nền văn hoá nhưng nó có thể không cần thiết cho phần thứ hai của nền văn hoá. Việc sử dụng một auxin tổng hợp như vậy cho sự bắt đầu của rễ giống như lông, khi không có Agrobacterium rhizogenes, do đó là một loại thủ tục mới có thể hữu ích cho việc sản xuất khối lượng tươi và để thử nghiệm sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp.

Lời cảm ơn

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi “Région Wallonne”. Hợp đồng số 2380. Sự trợ giúp rất nhiều của V. Pickny và B. De Muyt.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dunlop D and Curtis W (1991) Synergistic response of plant hairy-root cultures to phosphate limitation and fungal elicitation. Biotechnol Prog 7: 434–438

2. Flores H and Medina-Bolivar F (1995) Root culture and plant natural products: “Unearthing” the hidden half of plant metabolism. Plant Tissue Cult and Biotechnol 1: 59–74

3. Furuya T and Ushiyama K (1994) Ginseng production in cultures of Panax ginseng cells. In: Shargool PD and Ngo TT (eds) Biotechnological Application of Plant Cultures. USA: CRC Press, pp 1–22

4. Gaspar Th (1995) Seleniated forms of indolylacetic acid. New powerful synthetic auxins. Acros Organics Acta 1: 65–66

5. Gaspar Th, Kevers C, Penel C, Greppin H, Reid D and Thorpe TA (1996) Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue cultures. In Vitro Cell Dev Biol Plant 32: 272–289

6. Hausman JF, Kevers C and Gaspar Th (1994) Involvement of putrescine in the inductive rooting phase of poplar shoots raised in vitro. Physiol Plant 92: 201–206

7. Hofinger M, Thorpe Th, Bouchet M and Gaspar Th (1980) Auxin-like activity of (benzo(b) selenienyl-3) acetic acid. Acta Physiol Plant 2: 275–280

8. Hu SY (1976) The genus Panax (ginseng) in Chinese medicine. Econ Bot 30: 11–28

9. Hwang B and Ko KM (1989) Induction and culture of hairy roots from ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) roots discs by A. rhizogenes. Kor J Biotechnol Bioeng 4: 288–292

10. Hwang B, Ko KM, Hwang KH, Hwang SJ and Kang H (1991) Production of saponin by hairy root cultures of ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) transformed with Agrobacterium rhizogenes. Kor J Bot 34: 289–296

11. Hwang B, Ko KM, Yang DC, Park JC and Choi KT (1997) The enhancing method of ginsenoside production for hairy root mass cultures of ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer). In: Altman A and Waisel Y (eds) Biology of Root Formation and Development. New York: Plenum Press, p. 325

12. Kevers C, Bringaud C, Hausman JF and Gaspar Th (1997) Putrescine involvement in the inductive phase of walnut shoots rooting in vitro. Saussurea 28: 47–57

13. Kevers C, Hausman JF, Faivre-Rampant O, Evers D and Gaspar Th (1997) Hormonal control of adventitious rooting: Progress and questions. J Appl Bot/Angew Bot 71: 71–79

14. Ko KM, Song JJ, Hwang B and Kang YH (1993) Cytogenetic and histological characteristics of ginseng hairy root transformed by Agrobacterium rhizogenes. Kor J Bot 36:75–81

15. Ko KM, Ahn JC, Hwang SJ, Kang YH and Hwang B (1993) Production of secondary metabolites from hairy root of Panax ginseng transformed by Agrobacterium rhizogenes. II. Improvement of saponin contents and mass cultures of ginseng hairy root. Kor J Plant Tissue Cult 20: 41–46

16. Ko KM, Choi YS and Hwang B (1994) Production and identification of anthocyanin in hairy root cultures of ginseng. J Plant Biol 37: 85–91

17. Ko KM, Yang DC, Park JC, Choi KJ, Choi KT and Hwang B (1996) Mass culture and ginsenoside production of ginseng hairy root by two-step culture process. J Plant Biol 39: 63–69

18. Lamproye A, Hofinger M, Berthon JY and Gaspar Th (1990) [Benzo(b)selenienyl-3] acetic acid: A potent synthetic auxin in somatic embryogenesis. Comptes Rendus Acad Sc Paris Sér III 311: 127–132

19. Lee JS, Ko KM, Ahn JC, Bai DG, Park KY, Ko R and Hwang B (1994) High yield saponin production by mass cultures of ginseng tranformed tissue. I. Induction, culture of transformed tissue and selection of high-saponin-producing clones in ginseng. Kor J Biotechnol Bioeng 9: 157–164

20. Lee HS, Kim SW, Li KW, Eriksson T and Liu JR (1995) Agrobacterium-mediated transformation of ginseng (Panax ginseng) and mitotic stability of the inserted β-glucuronidase gene in regenerants from isolated protoplasts. Plant Cell Rep14: 545–549

21. Li TSC (1995) Asian and American ginseng: A review. HortTechnology 5: 27–34

22. Mathur A, Shukla N, Pal M, Ahuja PS and Uniyal GC (1994) Saponin production in callus and cell suspension cultures of Panax quinquefolium. Phytochem 34: 1221–1225

23. Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473–497

24. Ripetti V, Kevers C and Gaspar Th (1994) Two successive media for the rooting of walnut shoots in vitro. Changes in peroxidase activity and in ethylene production. Advances Hortic Science 8: 29–32

25. Signs M and Flores H (1990) The biosynthetic potential of plant roots. BioAssays 12: 7–13

26. Yoshikawa T and Furuya T (1987) Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell Rep 6: 449–453

27. Yoshimatsu K, Yamaguchi H and Shimomura K (1996) Traits of Panax ginseng hairy roots after cold storage and cryopreservation. Plant Cell Rep 15: 555–560

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *