Peptone kích thích tạo chồi và rễ in vitro của bơ Persea americana Mill

Ảnh hưởng của peptone lên sự tạo chồi và rễ của quả bơ in vitro từ đoạn thân non hoặc thân trưởng thành được nghiên cứu. Cả mẫu trưởng thành và mẫu non đã được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của peptone khi tái sinh chồi. Các mẫu vật sẽ bị hoại tử nếu không có môi trường Murashige và Skoog (MS) hoặc với các chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật.

Trong môi trường MS bổ sung cả peptone và benzyladenine hoặc acid dichlorophenoxyacetic, các mẫu tồn tại nhưng chậm lại đáng kể trong quá trình tạo chồi. Thêm peptone vào môi trường với lượng tối ưu là 2.0% (w / v) gây ra sự hình thành chồi. Sự hình thành chồi cũng xảy ra ở các phần thân từ mẫu trưởng thành nhưng tỷ lệ tái sinh vẫn còn thấp. Tất cả các chồi xuất phát từ thân non sẽ hình thành rễ trên môi trường bổ sung với peptone và axit naphthaleneacetic.

# 2007 Elsevier B.V. Tất cả các quyền được bảo lưu.

Từ khoá: In vitro; Peptone; Persea americana Mill.; sự bén rễ ; tái sinh chồi

1. GIỚI THIỆU

Bơ (Persea americana Mill.) là loài quan trọng nhất về kinh tế của họ Lauraceae với tổng sản lượng trên thế giới là hơn 2,5 triệu tấn vào năm 2001 (FAOSTAT, 2001). Do đó, sự phát triển hiệu quả của cây này là rất cần thiết của ngành công nghiệp bơ; tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu nuôi cấy in vitro chứng tỏ rằng nuôi cấy mô bơ rất khó khăn vì mô của nó dễ bị sạm màu và sau đó bị hoại tử (Castro và cộng sự, 1995).

Trước đây, vi nhân giống bằng cách sử dụng đầu chồi từ cây bơ đã được báo cáo bởi Nel et al. (1982). Mô sẹo có thể thu được từ các người thu gơm bơ khác nhau nhưng các mô không gây hình thái (Schroeder, 1956, 1961, 1971, 1975, 1980, Blumenfeld và Gazit, 1971). Sự nhân giống của bơ chủ yếu là do ghép đôi, một quá trình tốn kém và tốn thời gian (Brokaw, 1987); và các mẫu chưa trưởng thành được sử dụng trong ống nghiệm để lấy rễ bằng các thiết bị cắt nhỏ (Pliego-Alfaro et al, 1987). Tuy nhiên, việc sử dụng bã bơ non có bất lợi về sự biến đổi di truyền do việc nhân giống hạt giống trước đây của cây trồng (Castro và cộng sự, 1995). Do đó, việc tái tạo hiệu quả từ các bã bơ trưởng thành sẽ vượt qua vấn đề này. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu tái sinh chồi từ các phần thân non và trưởng thành trong cơ thể và phát hiện ra rằng peptone đơn thuần đã có thể tăng cường không chỉ sự sống còn của các loài thực vật mà còn có tác dụng cho sự hình thành và phát triển của chồi và rễ.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu thực vật

Vật liệu non là mầm (25-30 cm) phát triển từ hạt bơ (P. americana Mill.) Được nảy mầm trong 2 tháng trong điều kiện nhà kính. Các vật liệu trưởng thành sẽ được phát triển từ cuối đầu chồi (30-35 cm) cắt bỏ từ một cây 10 năm tuổi của một vườn đầy đủ cây trồng tại Viện Sinh học Đà Lạt (Việt Nam). Sau khi loại bỏ lá, cả mẫu non và mẫu trưởng thành đều được khử trùng bề mặt bằng bột tẩy rửa đã pha loãng (1% w / v, Viso, Việt Nam) trong 20 phút, rửa bằng nước máy chạy trong 1 giờ và khử trùng trong 70 % ethanol trong 30 giây và rửa lại hai lần trong nước cất vô trùng. Sau đó, chúng được ngâm trong một dung dịch HgCl2 1% có chứa hai hoặc ba giọt Tween 80 trong vòng 7 phút và rửa ba lần trong nước cất vô trùng. Các mẫu sau khi tiệt trùng được cắt thành các phần thân dài 1-1,5 cm với một nụ bên ngoài trước khi cấy vào môi trường rắn. Mẫu non và trưởng thành được sử dụng để thử nghiệm tái sinh củ và chỉ những chồi non xuất phát từ cây non được sử dụng để bắt đầu thí nghiệm.

2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Đối với sự tạo chồi, các mẫu được đặt trong 250 ml môi trường nuôi cấy ngoài chứa 30 ml môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) thì còn chứa 2,2 mM các chất điều chỉnh tăng trưởng cây trồng như BA hoặc 2,4-D. Môi trường cũng chứa 3% (w / v) sucrose, 8% (w / v) agar và nồng độ khác nhau của peptone (0,0, 1,5, 2,0 hoặc 3,0%, w / v). Đối với sự kích thích gốc, những chồi 3 tháng tuổi thu được trên môi trường tái sinh được nuôi cấy trong 500 ml bao gồm 80 ml môi trường MS có chứa peptone 2,0% (w / v) và NAA 2,7 mM. Các sản phẩm được ủ ở 25-280C và độ ẩm tương đối 70-75% dưới 10 giờ quang hợp với mật độ photon quang hợp 2500 lx được cung cấp bởi đèn huỳnh quang trắng mát. PH của môi trường được điều chỉnh đến pH 5,7 trước khi thêm agar và tự đông ở 121 8C trong 30 phút dưới 1 atm.

2.3. Thu thập dữ liệu và phân tích thống kê

Tạo chồi (SR), chiều cao chồi (SH) và số chồi được ghi lại sau 50 ngày hoặc 5 tháng nuôi. Chiều dài rễ và số lượng rễ của cây con 5 tháng tuổi được xác định. Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 50 lần thăm dò và được thực hiện trong ba lần, dữ liệu được phân tích theo ý nghĩa thử nghiệm đa phạm của Duncan (Duncan, 1995).

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng trưởng đến tái sinh và phát triển chồi

Môi trường MS chứa các yếu tố tăng trưởng được kiểm tra tạo chồi từ mẫu bơ non và trưởng thành được chuẩn bị như mô tả trong Phần 2. T1 (môi trường ), T2 (môi trường MS chứa BA), T3 (môi trường MS chứa 2,4-D) và T5 (môi trường MS chứa peptone và BA) không cho phép tái sinh chồi. Các phân tách trên T1 và T2 trung bình chuyển sang màu nâu và hoại tử, trong khi ở trên T5 sống sót trung bình nhưng bị mất khả năng tái sinh. Tuy nhiên, trên T6 (môi trường MS chứa peptone và 2,4-D) tái sinh chồi dc phô bày ở một tỷ lệ thấp và tăng trưởng chậm. Bổ sung chỉ peptone vào môi trường MS (T4) chồi tái sinh và phát triển tốt với chiều cao 65 mm sau 5 tháng ấp (Bảng 1, Hình 1a).

Gorzalez-Rosas và Salazar (1984), Pliego-Alfaro et al. (1987) và Barcelo’-Munooz và các cộng sự (1990) cho rằng môi trường MS có thể gây ra độc tính trong quá trình trồng bơ in vitro, có thể giải thích bằng sự hoại tử của các mẫu vật. Việc bổ sung peptone và 2,4-D và / hoặc BA trong môi trường T5 và T6 không thích hợp cho sự phát triển của mô và hình thành bơ. Tuy nhiên, sự kết hợp của peptone và 2,4-D (T6) tạo ra một chút kích thích. Auxin (kết hợp với cytokinin) có thể thúc đẩy sự hình thành mọc và sự hình thành các meristems đỉnh đỉnh mới từ nhu mô (Gutierrez và cộng sự, 2005), do đó sự hình thành các khối bị chậm phát triển trên môi trường T6 có thể được gây ra bởi hiệu quả kết hợp của bổ sung 2,4 -D và cytokinin nội sinh.

BA được sử dụng trong môi trường tạo chồi từ bơ (Barcelo’-Munhyot et al., 1990, Capote de Sol et al., 2000) và sự kéo dài của thân cây (Cooper, 1987, Witjaksono và cộng sự, 1999). Tuy nhiên, khi sử dụng ở nồng độ cao trong môi trường nhân giống và / hoặc trong việc duy trì môi trường, BA đã ức chế sự tăng trưởng hoặc giảm chiều dài chồi, hoặc cả hai (Barcelo’-Munooz và Pli-Alfaro, 2003).

Việc đưa các chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật vào môi trường MS hoặc môi trường MS có chứa peptone không tạo ra sự hình thành mong muốn. Do đó, chúng tôi thử nghiệm môi trường chỉ chứa peptone.

Bảng 1 So sánh ảnh hưởng của peptone và BA hoặc 2,4-D đối với sự tái sinh chồi của cá thể sau 5 tháng nuôi cấy

Thí nghiệm các mẫu vật non được đặt trên môi trường MS (cơ sở) hoặc môi trường MS được bổ sung với peptone (2%) và / hoặc các chất điều chỉnh tăng trưởng cây trồng được chỉ định. Chiều cao chồi (SH) và tái sinh chồi(SR) sau 5 tháng nuôi cấy được báo cáo. một ký tự khác nhau trong một cột cho thấy sự khác biệt đáng kể ở P = 0,05 theo thử nghiệm đa phạm của Duncan.

3.2. Ảnh hưởng của peptone lên tái sinh chồi

Trên môi trường MS (không có bổ sung peptone), các mẫu vật có màu nâu và bị hoại tử (Hình 1e). Tuy nhiên, bổ sung peptone (2,0%) gây ra sự hình thành chồi sau 50 ngày nuôi cấy (Bảng 2, hình 1b-d). Trên môi trường này, các chồi phát triển đồng nhất với độ dài trung bình cao nhất. Trước đây, peptone được sử dụng làm nguồn carbon và nitơ cho nuôi cấy mô thực vật. Người ta cho rằng ở một nồng độ hiệu quả, các nguồn nitơ hữu cơ và phi vô cơ có thể thúc đẩy sự phát triển của các chất thải (Chen và Chang, 2002). Gần đây, vai trò đặc biệt của peptone như một yếu tố làm tăng sự phát triển của mô thực vật đã được quan sát thấy. Khi được sử dụng trong môi trường ban đầu, peptone hoạt động như một yếu tố gợi ý về sự hình thành rễ sâm (Sivakumar và cộng sự, 2005) và sự sản sinh Oncidium của phôi (Chen và Chang, 2002). Seyring (2005) cho rằng 0,25% (w / v) peptone thích hợp cho sự khác biệt và sự nảy mầm của Cyclamen. Mặt khác, nụ hoa của Dianthus có đông lạnh đòi hỏi hàm lượng peptone cao hơn (3,0%) (Seiki và cộng sự, 1993). Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng peptone 2,0% trong môi trường MS là đủ nhất để tái sinh củ quả bơ. Đây là một môi trường đơn giản và chi phí thấp cho việc nuôi cấy mô bơ mà không cần các chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật

Bảng 2 Ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của peptone khi tái sinh củ từ mẫu non sau 50 ngày nuôi cấy

Mẫu vật non được đặt trên môi trường MS có chứa một lượng peptone. Chiều cao và chiều cao chồi (SR) trong 50 ngày nuôi cấy trên môi trường MS chứa peptone (2%) được báo cáo. một ký tự khác nhau trong một cột cho thấy sự khác biệt đáng kể ở P = 0,05 bằng thử nghiệm biến thiên của Duncan.

Hình 1. Chồi bơ và sự hình thành rễ trong ống nghiệm. (a) Chồi bơ sau 5 tháng nuôi. (b) – (e) Các chồi được hình thành từ mẫu vật non trong môi trường MS chứa 1,5, 2,0, 3,0 và 0,0% của peptone. (f) Tạo chồi rễ trên môi trường MS rắn được bổ sung 2,0% peptone cộng với 2,7 nM NAA.

3.3. Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu thực vật lên tái sinh chồi

Độ tuổi của mẫu có ảnh hưởng đến số lượng cũng như chiều cao của chồi. Mẫu bơ còn non và trưởng thành đều có thể tái sinh chồi sau 50 ngày nuôi cấy (Bảng 3, hình 1f và g). Tuy nhiên, tốc độ tái sinh của mẫu non cao hơn nhiều so với mẫu trưởng thành. Mặc dù các phôi trưởng thành đã hình thành chồi nhưng chúng phát triển chậm. Nó đã được báo cáo rộng rãi đối với nhiều loại thực vật mà các mẫu non thường cho phản ứng in vitro cao hơn so với những mẫu phát triển trưởng thành, trong một số trường hợp như mía, chanh dây và dầu không hình thành ngay cả mô sẹo (Virupakshi và cộng sự, 2002, Becerra và cộng sự, 2004, Quraishi và cộng sự, 2004). Ngoài ra, chồi được tái tạo từ phôi trưởng thành không có chất lượng thỏa đáng và sau một thời gian sinh sôi nảy nở, các chồi có các triệu chứng hoại tử, dẫn đến chết sau đó (Harty, 1985, Cooper, 1987, Capote de Sol et al, 2000). Hoại tử là một vấn đề chính trong việc nhân rộng các phôi trưởng thành. Pliego-Alfaro et al. (1987) đã ngăn ngừa hoại tử ở gốc ghép IV-8 bằng phương pháp pha loãng (môi trường rắn và lỏng) và quan sát thấy rằng các phôi trưởng thành đã giữ được khả năng tái sinh và sự phát triển của chồi. Ngoài ra, các các phôi được sản xuất mô sẹo sẽ được đông lạnh (Pliego-Alfaro và cộng sự, 1987). Zirari và Lionakis (1994) sử dụng môi trường MS bổ sung BA (2.9 và 0.4 mM trong các pha rắn và lỏng tương ứng) để nhân lên một số cây trưởng thành (giống Fuerte, Hass, Topa-Topa và Duke). Tuy nhiên, chúng không cho thấy các đặc tính của nuôi cấy mô. Trong thử nghiệm của chúng tôi, các phôi trưởng thành của bơ có thể tái tạo trên môi trường MS chứa peptone, mặc dù nó có hiệu suất thấp hơn so với những phôi non. Đặc tính này giúp ích cho khả năng hình thành rễ của các chồi vì đây có thể là dấu hiệu cho sự thành công trong tương lai của việc nhân giống bơ.

Bảng 3 So sánh khả năng tái sinh chồi của nguyên liệu thực vật trên môi trường MS chứa 2% peptone

Chiều cao chồi (SH) và sự hồi phục chồi (SR) ở nền văn hoá 50 ngày tuổi trên môi trường MS chứa peptone (2%) được báo cáo.Một chữ khác nhau trong một cột chỉ ra sự khác biệt đáng kể ở P = 0,05 bằng thử nghiệm biến thiên của Duncan.

Bảng 4 Ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của peptone lên sự hình thành rễ của các phôi non sau 5 tháng nuôi cấy trên môi trường MS 2,7 mM NAA

Chồi được tạo ra từ những phôi non được đặt trên môi trường MS đã được bổ sung với NAA khi không có hoặc có mặt của peptone. Kết quả sau 5 tháng nuôi cấy được ghi lại. Một chữ khác nhau trong một cột chỉ ra sự khác biệt đáng kể ở P = 0,05 bằng thử nghiệm biến thiên của Duncan.

3.4. Ảnh hưởng của peptone lên sự hình thành rễ

NAA được sử dụng như là một yếu tố giúp cho sự bén rễ của Hass và Hopkins dẫn đến sự phát triển 100% cấy ghép cây con, và các cây có rễ đã cho thấy sự sống còn và tăng trưởng sau đó (Cooper, 1987). Do đó, chúng tôi đã sử dụng môi trường MS chứa NAA để bén rễ cho chồi bơ . Tuy nhiên, không có rễ đã được hình thành trong môi trường này. Khi peptone được bổ sung vào môi trường, rễ được hình thành và phát triển tốt từ quả bơ (Bảng 4, hình 1h). Có thể peptone trong môi trường cảm ứng rễ có một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự tăng trưởng của chồi, trong khi NAA thúc đẩy sự phát triển rễ. Kết quả là, chồi có thể chết trước khi bén rễ trong môi trường không có peptone.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Barcelo´-Mun˜oz, A., Pliego-Alfaro, F., 2003. Micropropagation of avocado. In: Jain, S.M., Ishii, K. (Eds.), Micropropagation of Woody Trees and Fruits.Kluwer Academic Publishers, pp. 519–542.

Barcelo´-Mun˜oz, A., Pliego-Alfaro, F., Barea, J.M., 1990. Micropropagacio´n de aguacate (Persea americana Mill.) en fase juvenil. Actas Hortic. 1, 503–506.

Becerra, D.C., Forero, A.P., Go´ngora, G.A., 2004. Age and physiological condition of donor plants affect in vitro morphogenesis in leaf explants of Passiflora edulis f. flavicarpa. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 79, 87–90.

Blumenfeld, A., Gazit, S., 1971. Growth of avocado fruit callus and its relation to exogenous and endogenous cytokinins. Physiol. Plant. 25,369–371.

Brokaw, W.H., 1987. Avocado clonal propagation. Proc. Int. Plant Prop. Soc. 37, 97–103. Capote de Sol, M., Rodriguez, N.N., Blanco, M., 2000. In vitro propagation of avocado. Trop. Fruits Newslett. 36/37, 3–7.

Castro, M., Oyanedel, E., Cautı´n, R., 1995. In vitro shoot proliferation in avocado (Persea americana Mill.) induced by CPPU. In: Proceedings of the World Avocado Congress III. pp. 223–226.

Chen, J.T., Chang, W.C., 2002. Effects of tissue culture conditions and explant characteristics on direct somatic embryogenesis in Oncidium ‘Gower Ramsey’. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 69, 41–44.

Cooper, P.A., 1987. Advances in the micropropagation of avocado (Persea americana Mill.). Acta Hortic. 212, 571–575.

Duncan, D.B., 1995. Multiple range and multiple F-test. Biometrics 11, 1–42. FAOSTAT, 2001.

FAOSTAT Database Results 2001. http://apps.fao.org.

Gorzalez-Rosas, H., Salazar, S.G., 1984. Root induction and vegetative development from avocado plantlets (Persea americana Mill.).Calif. Avo. Soc. Yrb. 53, 97–100.

Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E., Lopez-Matas, M.A., del Pozo, J.C., 2005. Hormonal control of the plant cell cycle. Physiol. Plant. 123, 173–183.

Harty, P.A., 1985. Propagation of avocado by tissue culture: development of a culture medium for multiplication of shoots. South Afr. Avo. Growers’ Assoc. Yrb. 8, 70–71.

Murashige, T., Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol. 15, 473–479.

Nel, D.D., Kotze, J.M., Snyman, C.P., 1982. In vitro propagation of Persea indica. Calif. Avo. Soc. Yrb. 66, 167–168.

Pliego-Alfaro, F., Encina, C.L., Barcelo´-Mun˜oz, A., 1987. Propagation of avocado rootstocks by tissue culture. South Afr. Avo. Growers’ Assoc.Yrb. 10, 36–39.

Quraishi, A., Koche, V., Sharma, P., Mishra, S.K., 2004. In vitro clonal propagation of neem (Azadirachta indica). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 46, 1–4.

Schroeder, C.A., 1956. Growth of avocado fruit tissue on artificial media. Calif. Avo. Soc. Yrb. 40,165–168.

Schroeder, C.A., 1961. Some morphological aspects of fruit tissue grown in vitro. Bot. Gaz. 112, 198–204.

Schroeder, C.A., 1971. The response of avocado pericarp tissue to temperature and light in vitro. Calif. Avo. Soc. Yrb. 54, 85–89.

Schroeder, C.A., 1975. The response of avocado flower budsin vitro. Calif. Avo. Soc. Yrb. 58, 66–73.

Schroeder, C.A., 1980. Avocado tissue in vitro. Calif. Avo. Soc. Yrb. 64, 139– 141.

Seiki, S., Manabu, H., Sumio, I., 1993. Recovering vitrified carnation (Dianthus caryophyllus L.) shoots using Bacto-peptone and its subfractions. Plant Cell Rep. 12, 370–374.

Seyring, M., 2005. Einfluss von Pepton auf die Differenzierung und Keimung somatischer Embryonen von Cyclamen persicum Mill. BHGL-Schriftenreihe 23, S119 (Abstract).

Sivakumar, G., Yu, K.W., Hahn, E.J., Paek, K.Y., 2005. Optimization of organic nutrients for ginseng hairy roots production in large-scale bioreactors. Curr. Sci. 89, 641–649.

Virupakshi, S., Manjunatha, B.R., Naik, G.R., 2002. In vitro flower induction in callus from a juvenile explant of sugarcane, Saccharum officinarum L., Var. CoC 671. Curr. Sci. 83, 1195–1197.

Witjaksono, S.B., Colls, A., Litz, R.E., Moon, P.A., 1999. Avocado shoot culture, plantlet development and CO2 assimilation in an ambient and enhanced CO2 environment. In vitro Cell Dev. Biol. Plant. 35, 238–244.

Zirari, A., Lionakis, S.M., 1994. Effect of cultivar, explant type, etiolation pretreatment and the age of plant material on the in vitro regeneration ability of avocado (Persea americana). Acta Hortic. 365, 69–76.

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *