Ra hoa trong ống nghiệm Phong lan

Tóm tắt


Sự ra hoa (nở hoa) là quá trình khó có thể nắm bắt và cũng là quá trình hấp dẫn nhất của tất cả quá trình phát triển của thực vật. Việc kích thích ra hoa trong ống nghiệm ở hoa lan sẽ làm giảm tương đối thời gian ở giai đoạn juvenile (juvenile phase) và cung cấp cái nhìn sâu sắc hơn về các khía cạnh sinh lý, di truyền và phân tử của hoa. Bản sơ lược này tổng hợp tất cả các nghiên cứu có sẵn đã được thực hiện về việc ra hoa in vitro với mục đích cung cấp manh mối có giá trị về cơ chế có thể diễn ra.

Ra hoa trong in vitro mở ra một bối cảnh rộng lớn mới trong việc ra hoa

Hoa lan, một trong những họ hoa lớn nhất, nổi tiếng bởi hình dạng hoa độc đáo và màu sắc hấp dẫn của nó. Nói chung, hoa lan có một giai đoạn trưởng thành dài đòi hỏi vài năm tăng trưởng trước khi chúng có thể ra hoa (Duan & Yazawa, 1994a; Kostenyuk và cộng sự, 1999).  Khả năng của cảm ứng hoa lan để ra hoa in vitro có khả năng rất lớn trong việc giảm thời gian cần thiết (từ nhiều năm xuống vài tháng) nhằm đạt đến giai đoạn trưởng thành cần thiết để ra hoa trong cây (in planta) hay ngoài ống nghiệm (ex vitro). Ví dụ, sự ra hoa in vitro của Oncidium varicosum đã được quan sát sau tám đến chín tháng so với 3 năm để hoa in vivo (Kerbauy, 1984), tức là hoa Dendrobium candum in vitro được tạo ra trong vòng ba đến sáu tháng so với 3 năm vivo (Wang và cộng sự, 1997), trong khi sự ra hoa của những cây thuộc Cymbidium niveomarginatum đã được quan sát trong vòng ba tháng so với 4 đến 7 năm ra hoa in vivo (Kostenyuk et al. 1999). Sim và cộng sự (2007) đã báo cáo rằng sự sinh trưởng của hạt giống trồng ra hoa in vitro (in vitro flowering) của Dendrobium Madame Thong-In mất khoảng 5 đến 6 tháng và thời gian trưởng thành (juvenile period) đã rút ngắn xuống 1/5 thời kỳ sinh trưởng in vivo bình thường. Ngoài ra, những cây con này là từ hạt giống tự thụ phấn và phân tách/phân ly (nhưng không theo tỷ lệ Mendel) màu sắc. Do đó, có thể đánh giá sớm màu hoa trong vòng 6 tháng bằng cách sử dụng cảm ứng hoa in vitro, rút ​​ngắn thời gian cần thiết để đánh giá thông thường (ít nhất 2 năm), giảm chi phí lao động và tối ưu hóa không gian cần thiết cho nhân giống hoa lan bình thường. Hệ thống này sẽ rất có lợi cho người trồng lan. Vì các tín hiệu môi trường ảnh hưởng đến sự khởi đầu và phát triển của hoa ở nhiều loài lan, và thực tế cả các loài thực vật khác, vì vậy cách tiếp cận tốt cho các nghiên cứu về hoa, là nhân giống in vitro hoặc nuôi cấy mô vì điều này cho phép kiểm soát sự tăng trưởng và phát triển tốt hơn so với các nghiên cứu trên vivo (Teixeira da Silva et al., 2007; Vaz và cộng sự, 2004). Khả năng kiểm soát sự ra hoa trong ống nghiệm sẽ rất quan trọng đối với các nghiên cứu về phân tử và di truyền nhằm làm sáng tỏ các cơ chế gây ra hoa và thúc đẩy các chương trình nhân giống hoa lan.

Sự ra hoa trong ống nghiệm có thể rất khó nắm bắt và hấp dẫn nhất trong tất cả các quá trình phát triển của cây in vitro. Tuy nhiên, giống như việc ra hoa ex vitro trong nhà kính, quá trình này, đặc biệt là ở cấp độ di truyền và phân tử, vẫn được hiểu một cách khá thô sơ, mặc dù những bước tiến lớn đã được thực hiện trong hoa lan (Hsiao et al., 2011). Hoa lan phô bày những bông hoa kỳ lạ với các cấu trúc và bản sắc cơ quan riêng biệt, làm cho chúng trở nên độc nhất giữa các thực vật hạt kín. Hơn nữa, sinh sản sinh học tinh tế của chúng, với sự hợp nhất của kiểu dáng các nhụy, sự đồng tiến hóa của thụ phấn, thời gian trưởng thành khác nhau của hạt phấn và noãn, và sự phát sinh đại bào tử và tiểu bào tử, tạo ra sự thụ phấn hiệu quả (Yu & Goh, 2001).

Trong năm 2006, một năm mang tính bước ngoặt, thuật ngữ ” in vitro bouquets ” đã được đặt ra (Sudhakaran et al., 2006) để chỉ khả năng không chỉ tạo ra và kiểm soát sự ra hoa trong ống nghiệm, mà còn thương mại hóa khái niệm này, đặc biệt là đối với các loài phong lan có thời kỳ trưởng thành dài (Vaz & Kerbauy, 2008a) và có khả năng ra hoa trong thời gian dài làm cho ” bó hoa trong ống nghiệm ” trở thành một sản phẩm thị trường cao cấp tiềm năng. Tùy thuộc vào kiểu gen, có thể mất 1-13 năm để tạo ra một cây ra hoa từ hạt trong hoa lan và sự chuyển đổi từ thời kỳ vị thành niên (juvenile period) này sang ra hoa cũng phụ thuộc vào điều kiện môi trường (Bhadra & Hossain, 2003; Chia et al., 1999; Ziv & Naor, 2006). Hơn nữa, người nuôi thường phải mất 3-5 năm để đánh giá và lựa chọn các đặc điểm hoa mong muốn bằng cách nhân giống thông thường. Vì ra hoa là một quá trình cực kỳ chậm và trong một số trường hợp là một sự kiện hiếm gặp, các chương trình nhân giống hoa lan cũng rất chậm với mùa ra hoa được xác định rõ ràng (Chang & Chang, 2003; Duan & Yazawa, 1995a; Kostenyuk et al., 1999). Do đó, công nghệ sinh học in vitro (cụ thể hơn là nuôi cấy mô và vi nhân giống) sẽ cung cấp một công cụ hiệu quả không chỉ để nhân giống vô tính một kiểu gen quan tâm hoặc giá trị thương mại, mà còn phục vụ như một cách cho phép phát triển phối hợp như cây lan ra hoa đồng loạt trong nhà kính, cần thiết cho dự đoán thị trường (Teixeira da Silva, 2013a). Điều kiện in vitro cũng có khả năng rút ngắn đáng kể thời kỳ vị thành niên (juvenile period), và tùy thuộc vào mẫu nghiên cứu được sử dụng, các loài phong lan được thảo luận, và tập hợp các yếu tố sinh học và phi sinh học, tất cả đều đóng vai trò trọng, có thể, đôi khi trên một trường hợp, để tạo ra hoa in vitro trong hoa lan (Blanchard & Runkle, 2008; Goh & Yang, 1978; Hew & Clifford, 1993; Hsiao et al., 2011; Taylor & Van Staden, 2006). Những yếu tố này là vấn đề sẽ được xem xét kĩ lưỡng hơn trong bài gới thiệu này.

Sự phát triển noãn trong hoa lan được kích hoạt bởi sự thụ phấn trái ngược với hầu hết các loài thực vật có hoa, nơi noãn trưởng thành và tế bào trứng đã sẵn sàng để được thụ tinh ở giai đoạn nở hoa (anthesis). Các nghiên cứu về các khía cạnh phân tử của sự phát triển noãn trong Phalaenopsis spp dẫn đến sự cô lập và biểu thị đặc tính của một loạt các gen phong lan liên quan đến sự phát triển của noãn (Yu & Goh, 2001). Các nhà nghiên cứu hoa lan và những người làm vườn xem hoa in vitro là một trọng tâm quan tâm vì nó cung cấp một hệ thống cho hoa sớm, cái gọi là “bó hoa trong ống nghiệm” (Sudhakaran et al., 2006), trong khi cung cấp một hệ thống mô hình để nghiên cứu về hoa cảm ứng cũng như sự nở hoa và phát sinh hình thái hoa, giống như hệ thống thin cell layer (TCL) rất thuận lợi trong việc nghiên cứu các yêu cầu fine-scale cho sự phát sinh mô trên một loạt các loài thực vật (Teixeira da Silva et al., 2007; Teixeira da Silva & Tanaka, 2011; Teixeira da Silva, 2013b; Teixeira da Silva & Dobra Muffnszki, 2013). Vì các thành phần môi trường, mức độ của chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) được áp dụng, điều kiện ánh sáng, cấu trúc di truyền của loài và điều kiện nuôi cấy có mối tương quan chặt chẽ với sự khởi đầu và phát triển của các cơ quan hoa từ chồi hoặc mô sẹo, thiết lập một giao thức in vitro đáng tin cậy để tạo ra hoa sớm trong hoa lan là một công cụ quan trọng để nghiên cứu các cơ chế phân tử và di truyền của cảm ứng hoa và hỗ trợ các chương trình nhân giống hoa lan, hợp tác cùng với chuyển đổi gen (Teixeira da Silva et al., 2011 ). Các nhà lai tạo hoa lan có thể khai thác thời kỳ ra hoa ngắn để phát triển các giống lai mới sớm hơn nhiều so với các phương pháp thông thường trong khi ra hoa in vitro cũng có thể được áp dụng để điều chỉnh sản xuất thương mại hoa và các hợp chất cụ thể từ các cơ quan hoa (Hsiao et al., 2008).

Dường như có một số yếu tố vốn có và áp đặt quyết định sự thành công của việc ra hoa cả in vitro và ex vitro, và khái niệm florigen (kích thích hóa học ra hoa) đã được củng cố bởi một hệ thống phức tạp về thời gian ra hoa và gen nhận dạng mô phân sinh ( ví dụ Zeevaart, 2006). Tuy nhiên, bài tổng quan này không giả vờ xác định các lý do phân tử và di truyền cho sự thành công hoặc khả năng của mô phân sinh đỉnh chồi để chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn ra hoa. Các vấn đề như gen MADS-box và mô hình ra hoa ABCD (E) được khám phá rất tốt ở những nơi khác (ví dụ Hsiao et al., 2011; Pinyopich et al., 2003; Teixeira da Silva & Nhut, 2003a; Xu et al., 2006). Mục tiêu của bài viết này là làm nổi bật những thành công đã đạt được trong việc ra hoa in vitro ở hoa lan, mặc dù việc ra hoa trong ống nghiệm đã được báo cáo rộng rãi ở nhiều họ thực vật (Taylor & Van Staden, 2006). Chia et al. (1999) đã tóm tắt gần 15 năm trước, 40 nghiên cứu duy nhất được báo cáo trong tài liệu vào thời điểm đó, nhưng hầu hết các nghiên cứu đó chỉ đơn thuần là mô tả trong đó hoa in vitro được quan sát một cách tự nhiên, không gây ra và hầu như không hiểu gì về cơ chế như tại sao những sự kiện này xảy ra trong ống nghiệm. Tuy nhiên, người đọc nên luôn luôn nhớ rằng hoa và sự hồi quy của hoa bao gồm một sự chuyển đổi từ phát triển hoa trở lại sự phát triển thực vật, do đó tạo ra một giai đoạn nở hoa trong một mô hình tăng trưởng đang diễn ra chứ không phải là một hành động/hoạt động cuối cùng của mô phân sinh đỉnh (Tooke et al., 2005). Không phụ thuộc vào việc ra hoa trong ống nghiệm hay in vivo, giai đoạn chuyển tiếp trong mô phân sinh có thể được chia thành ba giai đoạn: chuyển từ mô sinh dưỡng sang mô phân sinh sinh trưởng (phát triển) (cảm ứng hoa), duy trì mô phân sinh hoa (xác định hoa), và sự biệt hóa của mô phân sinh hoa (phát triển cơ quan hoa). Tuy nhiên, kỹ thuật in vitro là lợi thế vì chúng cho phép kiểm soát môi trường và các thành phần môi trường tốt hơn so với môi trường ex vitro, cho phép điều khiển và bắt đầu phát triển hoa, từng bước một. Nhìn lướt qua hỗn hợp phức tạp của các yếu tố trong Bảng 1 cho thấy không có xu hướng rõ ràng nào tồn tại, mặc dù thông tin được thu gọn trong tổng quan này sẽ cho phép các nhà khoa học nuôi cấy mô lan xác định tạo ra hoa in vitro để nghiên cứu cơ chế sinh lý, sinh hóa và di truyền các quá trình phát triển trong giống lan của họ hoặc chi liên quan chặt chẽ, hoặc tiến thêm một bước để thương mại hóa khái niệm ” bó hoa trong ống nghiệm ”.

Ra hoa in vitro trong hoa lan: thời điểm biến đổi/ phát triển

Mặc dù có rất nhiều tài liệu báo cáo về sự ra hoa in vitro trong hoa lan, nhưng đa phần chúng chỉ tập trung ở 9 chi chủ yếu là Cymbidium và Dendrobium. Trong 9 chi này, Cymbidium, Oncidium và Psygmorchis thuộc họ Epidendroideae, bộ Cymbidieae; Phalaenopsis, Doritis và Polystachya thuộc họ Epidendroideae, bộ Vandeae; Dendrobium thuộc họ Epidendroideae, bộ Dendrobieae; Geodorum và Eulophia thuộc phân họ Orchidoideae, bộ Epidendreae. Do không có xu hướng rõ ràng tồn tại đối với sự ra hoa trong ống nghiệm trong hoa lan, nên tổng quan này sẽ kiểm tra các nghiên cứu theo thứ tự thời gian (Bảng 1).

Loài       Mẫu, Điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, chu kì sáng), thời gian ra hoa Môi trường nuôi cấy Những quan sát, thành công và thất bại Trích dẫn
Cymbidium ensifolium cv.Qiulan Chồi mô và chồi nách. Nuôi cấy được duy trì trong 8-9 chu kì sáng ở  25oC Môi trường MS Cơ quan hoa hình thành từ cây con hoặc nụ hoa mọc trực tiếp từ  rosette protocorm Wang et al.,1981
Cymbidiumen sifolium cv.Qiulan Chồi mô và chồi nách. Nuôi cấy được duy trì trong 8-9 chu kì sáng ở  25oC VW được sửa đổi, W và MS được sửa đổi bổ sung them BA, ZT, CM,NAA, 2,4-D Môi trường W đã sửa đổi được bổ sung 1mg/l BA và 0.1mg/l NAA phù hợp với cảm ứng nụ hoa của cây trong ống nghiệm Wang,1984
Cymbidium ensifolium cv.Susin Mô phân sinh và nách lá. Nuôi cấy duy trì trong 8h chu kì sáng MS Các cây con từ protocorms được nuôi cấy trên MS. Hầu hết các cây con đã hình thành nụ hoa và nở hoa Wang et al.,1988; Wang,1988
Oncidium varicosum “Baldin” Mô phân sinh đỉnh chồi, chu kì sáng 16 giờ ở 25oC, ống Gro-Lux, ra hoa cảm ứng sau 8-9 tháng sau khi chuyển đổi PLBs môi trường vô cơ Knudson (1946), không có hormone, bột chuối 60g/l, than hoạt tính 1,0g/l Nghiên cứu đầu tiên về việc ra hoa trong ống nghiệm sử dụng cây aclone dorchid. Sự ra hoa in vitro của Oncidium varicosum đã được quan sát sau tám đến chín tháng so với 3 năm đối với sự ra hoa in vivo Kerbauy,1984
Cymbidiumgoeringii Cây giống in vitro. Nuôi cấy được duy trì trong 8 hoặc 12 giờ chu kì sáng ở 25oC MS bổ sung CW hoặc BA được kết hợp với NAA 90% cây con được trồng trong ống nghiệm hình thành nụ hoa Zhang et al.,1993
Doritis pulcherrima x Kingiella philippinen Cây con Invitro. Sự ra hoa xảy ra trong vòng 7 tháng nuôi cấy. Nuôi cấy được duy trì trong 12h photoperiod ở 25oC Môi trường VW và Hyponex BAP, KN, 2ip, CW và nồng độ N khác nhau Các cây con in vitro gây ra sự ra hoa trong sự hiện diện của BA trong các điều kiện dinh dưỡng nhất định, bao gồm hàm lượng sucrose và nitơ thích hợp trong môi trường nuôi cấy. Sử dụng KN, 2iP hoặc CW không hiệu quả đối với cảm ứng nụ hoa. Không có nụ hoa hình thành trong Hyponexmedium, ngay cả với BA và sucrose. N cao trong môi trường giảm hoặc không kích thích hình thành nụ hoa trong khi hàm lượng N thấp cải thiện sự hình thành của nụ hoa. Duan&Yazawa, 1994,1995b
Phalaenopsis Pink Leopard (‘‘Petra’’) Chồi bất định được nuôi cấy dưới nhiệt độ ngày/đêm khác nhau VW + 22 uM MB Nụ hoa không được hình thành trên các chồi bất định được nuôi cấy trên môi trường thiếu BA. Cung cấp nitơ thấp và cytokinin. Quá trình Vernalization dẫn đến cảm ứng viêm, nhưng không quan sát thấy sự tổng hợp, có thể là do sự tích lũy ethylene trong bình. Duan&Yazawa, 1994,1995a
Dendrobium candidum Wall.Ex Lind Protocorms có nguồn gốc từ hạt. Ra hoa trong vòng 90 đến 150 ngày. Nuôi cấy được duy trì 12h photoperiod ở 1000-1500 lux light ở 25-27oC Môi trường MS bổ sung BA, NAA, ABA ở các nồng độ khác nhau Nụ hoa được tạo ra trong 2.0 mg/l BA và 0.5 mg/l NAA với tần suất 27%. Khi protocorms được nuôi cấy trong 0,5 mg/l  ABA trong 15 ngày và sau đó được chuyển sang môi trường bổ sung 2.0 mg/l BA, tần suất ra hoa trong môi trường lên tới 84,0%. Không quan sát thấy nụ hoa khi các protocorm được nuôi cấy trên môi trường bổ sung ABA trong thời gian dài. Wang et al.,1995
Aranda,Dendrobium,Aranthera and Oncidium Không có thông tin Không có thông tin BA quan trọng Hew&Yong,1997
Dendrobium candidum Wall. Ex Lindl. Protocorms hoặc chồi. Sự ra hoa trong vòng 3-6 tháng. Nuôi cấy được duy trì trong 12h photoperiod ở  1000-1500 lux ở 25-27 oC. Môi trường MS bổ sung BAP, NAA, ABA ở các nồng độ khác nhau Hormon thực vật và polyamines đóng vai trò quan trọng trong   khởi đầu tạo hoa. Việc bổ sung 20umol/l spermidine, hoặc 2.0mg/l BA, hoặc sự kết hợp của 0,5 mg/l NAA và BA trong môi trường nuôi cấy đã tạo ra protocorms hoặc chồi ra hoa trong vòng 3-6 tháng với hiệu suất 31,6% -45,8%. Tần số ra hoa tăng trung bình lên tới 82,8% khi xử lý trước các protocorm trong môi trường chứa ABA 0,5mg/l sau đó chuyển vào môi trường với 2,0mg/l BA. Cảm ứng ra hoa sớm phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của vật liệu thí nghiệm. Wang et al.,1995, 1997
Cymbidium niveo-marginatum Ma Thân rễ (Rhizomes) (3-4 tháng tuổi) và cây in vitro 3-5 tháng tuổi. Nuôi cấy được duy trì ở 25-26C, 50umol/m2s và photoperiod 16h. Để kích thích điều kiện ngắn ngắn, một photoperiod 8 giờ đã được sử dụng ở nhiệt độ thấp (4-6 C) và cao đến (30-32 C). Gần 100% cây ra hoa trong vòng 90 ngày Môi trường MS biến đổi bổ sung BA và cung cấp nitơ hạn chế và giàu phốt pho Một điều trị kết hợp BA, cung cấp nitơ hạn chế với giàu phốt pho và cắt bỏ rễ (cắt tỉa) dẫn đến ra hoa. Khi cắt bỏ gốc và / hoặc BA bị loại bỏ khỏi các phương pháp thử nghiệm kết hợp, cảm ứng hoa đã giảm đáng kể. Cây con bị cắt bỏ rễ được nuôi cấy trong môi trường chứa BA có hàm lượng P cao và N thấp đạt được số lượng hoa in vitro cao hơn 2,5 lần so với nuôi cấy trong môi trường MS có chứa BA mà không có tỷ lệ P/N được sửa đổi. Nồng độ NAA, BAP, TIBA, GA3 và PBZ ngoại sinh khác nhau đã được đánh giá trong quá trình nhân giống cây, tái sinh cây và cảm ứng ra hoa Kostenyuk et al., 1999
Dendrobium huoshanase cây giống in vitro. Nuôi cấy được duy trì trong photoperiod 12h ở 2000 lux ở 25oC. MS chứa 2,4-D và Zea ở nồng độ khác nhau 4-mon. Cây con được nuôi cấy trên môi trường MS chứa 0,1mg/l  2,4-D và 1,0mg/l Zea cho cảm ứng hoa và môi trường MS chứa 10g/l nước chuối là hiệu quả để đạt được hoa Wen et al.,1999
Cymbidium ensifolium Internode of flower branch. Nuôi cấy được duy trì trong 0 hoặc 24h photoperiod ở 25oC. MS bổ sung BA, NAA và GA Chồi tiềm ẩn của một phần lóng cắt của hoa biệt hóa trên MS được bổ sung 3-4mg/l BA và 0,1mg/l NAA và 1,0mg/l 1GA, tần suất ra hoa là 75%. Hoa và Nụ dinh dưỡng không thể tạo ra protocorm thứ hai và thân rễ gốc Jiaetal.,2000
Psygmorchis pusilla Cây con được nuôi cấy in vitro ở các môi trường nuôi cấy có kích thước khác nhau được ủ ở 25±2 oC trong 16h photoperiod của 30umol/m2s VW chứa nồng độ muối khác nhau, N vô cơ (NH4+ và NO3), P, K và Ca. Nồng độ  N thấp của sự kích thích hình thành hoa và hiệu ứng này rõ rệt hơn so với mức độ muối tổng thấp nhất được sử dụng. Sự hiện diện của NH4 trong môi trường là điều cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cây, trong khi không có sự ra hoa của NO3. Sự hình thành hoa cũng được tăng cường bằng một nửa nồng độ ion của P và K trong khi nồng độ Ca cao nhất cho thấy một số kích thích hoa. Cây trồng phát triển trong điều kiện thiếu chất dinh dưỡng có màu vàng rõ rệt hơn so với cây trồng trên môi trường đầy đủ dinh dưỡng. ABA và TDZ ức chế sự phát triển sinh sản. Vaz&Kerbauy, 2000,2008b
Cymbidium ensifolium var. misericors Callus có nguồn gốc từ củ. Sự ra hoa xảy ra trong vòng 100 ngày nuôi cấy. Các mẫu nuôi được duy trì trong 100 ngày ở mức 25oC tiếp xúc với ánh sáng nhân tạo (ống huỳnh quang ánh sáng ban ngày FL-30D/29,40W) 10 umol/m2s với  chu kì sáng 16h photoperiod 16h. MS chứa NAA, TDZ, 2iP hoặc BA ở các nồng độ khác nhau Sự ra hoa sớm xảy ra trên môi trường MS xác định có chứa NAA với TDZ, 2iP hoặc BA trong vòng 100 ngày nuôi cấy. Trong số tám cytokin được kích hoạt, TDZ ở mức 3,3-10 uM hoặc 2 iP ở mức 10-33uM kết hợp với 1,5uM MNAA là sự kết hợp hiệu quả nhất để đạt được kết quả ra hoa. TDZ có hiệu ứng cảm ứng mạnh hơn BA trên hoa Chang&Chang, 2003
Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr. Cây giống in vitro 2-3 tháng tuổi có 3-4 lá. Sự ra hoa xảy ra trong vòng 90-100 ngày. Nuôi cấy được duy trì ở 25C dưới 16h photoperiod của ánh sáng huỳnh quang 1000 lux Môi trường MS bổ sung BA, IAA và AC ở các nồng độ khác nhau Cây giống in vitro chỉ ra hoa trên MS±2.0 mg/l BA ±1.0 mg/l AA và trên MS ±2.5mg/l ±BA 0.1% (w / v) AC trong vòng 3-4 tháng nuôi cấy. BA đã có hiệu quả mạnh mẽ trong hoa in vitro. Bhadra&Hossain, 2003
Psygmorchis pusill nảy mầm bất đối xứng của hạt chưa trưởng thành. Bóng tối, 6,8, 12,16,20,22 và 24h photoperiod. 30umol/m2s VW rắn với các dinh dưỡng vi lượng MS, bột chuối chín 6% (w / v), than hoạt tính 0,1% (w / v) và sucrose 2% (w / v), và hóa rắn với 0,6% (w / v) ” Oxoid ‘ ‘agar. Chu kì sáng  và nhiệt độ đã được đánh giá. Các nồng độ carbohydrate nội sinh và sắc tố đã được đo. Chất vô cơ N (NH4 và NO3), P, K, Ca và tổng nồng độ muối khoáng ảnh hưởng đến sự phát triển của cành hoa đã được nghiên cứu. Ảnh hưởng của thành phần môi trường (đường, chất dinh dưỡng khoáng, hormone, pH), photoperiodism và nhiệt độ lên sự hình thành hoa đã được nghiên cứu, cũng sử dụng SEM. Mức độ carbohydrate nội sinh, sắc tố, cytokinin, auxin và ABA đã được đo. Định lượng iP IAA, ABA, Z, ZR, iP và [9R] dựa trên ELISA indirect sau khi tinh sạch trong reverse-phase HPLC. Vaz,2002;Vaz& Kerbauy,2000; Vazetal.,2004, Vaz&Kerbauy, 2008b
Dendrobium moniliforme Cây giống in vitro. Nuôi cấy được giữ ở nhiệt độ tối thiểu 25oC và 12 giờ photoperiod với sự chiếu xạ 50-60 umol/m2s MS chứa TDZ hoặc PBZ+ABA gây ra cảm ứng, môi trường MS đã sửa đổi bổ sung PBZ+TDZ để ra hoa Nụ hoa được tạo ra trong MS chứa 0,05 mg/l TDZ hoặc MS chứa 0,04 mg/l PBZ và 1,0 mg/l ABA trong 90 ngày, sau đó được chuyển sang môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l PBZ 0,1 mg/l TDZ để ra hoa, tần suất ra hoa là 93,3%, nhưng tần số hoa bình thường lần lượt là 45,4% và 80% Wang et al., 2006
Dendrobium Second Love Mẫu cấy được giữ trong phòng tăng trưởng ở 26oC trong 16h photoperiod tại 35-45 hoặc 50-60 umol/m2s . VW lỏng và rắn, cùng với MS, TDZ, BAP, [9R] iP;  Semisolid VW, TDZ, sucrose Nồng độ cytokinin nội sinh, IAA, đường hòa tan và axit amin được đo trong quá trình ra hoa của chồi bị cô lập. Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau, nồng độ cytokinin và sucrose cũng được đánh giá. Các tác giả đã thúc đẩy sự ra hoa sớm trong vi nhân giống các chồi không rễ cũng như trong các cây con của các cây lai khác nhau liên quan đến cây Dendrobium của nhóm Nobile, bằng cách thêm TDZ vào môi trường nuôi cấy. TDZ có liên quan đáng kể đến quá trình chuyển đổi hoa trong ống nghiệm, có lẽ là do sự gia tăng nội sinh về mức độ của cytokinin và IAA. TDZ 1,8 uM có ảnh hưởng sâu sắc đến số lượng các hormone này so với các mẫu được trồng trên môi trường không có TDZ. Trong số các cytokinin được nghiên cứu, [9R] iP và ZR chiếm ưu thế đáng kể trong thời kỳ đỉnh cao đầu tiên vào ngày ủ thứ 5. Hơn nữa, nồng độ của một số loại đường – chủ yếu là sucrose và glucose, và axit amin – chủ yếu là asparagine, glutamine, tyrosine và ornithine – bị ảnh hưởng rõ rệt bởi nồng độ TDZ, nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn tác dụng trực tiếp của TDZ đối với cảm ứng hoa. Những thay đổi về mức độ hormone gây ra bởi phương pháp điều trị bằng phương pháp nhiệt trị đã được quan sát thấy ở chồi bên và lá trưởng thành của cây trưởng thành được trồng in vivo. Z và ZR là những cytokinin nổi bật nhất được tìm thấy vào ngày thứ 15 trong các cây được xử lý lạnh. Tuy nhiên, sự gia tăng quan sát thấy trong tổng số cytokinin, cũng như nồng độ IAA và hàm lượng ABA giảm đáng kể, không có nghĩa là chúng là yếu tố quy nạp trực tiếp và cuối cùng. Theo các tác giả, những kích thích tố này sẽ là cần thiết, nhưng không đủ cho cảm ứng hoa. Ferreira, 2003; Campos & Kerbauy, 2004; Ferreira et al., 2006
Phalaenopsis Cygnus ‘Silky Moon’ Cây in vitro không có rễ. Sự ra hoa xảy ra trong vòng 40-120 ngày. Nuôi cấy được ủ ở 25oC với photoperiod 16h của 35-40 umol/m2s được cung cấp bởi đèn huỳnh quang trắng mát Môi trường VW bổ sung BA với nồng độ N cung cấp khác nhau Số lượng cây nhiều nhất (38-43%) tạo ra nụ hoa sau khi nuôi cấy trong môi trường VW được bổ sung 30 hoặc 30-40 g/l sucrose trước khi chuyển vào môi trường tiêu chuẩn hoặc VW  sửa đổi (ví dụ MVW) được bổ sung 66,6 mM BA trong 40-120 tháng. BA và nồng độ N có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành nụ hoa. Rojanawong et al., 2006
Hybrid of Cymbidium goeringii and C. hybridium Protocorms in vitro và cây con. Nuôi cấy được duy trì ở 25oC Môi trường MS bổ sung BA, NAA ở các nồng độ khác nhau Cây con cao 1-2 cm, 2-4 cm hoặc 4-6 cm tạo ra 19% 0% và 12% nụ hoa tương ứng trên môi trường MS chứa 1,0 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA trong vòng 80 ngày nuôi cấy. Tần số hình thành chồi hoa không tăng đáng kể sau khi tiền xử lý trên MS được bổ sung 0,5 mg/l PBZ+0,5 mg/l ABA trong 35 ngày. Tần suất hình thành chồi hoa của protocorms chỉ là 01,8% trên tất cả các phương pháp xử lí Zheng & Pang, 2006
Dendrobium Chao Praya Smile Cây giống in vitro. Sự ra hoa xảy ra trong vòng 60 ngày nuôi cấy. Nuôi cấy được duy trì ở 25oC và 16 giờ photoperiod 40 umol/m2s từ đèn huỳnh quang ánh sáng ban ngày. Môi trường KC được điều chỉnh (hai lớp) được bổ sung BA và CW ở các nồng độ khác nhau BA ở mức 11,1 uM cho tỷ lệ ra hoa cao nhất (45%) trong vòng 6 tháng kể từ khi nảy mầm. Tỷ lệ cảm ứng nở hoa đã tăng lên 72% ở cây con có hình thái bình thường. Cây con trong mẫu đã tạo ra cả hoa hoàn chỉnh và không hoàn chỉnh trong một hệ thống nuôi hai lớp. Phấn hoa và cơ quan sinh sản cái của in vitro đã phát triển hoa hoàn chỉnh có hình thái và giải phẫu tương tự như hoa của cây ngoài tự nhiên. Ngoài ra, 65% các hạt phấn hoa có nguồn gốc từ hoa in vitro cho thấy sự giảm phân thường xuyên trong quá trình phát sinh hình thái. Mặc dù tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn hoa từ hoa phát triển in vitro thấp nhưng có thể tự thụ phấn và tạo ra hạt mầm, tương đương với cây trồng ngoài đồng Hee et al., 2007
Dendrobium Madame Thong-In Cây giống in vitro có 2-3 lá nhỏ. Hơn 60% hoa nở vào tuần thứ 6 và 90% vào tuần thứ 9. Nuôi cấy được ủ ở 26oC dưới photoperiod 16 giờ của 35 umol từ đèn huỳnh quang ánh sáng ban ngày. KC được sửa đổi bổ sung BA, CW và AC ở các nồng độ khác nhau CW thúc đẩy tăng trưởng thực vật nhưng không hỗ trợ sự hình thành nụ hoa. CW là điều cần thiết để kích hoạt sự chuyển đổi mô phân sinh đỉnh chồi từ trạng thái sinh dưỡng sang trạng thái phát hoa và BA tăng cường bắt đầu phát sinh và hình thành nụ hoa. Thân cây phát sinh trở nên rõ ràng sau 3 tuần nuôi cấy khi chuyển sang môi trường hai lớp. Vào tuần thứ 9, khoảng 40-55% các protocorm đã tạo ra các phát hoa trên cây. Cả môi trường đông đặc dạng lỏng và Gelrite với 22,2 uM BA và 0,03% AC tạo ra hoa. Sự phát triển của hoa đã bị biến dạng trong môi trường lỏng nhưng được phát triển đầy đủ khi chuyển sang môi trường hai lớp (lớp lỏng bao phủ Gelrite). Cây con khỏe mạnh tạo ra 100% nụ hoa, 75% trong số đó dẫn đến hoa bất thường. Sự phân chia màu sắc của hoa đã được quan sát và vỏ hạt hình thành khi thụ phấn nhân tạo của hoa in vitro. Sim et al., 2007
Dendrobium Madame Thong-In Cây giống in vitro nuôi cấy ở các mẫu kích thước khác nhau được ủ ở 26oC dưới photoperiod 16 giờ của 35 umol từ đèn huỳnh quang ánh sáng ban ngày. KC sửa đổi Giai đoạn tăng trưởng của cây con và mức độ cytokinin nội sinh rất quan trọng đối với sự phát triển sinh dưỡng và phản ứng cảm ứng của hoa. Hàm lượng Cytokinin thay đổi trong các giai đoạn tăng trưởng khác nhau của cây con. Cây con có kích thước 1,0-1,5 cm được nuôi cấy trong môi trường cảm ứng ra hoa [môi trường KC lỏng chứa 4,4 uM BA và 15% CW)] cho thấy có tới 200 và 133 pmol g/l FW của iP và iPA. Mức độ này cao hơn đáng kể so với tất cả các cytokinin khác được phân tích trong cây con cùng giai đoạn và cao hơn khoảng 80 đến 150 lần so với cây con được nuôi cấy trong môi trường không quy nạp (non-inductive medium). Trong giai đoạn chuyển tiếp (sinh dưỡng sang sinh sản), mức độ nội sinh của iP (178 pmol g/l FW) và iPA (63 pmol g/l FW) cũng cao hơn đáng kể so với cytokinin trong các họ Zea và dihydrozeatin (DZ) trong cùng một cây con. Báo cáo này cung cấp bằng chứng mạnh mẽ rằng cytokinin, đặc biệt là họ iP, đóng một vai trò quan trọng trong việc ra hoa in vitro sớm ở loài lan này. Sim et al., 2008
Dendrobium Sonia 17   Cây con giai đoạn ba lá. Mẫu cấy được giữ ở nhiệt độ 25oC và 16 giờ photoperiod với sự chiếu xạ của 25umol/m2s Môi trường MS biến đổi bổ sung BA và nồng độ N/P khác nhau Môi trường giàu P và N thấp có hiệu quả để tạo hoa trong khi hàm lượng P thấp và N cao chỉ có thể thúc đẩy hiệu quả hình thành chồi. Trong 52% số cây con hình thành hoa trong BA và môi trường chứa P cao và N thấp trong khi chỉ có 20% số cây con hình thành hoa trong môi trường MS có chứa BA mà không có bất kỳ thay đổi nào về tỷ lệ P/N sau 4 tháng. Một phương pháp lặp lại cho cảm ứng phát quang trong ống nghiệm đã được tìm thấy khi môi trường chứa 20 uM BA. Các hình thái khác nhau của hoa in vitro như cấu trúc hoa không hoàn chỉnh, hoa in vitro bất thường và không phục hồi đã được quan sát. Tee et al., 2008
Cymbidium kanran Cây giống in vitro. Nuôi cấy được giữ ở nhiệt độ 25oC và photoperiod 12 giờ với độ chiếu xạ 30-40 umol/m2s B5 bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau Cây con nuôi cấy in vitro được nuôi cấy trong môi trường B5 bổ sung 2,0 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA, tần suất ra hoa là 78,2% so với 46,3% được nuôi cấy trong B5 được bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA tỷ lệ hoa chết lần lượt là 12%, và 75%. Zhu et al., 2008
Friederick’s Dendrobium orchid In vitro chồi dài 2-3 cm gồm 3-4 mắt. Sau 3 tháng nuôi cấy nụ hoa đã được cảm ứng. Nuôi cấy được duy trì ở 26oC dưới 1600 lux chiếu sáng trong 14 giờ. Môi trường MS bổ sung PBZ ở các nồng độ khác nhau Không bổ sung PBZ trong môi trường nuôi cấy, không có nụ hoa nào được tạo ra. Nồng độ PBZ thấp (0,025 mg/l) đã thúc đẩy một số lượng nhỏ nụ hoa (10%). PBZ ở mức 0,05 mg/l cho tỷ lệ cảm ứng nụ hoa cao nhất (29%) và nồng độ PBZ cao nhất (0,1 mg/l) mang lại kết quả thấp nhất (6,95%) của cảm ứng nụ hoa. Hoa thu được từ tất cả các môi trường chứa PBZ, tức là ở tất cả các nồng độ PBZ, cho thấy hình thái bình thường. Te-chato et al., 2009
Dendrobium nobile Lindl. Cây giống in vitro. Ra hoa được quan sát khoảng 4-6 tháng. Sau khi hạt giống được gieo. Nuôi cấy được duy trì trong phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 25 C với photoperiod 12 giờ được cung cấp bởi ánh sáng huỳnh quang trắng ở 60 umol/ms Môi trường MS biến đổi bổ sung PBZ và TDZ ở các nồng độ khác nhau Môi trường MS đã được sửa đổi bổ sung PBZ và TDZ. Cây giống tạo ra nụ hoa (33,3-34,8%) trên môi trường MS được xác định có chứa PBZ ở mức 0,5 mg/l. Trong TDZ ở mức 0,1 mg/l ra hoa trong vòng 4 tháng nuôi cấy. Tần suất hình thành chồi hoa tăng lên 95,6% bằng cách trồng cây con trong 0,3 mg/l PBZ 0,5 mg/l NAA sau đó là PP333 và TDZ. TDZ (0,05-0,1 mg/l) và PBZ (0,5-1,0 mg/l) có hiệu quả hơn trong việc tạo ra nụ hoa của cây trồng D. nobile so với BA. Hoa phát triển bị biến dạng ở 25 C nhưng chúng phát triển đầy đủ khi được trồng ở chế độ nhiệt độ thấp hơn (23 C/18 C, sáng / tối) trong 45 ngày. Wang et al., 2009
Dendrobium denndanum Cây giống in vitro. Nuôi cấy được duy trì trong photoperiod 12 giờ ở 2000 lux ở 22-24 oC MS chứa BA, NAA, ABA và 2,4-D ở các nồng độ khác nhau Cây con in vitro không có rễ được nuôi cấy trên MS chứa 2,0 mg/l BA, tần suất cảm ứng nụ hoa là 10%. Guan & Shi, 2009
Eulophia graminea Lindl Củ (rhizomes) có nguồn gốc từ ống nghiệm. Tất cả các mẫu được tiếp xúc với ánh sáng nhân tạo 1000 lux với photoperiod 16h ở 25oC ¼ MS biến đổi với nước cốt dừa, bột khoai tây, peptone và AC Củ có nguồn gốc từ hạt in vitro mọc lên một cách tự nhiên sau đó ra hoa và kết quả sau đó để hoàn thành một vòng đời đầy đủ. Khoảng 44-61% của thân rễ được tạo ra một cách tự nhiên bắt nguồn từ đỉnh. Trong số các loài hoa, 50% cho thấy các cơ quan hoa bình thường, 40% thiếu cả hai bên trái và bên phải và 10% chỉ thiếu cánh hoa bên phải. 18% hoa cho thấy giao phối tự phát và quả phát triển. Các hạt giống đã được thu hoạch và gieo thêm, cho thấy tỷ lệ nảy mầm trung bình 59,6%. Chang et al., 2010
Polystachya sp Chồi in vitro. Mẫu cấy được duy trì dưới ánh sáng huỳnh quang ở cường độ 30 umol/m2s  trong 16h photoperiod. MS và VW Ra hoa và quả in vitro đã được đề cập nhưng không có lý do cụ thể nào được đưa ra để giải thích các hiện tượng Sotthikul et al., 2010
Dendrobium officinale Cây không rễ tạo ra bởi cây gốc. Tất cả các mẫu tiếp xúc với ánh sáng nhân tạo 1000-1800 lux với photoperiod 16 giờ ở 26±1 oC. Môi trường MS bổ sung hormone đơn yếu tố và hormone đa yếu tố. Trong số các phương pháp xử lí bằng hormone một yếu tố (PBZ hoặc TDZ), nồng độ phù hợp và mức độ hình thành nụ hoa với phương pháp xử lí PBZ là 0,2 mg /l với 8,5%, trong khi đó với phương pháp điều trị TDZ là 0.06 mg/l với 15,5%, tương ứng. Tác dụng của phương pháp xử lí hormone đa yếu tố đối với cảm ứng ra hoa được xếp hạng như sau: (PBZ+BA+NA+TDZ)> (PBZ+BA+NAA)>(PBZ+BA) và (PBZ + NAA). Phương pháp xử lí phù hợp nhất là 0,3 mg PBZ + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 0,06 mg/l TDZ. Mức độ hình thành nụ hoa và mức độ nở hoa lần lượt đạt 80,4% và 90,3% Cen et al., 2010
Oncidium ‘Gower Ramsey’ Các phôi mang cánh hoa được lấy từ long-term root callus. Tất cả các mẫu được tiếp xúc với ánh sáng nhân tạo 28-36 umol/m2s với photoperiod 16 giờ ở 26oC. Môi trường MS được bổ sung kết hợp PGR bao gồm các chất bổ trợ (2,4-D, dicamba, NAA, IBA), cytokinin (2iP, BA, kinetin, TDZ) và GA3. Khi mô sẹo một năm tuổi, được tạo ra và cấy ghép với sự hiện diện của 3 mg/l TDZ và 5 mg/l dicamba (dòng 13 callus), đã được chuyển vào môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l NAA và 3 mg/l TDZ, đã cho số lượng phôi cánh hoa cao nhất. Đặc điểm ra hoa của cây con từ phôi bình thường, phôi mang cánh hoa đều không khác biệt đáng kể. Chen, 2012
Dendrobidium strongylanthum Cây giống in vitro ở các mẫu kích thước khác nhau được ủ ở 25±3 C dưới photoperiod 12 giờ 20 umol /m2s Môi trường MS bổ sung PGR đơn yếu tố và xử lí PGR đa yếu tố Tỷ lệ cảm ứng của nụ hoa trong MS + BA 2 mg/l + NAA 0,2 mg/l với 3% sucrose trong 70 ngày là hơn 96%. Môi trường Hyponex bổ sung 0,2 mg/l NAA và 0,5 g/l AC phù hợp cho việc ra hoa sau đó. Zhao et al., 2012

Sau đó, chúng tôi sẽ kiểm tra các yếu tố đã dẫn đến thành công hoặc không thành công trong hoa in vitro.
Trong lịch sử, người đầu tiên tạo ra hoa lan (Laeliocattleya hybrid) ra hoa thành công trong ống nghiệm là Lewis Knudson, từ Đại học Cornell, vào năm 1928. Vào thời điểm đó, các thí nghiệm của ông nhằm chứng minh rằng một cây lan có thể phát triển và ra hoa hoàn hảo khi không có mycorrhiza, như việc cộng sinh, 8 năm sau khi gieo hạt, hoa đã phát triển (Arditti, 1967). Kể từ đó, một số lượng đáng kể các loài phong lan và một số loài thực vật không có hoa đã ra hoa trong điều kiện in vitro. Ở phương Tây, Kerbauy (từ Brazil) năm 1984 dường như là người tiên phong của thời hiện đại, kích thích hoa in vitro ở Oncidium varicosum. Xem xét điều này, lịch sử của hoa phong lan in vitro, ít nhất là báo cáo trong tài liệu, còn rất trẻ – chưa đầy 30 năm – so với lịch sử nuôi cấy mô thực vật, có thể vì nó cực kỳ khó tạo ra hoa in vitro. Chỉ 10 năm sau, Duan & Yazawa (1994a, 1995a, b) đã tăng cường nghiên cứu một chút về Doritis pulcherrima x Kingiella philippinensis và Phalaenopsis sp. Cây in vitro Doritis pulcherrima x Kingiella philippinensis ra hoa với sự hiện diện của 6-benzyladenine (BA) khi hàm lượng sucrose và nitơ trong môi trường nuôi cấy ở mức cụ thể (Duan & Yazawa, 1994a, 1995b). Sử dụng kinetin (KN), 6-ɣ,ɣ-dimethylallylaminopurine (2iP) hoặc nước dừa (CW) là không hiệu quả cho cảm ứng nụ hoa. Không có nụ hoa hình thành trong môi trường Hyponex, ngay cả với BA và sucrose. Hàm lượng nitơ cao (N) [tiêu chuẩn hoặc 1/2 nitơ trong môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) hoặc gấp đôi nitơ trong môi trường VW (Vacin & Went, 1949)] trong môi trường giảm hoặc không khuyến khích hình thành nụ hoa trong khi N hàm lượng thấp (hàm lượng nitơ 1/10 trong môi trường MS) đã cải thiện sự hình thành của nụ hoa (Duan & Yazawa 1994a, 1995b). Duan & Yazawa (1995a) đã báo cáo rằng nụ hoa không được hình thành trên các chồi bất định được nuôi cấy trên môi trường thiếu BA, cung cấp nitơ thấp và cytokinin dẫn đến cảm ứng hoa. Trong lịch sử, Wang vào năm 1980 đã ra hoa in vitro trong hoa lan và đại diện cho những nỗ lực của phương Đông, trong trường hợp này, các nhà khoa học Trung Quốc, tập trung vào Cymbidium oblifolium (Wang et al., 1981, 1988; Wang, 1988; Jia et al ., 1998). Họ đã báo cáo môi trường W đã được sửa đổi bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,1 mg/l a-naphthaleneacetic acid (NAA) phù hợp cho việc tạo nụ hoa của các cây con in vitro và các cơ quan hoa cũng được hình thành từ các rosette protocorms với những nỗ lực sau đó được Chang & Chang củng cố (2003).

Trong nghiên cứu thứ hai này, sự ra hoa sớm xảy ra trên môi trường nửa hàm lượng MS có chứa NAA với thidiazuron (TDZ hoặc N phenyl-N’-1,2,3- thiadiazol-5-ylurea), 2iP hoặc BA trong vòng 100 ngày nuôi cấy và giữa 8 cytokinin (CK) đã được thử nghiệm, TDZ ở mức 3,3-10 uM hoặc 2iP ở mức 10-33 uM kết hợp với 1,5 uM NAA là sự kết hợp hiệu quả nhất để tạo ra hoa. TDZ có tác dụng cảm ứng mạnh hơn khi ra hoa so với BA. Wang và cộng sự (1995) cảm ứng nụ hoa trong Dendrobium candum với 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA với tần suất 27% và khi protocorms được nuôi cấy trong axit abscisic 0,5 mg/l (ABA) trong 15 ngày và sau đó được chuyển 2,0 mg/l BA thêm vào môi trường, tần suất ra hoa tăng lên 84,0%. Không quan sát thấy nụ hoa khi các protocorm được nuôi cấy trên môi trường bổ sung ABA trong thời gian dài. Các nghiên cứu tiếp theo của cùng một nhóm (Wang và cộng sự, 1997) chỉ ra rằng PGR và polyamines đóng vai trò quan trọng trong việc bắt đầu ra hoa. Việc bổ sung spermidine, hoặc BA, hoặc sự kết hợp của NAA và BA trong môi trường nuôi cấy đã tạo ra các protocorms hoặc chồi ra hoa trong vòng 3-6 tháng với tần suất 31,6-45,8% trong môi trường chứa ABA, sau đó chuyển vào môi trường có BA. Cảm ứng của sự ra hoa sớm phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của các nguyên liệu thí nghiệm ban đầu.

Thiên niên kỷ mới mở ra một sự gia tăng đáng kể trong các nghiên cứu ra hoa in vitro ở hoa lan. Bhadra & Hossain (2003) đã chỉ ra rằng cây giống Geodorum densiflorum được nuôi cấy in vitro chỉ ra hoa trên MS 2.0 mg/l BA +1.0 mg/l indole-3-acetic acid (IAA) và trên MS + 2.5 mg/l BA + 0.1% (w / v) than hoạt tính (AC) trong vòng 3-4 tháng nuôi cấy. BA có tác động mạnh mẽ đến sự ra hoa trong ống nghiệm. Psygmorchis pusilla in vitro ra hoa đã được nghiên cứu kỹ (Vaz, 2002; Vaz et al., 2004; Vaz & Kerbauy, 2000; Vaz & Kerbauy, 2008b). Trong các nghiên cứu này, một số quan sát quan trọng đã được thực hiện: (a) cảm ứng hoa có thể xảy ra trong ánh sáng và bóng tối; (b) có mối tương quan nghịch giữa nồng độ muối khoáng và số lượng cụm bông (floral spikes); (c) nồng độ N hình thành hoa kích thích thấp; (d) sự hiện diện của NH4 như là nguồn nitơ duy nhất trong môi trường là điều cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cây, trong khi NO3 không có hoa bị suy tàn; (e) sự hình thành hoa được tăng cường bằng cách làm giàu môi trường bằng K và Ca; (f) thực vật có hoa trong ống nghiệm có hàm lượng Ca và K nội sinh cao hơn thực vật không có hoa nhưng lại có hàm lượng Mg và P thấp hơn, trong khi mức S tương tự ở cả hai cây; (g) sự hình thành cụm hoa và BA có mối tương quan thuận nhưng BA pulse trong 48 giờ không đủ để tăng cường sự hình thành cụm hoa sau khi cây được chuyển sang môi trường không có hormone trong khi tiếp xúc với BA trong môi trường rất quan trọng cho quá trình ra hoa, 1 uM là nồng độ hiệu quả nhất và với nồng độ cao hơn không dẫn đến sự gia tăng hơn nữa số lượng cụm hoa. (h) mức độ cao hơn của Zea nội sinh, zeatin-riboside (ZR) và              N6-(▲2-isopentenyl)-adenine (iP) đã được quan sát thấy trong quá trình phát triển mô phân sinh hoa và biệt hóa cơ quan hoa trong khi hàm lượng isopentenyladenosine ([9R] iP) tương đối thấp hơn so với các CK định lượng khác; (i) phát triển chồi hoa đi kèm với tiêu thụ glucose và fructose; (j) cho sự phát triển của nụ hoa, sự phát triển của floral spikes và sự tổng hợp của nụ hoa, thực vật đòi hỏi thành phần môi trường, nhiệt độ và photoperiod khác nhau, mặc dù sự ra hoa dễ thấy hơn ở những cây này phụ thuộc vào kích thước và số lượng lá, cho thấy rằng hoa phát triển phần nào được liên kết với sức sống trong quá trình tăng trưởng thực vật. CK có thể liên quan đến việc kiểm soát sự biểu hiện của gen mô phân sinh hoa, do đó ảnh hưởng đến các giai đoạn phát triển hoa và biệt hóa cơ quan hoa sau này, ít nhất là ở Arabidopsis (Venglat & Sawhney, 1996). Theo các tác giả khác nhau, nồng độ CK cao hơn có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của hoa trong cây lan được trồng trong ống nghiệm (Duan & Yazawa, 1995a, b; Hee et al., 2007; Hew & Clifford, 1993; Hew & Yong, 1997). Tuy nhiên, Matsumoto (2006) đã báo cáo rằng chỉ riêng GA3 (2,5 uM) đã có hiệu quả trong việc thúc đẩy sự phát sinh của hoa ở Miltoniopsis.

Hầu hết những nỗ lực trong 10 năm qua đã tập trung vào Dendrobium spp., Có lẽ vì nó dễ dàng được nhân giống trong ống nghiệm. Hee và cộng sự (2007) cảm ứng tỷ lệ hoa in vitro cao nhất (45%) trong Dendrobium Chao Praya Smile trong vòng 6 tháng kể từ khi nảy mầm trên môi trường chứa 11,1 uM BA. Tỷ lệ cảm ứng nở hoa đã tăng lên 72% ở cây con bình thường về hình thái. Cây con trong nuôi cấy tạo ra cả hoa hoàn chỉnh và khiếm khuyết. Phấn hoa và cơ quan sinh sản cái trong ống nghiệm đã phát triển những bông hoa hoàn chỉnh có hình thái và giải phẫu tương tự như hoa của cây trồng trên đồng ruộng. Ngoài ra, 65% các hạt phấn hoa có nguồn gốc từ hoa in vitro cho thấy giảm phân thường xuyên trong quá trình vi nhân giống. Mặc dù vậy, tỷ lệ nảy mầm thấp của hạt phấn hoa lấy từ hoa phát triển in vitro có thể tự thụ phấn và tạo ra vỏ hạt với hạt khả thi. Trong nghiên cứu đầu tiên của họ về Dendrobium Madame Thong-In, Sim et al. (2007) cho thấy CW thúc đẩy tăng trưởng thực vật nhưng không hỗ trợ sự hình thành nụ hoa, mặc dù điều đó rất cần thiết để kích hoạt sự chuyển đổi mô phân sinh đỉnh chồi từ trạng thái sinh dưỡng sang trạng thái nở hoa. BA tăng cường sự nở hoa và hình thành nụ hoa. Cuống hoa nở rõ sau 3 tuần nuôi cấy khi chuyển sang môi trường hai lớp.

Vào tuần thứ 9, khoảng 40-55% các protocorm đã tạo ra các cuống phát hoa. Cả môi trường lỏng và Gelrite rắn với 22,2 uM BA và 0,03% AC tạo ra hoa. Cây con khỏe mạnh tạo ra 100% nụ hoa, 75% trong số đó dẫn đến hoa bất thường. Trong nghiên cứu tiếp theo của họ (Sim et al., 2008), giai đoạn tăng trưởng của cây con và mức độ CK nội sinh là những yếu tố quan trọng quyết định sự phát triển sinh dưỡng và phản ứng cảm ứng của hoa. Hàm lượng CK thay đổi trong các giai đoạn tăng trưởng khác nhau của cây con. Cây con có kích thước 1,0-1,5 cm được nuôi cấy trong môi trường cảm ứng ra hoa [môi trường KC lỏng chứa 4,4 uM BA và 15% CW)] cho thấy trọng lượng tươi lên tới 200 và 133 pmol/g (FW) của N6-(▲2-isopentenyl)-adenine (iP) tương ứng. Các mức này cao hơn đáng kể so với tất cả các CK khác được phân tích trong cây con cùng giai đoạn và cao hơn khoảng 80 đến 150 lần so với cây giống được nuôi cấy trong môi trường không quy nạp. Trong giai đoạn chuyển tiếp (sinh dưỡng sang sinh sản), mức độ nội sinh của iP (178 pmol / g FW) và iPA (63 pmol / g FW) cũng cao hơn đáng kể so với CK trong các họ Z và dihydrozeatin (DZ) trong cùng một cây con , cung cấp bằng chứng mạnh mẽ rằng các CK, đặc biệt là họ iP, đóng một vai trò quan trọng trong việc ra hoa sớm in vitro ở loài lan này.

Đối với Dendrobium Sonia 17, Tee et al. (2008) đã phát hiện ra rằng một môi trường được làm giàu với P cao và N thấp (KH2PO4 đã được sử dụng ở nồng độ tương ứng với 1,25 lần môi trường MS chuẩn trong khi hàm lượng nitơ [cả KNO3 và (NH4)2NO3] đã giảm xuống 0,25 lần) hiệu quả trong việc cảm ứng nở hoa trong khi hàm lượng P thấp và N cao (nồng độ KH2PO4 tương ứng 0,25 lần so với môi trường MS chuẩn trong khi hàm lượng nitơ [cả KNO3 và (NH4)2NO3] chỉ có thể thúc đẩy hiệu quả hình thành chồi . Trong 52% số cây con hình thành hoa trong môi trường BA và môi trường chứa P cao và N thấp, trong khi chỉ có 20% số cây con hình thành hoa trong nửa hàm lượng môi trường MS có chứa BA mà không sửa đổi tỷ lệ P / N sau 4 tháng. Phương pháp tạo ra hoa trong ống nghiệm có thể lặp lại khi môi trường chứa 20 uM BA, các quan sát đã được củng cố bởi Sudhakaran et al. (2006) cho cùng một loại lan. Các hình thái khác nhau của hoa in vitro như cấu trúc hoa không hoàn chỉnh, hoa in vitro bất thường và không được phục hồi đã được quan sát. Không bổ sung paclobutrazol (PBZ) trong môi trường nuôi cấy, không có nụ hoa nào được tạo ra trong Friederick’s Dendrobium (Te-Chato et al., 2009). Nồng độ PBZ thấp (0,025 mg/l) đã thúc đẩy một số lượng nhỏ nụ hoa (10%), PBZ ở mức 0,05 mg/l cho tỷ lệ cảm ứng nụ hoa cao nhất (29%) và nồng độ PBZ cao nhất (0,1 mg/l) cung cấp mức thấp nhất (6,95%) của cảm ứng nụ hoa. Hoa thu được từ tất cả các môi trường chứa PBZ, tức là ở tất cả các nồng độ PBZ, cho thấy hình thái bình thường. Cây Dendrobium nobile (Wang et al., 2009) hình thành các chồi hoa in vitro (33.3. Sự ra hoa xảy ra trong vòng 4 tháng nuôi với sự có mặt của 0,1 mg/l TDZ và tần suất hình thành nụ hoa tăng lên 95,6% bằng cách trồng cây con trong 0,3 mg/l PBZ +0,5 mg/l NAA sau đó là PBZ và TDZ. TDZ (0,05-0,1 mg/l) và PBZ (0,5-1,0 mg/l) có hiệu quả hơn trong việc tạo ra nụ hoa so với BA. Hoa phát triển bị biến dạng ở 25oC nhưng chúng phát triển đầy đủ khi được trồng ở nhiệt độ thấp hơn (23oC / 18oC, sáng / tối) trong 45 ngày. Eulophia graminea rhizomes có nguồn gốc từ hạt in vitro tự nhiên mọc thành cuống hoa sau đó ra hoa và kết quả sau đó để hoàn thành một vòng đời đầy đủ. Khoảng 44-61% rễ bất định tạo ra flower stems từ đỉnh. Trong số các loài hoa, 50% cho thấy các cơ quan hoa bình thường, 40% thiếu cả hai bên trái và bên phải, 10% chỉ thiếu cánh hoa bên phải trong khi 18% hoa cho thấy giao phối tự phát và quả phát triển. Các hạt giống đã được thu hoạch và gieo, với 59,6% nảy mầm (Chang et al., 2010). Sotthikul et al. (2010) tạo ra hoa in vitro và quả trong Polystachya sp. nhưng không có lý do cụ thể được cung cấp để giải thích các hiện tượng.

Nhân tố cảm ứng hoa in vitro trong hoa lan


Bản chất của tín hiệu gây ra sự ra hoa vẫn chưa rõ ràng mặc dù các nghiên cứu sinh lý về quá trình chuyển đổi hoa đã dẫn đến việc xác định một số tín hiệu hoa giả định bao gồm CK, sucrose, gibberellin và giảm các hợp chất N (Corbesier & Coupland 2006). Để kết hợp sự phức tạp này, nhiều yếu tố như photoperiod, chiếu xạ, nhiệt độ và kiểm soát nội tiết tố cũng ảnh hưởng đến sự ra hoa trong ống nghiệm của hoa lan (Chia et al. 1999) (Hình 1).

Photoperiod


Photoperiod có ảnh hưởng đáng kể đến việc ra hoa trong ống nghiệm. Hoa lan dài ngày cần ít ánh sáng nhất để ra hoa và hoa lan ngắn ngày không thể vượt quá điểm bão hòa ánh sáng. Zhu (2006) đã báo cáo rằng cảm ứng hoa trong ống nghiệm của Cymbidium kanran bị ảnh hưởng đáng kể bởi photoperiod. Tỷ lệ cảm ứng chồi giảm dần khi thời gian ánh sáng kéo dài từ 8 giờ đến 14 giờ trong khi tỷ lệ cảm ứng nụ hoa cao nhất (41,67%) đã đạt được trong một photoperiod 8 giờ. Tuy nhiên, tỷ lệ cảm ứng chồi là 28,26% trong photoperiod 16 giờ, cao hơn so với photoperiod 12 hoặc 14 giờ, nhưng nụ hoa cảm ứng không phát triển thành nở hoàn toàn. Jia và cộng sự (2000) đã lưu ý rằng cảm ứng hoa trong ống nghiệm của Cymbidium oblifolium chỉ có thể đạt được với ánh sáng liên tục và không xảy ra trong bóng tối.

Vaz et al. (2004) đã ghi nhận mối quan hệ tích cực giữa ngày dài và sự hình thành floral spike của Psygmorchis pusilla. Tuy nhiên, việc ủ thực vật dưới một photoperiod 20 giờ hoặc lâu hơn cho thấy sự phát triển của chồi hoa bị giảm đi, trong đó sự tổng hợp bị ức chế và tuổi thọ của hoa giảm. Ngược lại, các photoperiod 12 và 16 giờ dẫn đến những bông hoa được nở hoàn hảo trong khi những nụ hoa được giữ trong bóng tối không nở ra ngay cả khi một floral spike được tạo ra. Hai phản ứng ra hoa chính đã được xác minh, đó là khi chuyển photoperiod từ 6 đến 8 giờ và từ 22 giờ sang ánh sáng liên tục. Sự gia tăng số lượng floral spike dưới 8 giờ và ánh sáng liên tục có thể liên quan đến sự tích lũy carbohydrate được quan sát ngay trước các photoperiods 6 và 22 giờ. Sự gia tăng hàm lượng carbohydrate này có thể đã thúc đẩy sự phát triển của các nụ hoa có từ trước, được giữ im lìm dưới các photoperiod ngắn hơn. Tuy nhiên, sự hình thành floral spike trong bóng tối có thể là kết quả của sự hấp thụ đường từ môi trường nuôi cấy (Vaz et al. 2004).

Nhiệt độ


Mặc dù quá trình vernalization có thể gây ra hoặc tạo điều kiện cho hoa trong một số chi phong lan, tác dụng của nó không nhất quán trong họ thực vật này. Tuy nhiên, nhiệt độ thường được sử dụng để kiểm soát thời gian ra hoa trong môi trường nuôi cấy thương mại của một số loài lan như Cymbidium, Dendrobium và Phalaenopsis (Chen et al., 1994; Goh & Arditti, 1985; Hew & Yong, 1997). Tuy nhiên, sự tương đồng giữa hiệu ứng nhiệt độ đối với cây trồng trong ống nghiệm và ex vitro không phải là quy tắc cho tất cả các loài. Spikes thường xuất hiện khi nhiệt độ trên 28oC trong giai đoạn tăng trưởng; yêu cầu nhiệt độ thấp (20 C hoặc 25 C) đối với cảm ứng hoa in vivo đã được ghi nhận cho Phalaenopsis (Sakanishi et al., 1980) và nhiệt độ ngày/đêm (25oC / 20oC hoặc 25oC/15oC) là phù hợp cho cảm ứng nụ hoa (Wang et al., 2005). Khi Phalaenopsis amabilis được trồng ở nhiệt độ cao (30/25 C, ngày / đêm), sự ra hoa đã bị chặn và điều này có thể được đảo ngược bằng cách xử lý gibberellin A3 hoặc gibberellic acid (GA3) (Wang et al., 2005). Tương tự, GA3 và nhiệt độ ảnh hưởng đến hàm lượng carbohydrate và ra hoa trong Phalaenopsis, mặc dù không có chi tiết cụ thể nào được cung cấp bởi các tác giả (Chen et al., 1994). Tuy nhiên, Duan & Yazawa (1995a) đã báo cáo rằng các phương pháp điều trị nhiệt độ thấp (sử dụng nhiệt độ ngày / đêm 25/15oC và 25/10oC) không thúc đẩy sự hình thành của nụ hoa trong ống nghiệm và cho rằng các điều kiện để tạo ra chồi hoa trong Phalaenopsis in vitro có thể khác với chồi in vivo.

Vaz et al. (2004) đã báo cáo độ nhạy cao đối với sự thay đổi nhiệt độ của Psygmorchis pusilla, 27oC là thích hợp nhất cho sự phát triển, hình thành lá và cành hoa. Nhiệt độ 22oC và 32oC không phù hợp để phát triển P. pusilla trong ống nghiệm. Nhiệt độ cao có thể làm tăng tốc độ hô hấp và giảm hấp thụ CO2, dẫn đến sự suy giảm carbohydrate, do đó ức chế sự tăng trưởng và trì hoãn sự ra hoa. Ngoài ra, việc giảm đáng kể hàm lượng sắc tố quan sát được ở P. pusilla được ủ dưới 32oC có thể gây ảnh hưởng xấu đến hệ thống quan điện ở thực vật. Su et al. (2001) đã đề xuất rằng sự ức chế ra hoa ở cây Phalaenopsis được điều trị nhiệt độ cao có liên quan đến lượng gibberellin nội sinh quá thấp. Tuy nhiên, ở P. pusilla, sử dụng GA3 không thể tăng cường sự hình thành cành hoa trong ống nghiệm (Vaz et al., 2004).

Wang và cộng sự (2009) báo cáo sự phát triển hoa bị biến dạng của Dendrobium nobile ở 25oC nhưng phát triển bình thường ở chế độ nhiệt độ thấp hơn (23oC / 18oC, sáng / tối) trong 45 ngày. Chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm có thể có lợi cho sự tích tụ carbohydrate (Bernier et al., 1993).

Dinh dưỡng


Sự ra hoa trong ống nghiệm bị ảnh hưởng bởi mức độ và tỷ lệ của hai thành phần chính là carbohydrate và khoáng chất (được đánh giá bởi Scorza, 1982; Tee và cộng sự, 2008; Ziv & Naor, 2006). Đường được coi là nguồn carbon cần thiết trong môi trường nuôi cấy cho sự phát triển và phát triển của hoa. Vu và cộng sự (2006) cho rằng sucrose là yếu tố duy nhất cần thiết trong việc tạo ra nụ hoa hoặc phát triển ban đầu trong khi các yếu tố khác được yêu cầu để giúp chúng phát triển đầy đủ trong các giai đoạn sau của hình thái hoa in vitro, nồng độ sucrose thích hợp nhất là 30 mg/l. Trong môi trường MS, nồng độ N cao thường ức chế sự ra hoa và thúc đẩy tăng trưởng thực vật trong khi sử dụng môi trường khoáng ½ MS hoặc giảm mức độ nitơ tăng cường trong quá trình ra hoa in vitro ở Cymbidium (Kostenyuk et al., 1999), Doritis (Duan & Yazawa , 1994a) và Phalaenopsis (Duan & Yazawa, 1995a). Duan & Yazawa (1994a) đã báo cáo tỷ lệ phần trăm của các mẫu có nụ hoa trên môi trường VW là 93,3% nhưng lưu ý rằng không có sự hình thành nụ hoa trên môi trường MS, mặc dù không thể thiếu sự hiện diện của sucrose ở 25 hoặc 50 g/l. P cao và N thấp trong môi trường kích thích ra hoa ở Cymbidium (Duan & Yazawa, 1994a; Kostenyuk et al., 1999) và Dendrobium (Tee et al., 2008). Tee và cộng sự (2008) báo cáo 52% cây con được nuôi cấy trên môi trường chứa BA có hàm lượng P cao và N thấp hình thành hoa trong khi chỉ có 20% số cây con hình thành hoa trong môi trường ½ MS chứa BA mà không có bất kỳ thay đổi nào về tỷ lệ P / N sau bốn tháng. Tỷ lệ chồi bất định với nụ hoa giảm và thời gian cần thiết để tăng chồi hình thành. Nồng độ N (4,5 uM) được thử nghiệm thấp nhất trong môi trường VW là hiệu quả nhất để hình thành các nụ hoa trong Phalaenopsis (Duan & Yazawa, 1995a). Kostenyuk và cộng sự (1999) đã báo cáo rằng cây Cymbidium đã được cắt bỏ gốc được nuôi cấy trong môi trường MS có chứa BA với hàm lượng P cao và N đạt được lượng hoa in vitro cao gấp 2,5 lần so với môi trường nuôi cấy trong môi trường MS có chứa BA mà không có sửa đổi tỉ lệ P/N.  Ngoài ra, tỷ lệ NH4/NO3 là một yếu tố quan trọng cho sự ra hoa của cây in vitro (vì nó là sự phát triển của các cơ quan khác (Teixeira da Silva et al., 2005). Nồng độ NH4 thúc đẩy sự ra hoa trong ống nghiệm (Duan & Yazawa, 1994a; Kachonpadungkitti et al., 2001).

Duan & Yazawa (1994a) cũng báo cáo môi trường của VW phù hợp với sự hình thành của nụ hoa và sự phát triển của floral stalks khi bổ sung BA, nhưng nó không phù hợp để ra hoa sau đó; ngược lại, môi trường Hyponex (với tỉ lệ rất thấp NH4/ NO3) đã gây ra sự cảm ứng hoặc hoa cũng không cho phép chúng phát triển, nhưng nó có thể cảm ứng ra hoa trong nụ hoa hình thành từ môi trường VW bổ sung BA. Kết quả tương tự đã được báo cáo cho Dendrobidium strongylanthum bởi Zhao et al (2012). Vaz & Kerbauy (2000) đã báo cáo mối tương quan nghịch giữa tổng nồng độ muối khoáng và số lượng flower spikes của Psygmorchis pusilla. Nồng độ N hình thành hoa kích thích thấp và hiệu ứng này rõ rệt hơn so với mức độ muối được sử dụng thấp nhất. Sự hiện diện của NH4 trong môi trường là điều cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cây, trong khi sự vắng mặt của NO3 làm giảm điều đó. Sự hình thành hoa cũng được tăng cường bằng một nửa nồng độ ion của P và K trong khi nồng độ Ca cao nhất cho thấy một số kích thích hoa. Cây trồng trong điều kiện thiếu chất dinh dưỡng có màu vàng dễ thấy hơn so với cây được trồng trên môi trường chuẩn.

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR)


Auxins và cytokinins

Trong hầu hết các nghiên cứu ra hoa in vitro của hoa lan, một PGR đơn lẻ như BA, 2iP, TDZ, PBZ, ABA, KN, GA3, TIBA (axit 2,3,5 triiodobenzoic) hoặc NAA, hoặc kết hợp các PGR và chất dinh dưỡng khác là Được sử dụng để gây ra sự ra hoa trong ống nghiệm (Chang & Chang, 2003; Duan & Yazawa, 1994a; Kostenyuk et al., 1999; Sim et al., 2007; Te-Chato et al., 2009; Wang et al., 2009). BA đã được sử dụng cho hầu hết các thí nghiệm ra hoa in vitro của một số loài lan, bao gồm Dendrobium primulinum Lindl (Deb & Sungkumlong, 2009), Doriella Tiny (Duan & Yazawa, 1994a), Dendrobium Chao Praya Smile (Hee et al., 2007) , Cymbidium niveo-marginatum Mak (Kostenyuk et al., 1999), Cymbidium oblifolium var. misericors (Chang & Chang, 2003), Dendrobium Madame Thong-In (Sim et al., 2007), Dendrobium candum (Wang et al., 1997), và Dendrobium nobile (Wang et al., 2009), Psygmorchis pusilla (Vaz & Kerbauy, 2008b), Bulbophyllum auricomum (Than et al., 2009), Dendrobidium strongylanthum (Zhao et al., 2012).

Tuy nhiên, nồng độ BA phù hợp nhất cho thấy phạm vi rộng tùy thuộc vào loài lan. Duan & Yazawa (1994b) đã báo cáo 94,7% chồi hình thành nụ hoa trong môi trường VW với 5 mg/l BA trong Doriella Tiny và nụ hoa hình thành trên môi trường VW có bổ sung KN, Z và 2iP, ngoại trừ Z (5 mg/l) trong đó 13% mẫu thí nghiệm tạo ra nụ hoa, nhưng khi môi trường được bổ sung BA, cảm ứng hoa tiếp theo bị ức chế. Tương tự, hơn 70% chồi hình thành nụ hoa trong môi trường VW với 5 mg/l BA trong Phalaenopsis (Duan & Yazawa, 1995a). Than et al. (2009) đã báo cáo ra hoa in vitro trong vòng sáu tháng sau khi gieo hạt giống củ cải, với tỷ lệ ra hoa cao nhất (50±15,8%) quan sát thấy trong môi trường MS với 1,0 mg/l BA + 0,5mg/l NAA; Hee và cộng sự. (2007) báo cáo 45% các chồi hình thành nụ hoa với 11,1 uM (2,0 mg/l) BA, trong khi Wang et al. (1997) báo cáo rằng 82,8% chồi Dendrobium candum hình thành nụ hoa trên môi trường MS với 0,01 mg/l BA. Wang và cộng sự. (2009) báo cáo rằng một liều cao BA (1,0 mg/l) có hiệu quả hơn đối với cảm ứng nụ hoa (20,0%) với liều thấp hơn (0 Nott0,5 mg/l). Chang & Chang (2003) đã báo cáo rằng 10-33 uM 2iP và 3,3-10 uM TDZ đã tạo ra các cụm hoa hiệu quả hơn 0,1-33 uM BA.

Sim et al. (2007) báo cáo BA đơn lẻ trong môi trường không hiệu quả đối với cảm ứng hoa, nhưng với sự hiện diện của CW, 22,4 uM BA đã tăng cường hình thành cuống phát hoa trước đó và thúc đẩy cảm ứng nụ hoa. Nadgauda và cộng sự (1990) đề xuất rằng các CK có thể liên quan đến sự ra hoa trong ống nghiệm có lẽ với việc cung cấp các chất ức chế inositol và CK oxydase của CW, thúc đẩy các phản ứng của CK. Vai trò của CK trong việc nở hoa có thể là trong việc kiểm soát hoạt động phân bào sớm, khởi phát sớm các mô phân sinh ở nách và tăng tỷ lệ hình thành bởi mô phân sinh (Scorza & Janick, 1980). Ngoài ra, CK được trích dẫn là một thành phần có thể kích thích ra hoa đa yếu tố (Bernier, 1988). BA cũng được yêu cầu cho sự phát triển in vitro bình thường của nụ hoa hồng (Vu et al., 2006), có thể điều chỉnh sự phát triển của hoa thông qua các gen kiểm soát hoạt động mô phân sinh chồi (Lindsay et al., 2006).

TDZ hiệu quả hơn BA đối với cảm ứng nụ hoa trong ống nghiệm cho Cymbidium niveo-marginatum Mak (Kostenyuk et al., 1999), Cymbidium oblifolium (Chang & Chang, 2003) và Dendrobium Second Love (Ferreira et al., 2006), nhưng TDZ gây ra sự tăng trưởng thực vật kém, và nụ hoa khô héo sớm (Kostenyuk et al., 1999). Wang và cộng sự (2009) cũng báo cáo rằng TDZ thúc đẩy sự hình thành chồi hoa (31,9-34,8%) tốt hơn BA ở nồng độ thấp (0,05-0,1 mg/l). TDZ kích thích sự tổng hợp của CK nội sinh và tiêu diệt CK oxydase (Murthy et al. 1998) và điều đó có thể được coi là nguyên nhân gây ra sự đáp ứng cao hơn trong CK nội sinh. Ngoài ra, có một số bằng chứng cho thấy TDZ có thể ảnh hưởng đến mức độ nội sinh của IAA (Ferreira et al., 2006; Murthy et al., 1995). Ferreira và cộng sự. (2006) đã báo cáo rằng 1,8 uM TDZ gây ra sự gia tăng tỷ lệ CK / IAA cho việc xác định hoa giữa 10 và 25 ngày nuôi, với việc giảm mạnh trong sự phát triển của nụ hoa sau 25 ngày nuôi cấy. Ngoài ra, Chen (2012) đã báo cáo rằng khi callus một tuổi của Oncidium ” Gower Ramsey ”, được cảm ứng và cấy ghép với 3 mg/l TDZ và 5 mg/l dicamba (dòng 13 callus), đã được chuyển vào môi trường ½ MS bổ sung 0,1 mg/l NAA và 3 mg/l TDZ, nó đã cho số lượng phôi mang cánh hoa cao nhất. Đặc điểm ra hoa của cây con từ phôi bình thường và petal-bearing không khác nhau đáng kể.

Te-chato et al. (2009) báo cáo PBZ ở mức 0,05 mg/l cho tỷ lệ cao nhất (29%) của cảm ứng nụ hoa của Friederick từ Dendrobium. Hoa thu được ở tất cả các nồng độ PBZ có hình thái bình thường. Wang và cộng sự (2009) báo cáo PP333 ở nồng độ cao (0,5-1,0 mg/l) thúc đẩy sự hình thành nụ hoa (28,9-33,3%) nhưng giảm đáng kể tỷ lệ chồi hoa (8,9-17,0%) ở nồng độ thấp (0,05-0,1 mg/l). Kết quả này không đồng ý với những phát hiện rằng PP333 hoàn toàn ngăn chặn các tác động cảm ứng của CK (Kostenyuk et al., 1999). TDZ (0,05-0,1 mg/l) và PP333 (0,5-1,0 mg/l) có hiệu quả hơn trong việc tạo ra nụ hoa của cây Dendrobium nobile so với BA (Wang et al., 2009). Chang & Chang (2003) đã báo cáo, trong số tám CK được thử nghiệm, chỉ có TDZ, 2iP và BA được tạo ra từ rễ, với TDZ và 2iP có hiệu ứng cảm ứng mạnh hơn BA, tương ứng. Năm cytokinin khác [KN, DPU (1,3-diphenylurea), ADE (6-aminopurine), Zea, ZR] đã thử nghiệm gây ra sự tăng sinh rễ và hình thành chồi nhưng không ra hoa.

Cen et al (2010) đã báo cáo rằng trong số các phương pháp xử lí đơn nhân tố nội tiết, nồng độ thích hợp nhất cho sự hình thành nụ hoa là 0,2 mg/l PBZ (8,5%) trong khi 0,06 mg/l TDZ dẫn đến 15,5% chồi hình thành nụ hoa; một thí nghiệm PGR đa yếu tố xếp hạng hiệu ứng PGR trên cảm ứng ra hoa như sau: PBZ+BA+NAA+TDZ > PBZ+BA+NAA > PBZ+BA và PBZ+NAA; phương pháp xử lí phù hợp nhất là 0,3 mg/l PBZ+0,5 mg/l BA+0. 5 mg/l+NAA 0,06 mg/l TDZ. Tỷ lệ hình thành nụ hoa và tỷ lệ hoa nở lần lượt đạt 80,4% và 90,3%. PBZ và TDZ đều có thể cảm ứng ra hoa trong ống nghiệm của Dendrobium docinale Kimura et Migo mặc dù tác dụng của TDZ mạnh hơn PBZ (nghĩa là gây ra nhiều nụ hoa hơn).

Wang và cộng sự (1997) đã báo cáo rằng tần số ra hoa của Dendrobium candum đã tăng lên hơn 80% khi tiền xử lý protocorms trong môi trường 0,5 mg/l ABA sau đó chuyển vào môi trường MS với 2,0 mg/l BA. Wang và cộng sự (2009) đã báo cáo 1,0 mg/l PBZ + 0,1 mg/l TDZ cảm ứng ra hoa trong ống nghiệm trên một nửa số chồi Dendrobium nobile (62,2%) được nuôi cấy trước trên môi trường ½ MS bổ sung PA (0,5 mg/l PBZ + 0,5 mg/l ABA); 15,4% hoa là bình thường. Tuy nhiên, 95,6% chồi có thể được tạo ra để hình thành nụ hoa sau khi nuôi cấy trong môi trường PN (0,3 mg/l PP333 + 0,5 mg/l NAA), sau đó chuyển vào môi trường MS nửa cường độ với 1,0 mg/l PBZ + 0,1 mg/l TDZ ; trong trường hợp này, 27,8% hoa là bình thường. Một mô hình tương tự đã được quan sát thấy trong Dendrobium moniliforme (L.) SW. (Wang và cộng sự, 2006).

Goh & Yang (1978) đã chứng minh rằng IAA có thể ngăn chặn hiệu ứng thúc đẩy của BA đối với sự ra hoa ở hai giống lai Dendrobium. Wang và cộng sự (1997) báo cáo có một số cây Dendrobium candum có rễ ra hoa trong ống nghiệm, mặc dù tỷ lệ ra hoa trong ống nghiệm thấp hơn nhiều so với cây không có rễ. Wang và cộng sự (1997) cũng báo cáo rằng NAA đơn lẻ đã ngăn chặn sự hình thành hoa, có thể là do rễ đóng vai trò là nơi sinh tổng hợp chính của CK, do đó, cây con có rễ ít nhạy cảm với CK ngoại sinh hơn so với cây không có rễ (Wang et al., 1997). Mặt khác, rễ tái sinh có thể là một bồn chưa cho một số chất cần thiết cho sự khởi đầu của hoa hoặc để tiến hành một số tín hiệu ức chế cảm ứng hoa, như xảy ra trong cây thuốc lá (được đánh giá bởi McDaniel, 1996).

Tầm quan trọng của các đồng đẳng iP và các loại CK khác trong việc ra hoa đã được quan sát bởi nhiều tác giả. Sim et al (2008) đã báo cáo các CK, đặc biệt là iP và iPA, đóng một vai trò quan trọng trong việc ra hoa sớm in vitro của Dendrobium Madame Thong-In. Ferreira và cộng sự (2006) đã phát hiện ra rằng sau khi nuôi cấy chồi Dendrobium Dendrobium Second Love trong môi trường có chứa TDZ cảm ứng hoa trong ống nghiệm trong 5 ngày, mức độ nội sinh của iP9G [N6-(▲2-isopentenyl)-adenine-9 glucoside], zeatin-9 glucoside (Z9G) và Z tăng, nhưng mức độ iP không thay đổi nhiều.

Gibberellins
Một lượng GA đủ là cần thiết cho sự ra hoa, và sự thiếu hụt trong con đường sinh tổng hợp GA làm tăng độ nhạy của photoperiodic. Nồng độ cao của GA3 ức chế nụ hoa và nở hoa (Kostenyuk et al., 1999).

Abscisic acid và ethylene
Nhiều quan sát sơ bộ cho thấy vai trò của ABA là ức chế sự ra hoa trong ống nghiệm (Vaz & Kerbauy, 2008b). Tiếp xúc với ethylene có khả năng gây ra sự ra hoa ở một số loài. Tần số ra hoa tiếp tục tăng lên trung bình 82,8% khi xử lý trước các protocorm trong môi trường chứa 0,5 mg/l ABA, sau đó chuyển vào môi trường với 2,0 mg/l BA (Wang et al., 1997). Sự tổng hợp được ưu ái bằng cách loại bỏ ethylene bằng cách sử dụng KMnO4-trap (Vaz & Kerbauy, 2000).

Polyamines
Polyamines đóng một vai trò quan trọng trong sự khởi đầu của hoa trong ống nghiệm của Dendrobium candum. Việc bổ sung 20 mmol/l spermidine, hoặc 2,0 mg/l BA, hoặc sự kết hợp 0,5 mg/l NAA và BA trong môi trường nuôi cấy đã tạo ra các protocorms hoặc chồi ra hoa trong vòng 3-6 tháng với tần suất 31,6-45,8% (Wang et al., 1997). Polyamines được cho là kết hợp với CK trong việc kiểm soát một số quy trình, bao gồm phân chia tế bào (Kuznetsov & Shevyakova, 2007; Pang et al., 2007). Tuy nhiên, chức năng chính xác của chúng trong quá trình ra hoa vẫn chưa được biết đến (Wang et al., 1997).

Một số điều kiện khác
Bổ sung thêm vào môi trường truyền thống
Sim et al (2007) đã báo cáo CW là cần thiết cho sự tăng trưởng của protocorms và cho sự chuyển đổi mô phân sinh đỉnh chóp thực vật của Dendrobium Madame Thong-In sang mô phân sinh hoa: tỷ lệ các protocorm có cuống hoa tăng lên khi nồng độ CW ( 50, 100 và 150 ml/l) tăng. Kết quả tương tự đã đạt được với Doriella Tiny (Duan & Yazawa, 1994b), nhưng riêng CW đã không tạo ra sự hình thành của nụ hoa. CW chứa đường, vitamin, axit amin và PGR (Tulecke et al., 1961; Raghavan, 1966). Ge et al. (2006) và Sim et al. (2008) đã tìm thấy ZR là một trong những CK chính trong CW.

Việc bổ sung AC vào agar Gelrite-rắn làm giảm hiệu quả nồng độ BA cho quá trình ra hoa in vitro (Sim et al., 2007) vì AC được biết là hấp thụ nhiều loại phân tử, bao gồm cả các chất tăng trưởng được thêm vào môi trường nuôi cấy (Weatherhead et al. , 1978; Thomas, 2008).

Trạng thái explant

Sim et al (2007) đã lưu ý rằng sự hiện diện của rễ nhỏ trong các protocorms non của Dendrobium Madame Thong-In không ảnh hưởng đến phản ứng của chúng đối với môi trường giàu BA khi so sánh với các protocorms non không có rễ về sự hình thành chồi nách, sản xuất rễ, tỷ lệ phần trăm của các mẫu ra hoa và nụ hoa.

Phương pháp nuôi cấy


Sim et al (2007) đã báo cáo việc sử dụng môi trường hai lớp (chất lỏng bọc trên Gelrite rắn) để thúc đẩy cảm ứng ra hoa, nụ hoa và sự phát triển hoa từ các protocorms của Dendrobium Madame Thong-In. Thể tích môi trường lỏng trong hệ thống hai lớp này cũng ảnh hưởng đến sự hình thành nụ hoa và sự phát triển của hoa. Tỷ lệ hoa bình thường cao nhất được sản xuất là với 20 ml môi trường KC (Knudson, 1946) được bổ sung 22,2 uM BA (K5, 75%), tiếp theo là 43% trong 30 ml K5 và 26% trong 5 ml K5. Phương pháp này cũng đã được áp dụng thành công để tạo ra sự ra hoa trong ống nghiệm của một giống Dendrobium lai khác, Chao Praya Smile (Hee et al., 2007). Tuy nhiên, trong D. Second Love, các chồi có thể được tạo ra để tạo hoa trong ống nghiệm sau khi nuôi cấy trong môi trường đông đặc Phytagel với 1,8 mM TDZ (Ferreira et al., 2006). Do đó, trạng thái vật lý của môi trường chất lỏng hoặc môi trường gelrite rắn và có lẽ là việc trao đổi khí (môi trường lỏng) cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình ra hoa trong ống nghiệm.

Thụ phấn trong ống nghiệm và đậu quả


Nhân giống hoa lan bao gồm thụ phấn, sinh trưởng hạt mầm, phát triển protocorm, tăng trưởng in vitro của cây con và thành lập ex vitro của cây con (Hossain et al., 2013). Toàn bộ chu kỳ sinh sản kéo dài từ 3 đến 5 năm tùy thuộc vào kiểu gen liên quan (Hee et al., 2007; Kamemoto et al., 1999). Sim et al (2007) đã báo cáo rằng hoa in vitro tự thụ phấn nhân tạo hoặc thụ phấn chéo bằng cách thụ phấn từ phấn của hoa trong ống nghiệm nhưng không thành công mặc dù thụ phấn trong ống nghiệm đã thành công (đạt được kết quả) nếu bao phấn từ cây mẹ in vivo đã trưởng thành được thu hoạch, khử trùng bề mặt và phấn từ những bông hoa như vậy dùng để thụ phấn cho hoa in vitro. Tuy nhiên, mật độ (số lượng) của hạt giống được thụ phấn trong ống nghiệm thấp so với hạt giống được thụ phấn in vivo và hầu hết các hạt trong ống nghiệm dường như không có khả năng sinh sản (khoảng 0,1% số hạt là màu mỡ) và chỉ một vài hạt nảy mầm. Tuy nhiên, Hee và cộng sự (2007) đã báo cáo, mặc dù tỷ lệ nảy mầm của phấn hoa có nguồn gốc từ hoa in vitro phát triển thấp, sự thụ phấn của hoa in vitro và sự hình thành hạt giống sau đó đã tạo ra một số lượng lớn hạt giống đủ cho mục đích nhân giống.

Quá trình từ hạt nảy mầm đến sản xuất thế hệ hạt giống tiếp theo trong nuôi cấy có thể được rút ngắn từ hơn 35 tháng xuống chỉ còn khoảng 11 tháng. Thành công của thụ phấn trong ống nghiệm và hình thành hạt khả thi ở Psygmorchis pusilla (Vaz & Kerbauy, 2008b), Dendrobium Chao Praya Smile (Hee et al., 2007) và Dendrobium Madame Thong-In (Sim et al., 2007) đã chứng minh rằng giao tử được tạo ra từ hoa in vitro có khả năng. Do đó, một hệ thống như vậy cũng có thể được sử dụng để xác định sớm khả năng lai sinh sản. Chiu et al (2011) báo cáo rằng sự phát triển và thụ tinh của ống phấn hoa đã thành công sau khi thụ phấn bằng tay trong ống nghiệm. Hợp tử đã được quan sát thấy trong túi phôi 3-4 sau khi thụ phấn (Wap). Trái cây bắt đầu phát triển ở 6 Wap, với hạt chứa phôi trong một phút, nhưng chúng không thể nảy mầm. Tỷ lệ nảy mầm của hạt là 7,5% tại 8 Wap và 39,4-62,7% tại 10-14 Wap. Các loại quả có thể tạo ra hơn 63838/hạt nang và hơn 95% hạt chứa phôi; tuy nhiên, không có thí nghiệm nảy mầm tiếp theo kiểm tra khả năng sống sót của hạt có nguồn gốc từ quả in vitro. Trong nghiên cứu của chúng tôi về Dendrobium candum, từ hạt nảy mầm đến sản xuất hạt giống thế hệ tiếp theo trong nuôi cấy có thể rút ngắn từ hơn 36 tháng xuống chỉ còn khoảng 8 tháng và sự phát triển của hạt giống chỉ cần 60 ngày từ quá trình thụ phấn so với 120-150 ngày trong vivo (nhà kính), tỷ lệ nảy mầm từ quả in vitro là hơn 85%, tương tự như hạt từ in vivo (chưa được công bố).

Do đó, toàn bộ chu kỳ sinh sản có thể được rút ngắn đáng kể. Chang et al (2010) đã cho thấy các rễ có nguồn gốc từ hạt in vivo hoặc in vitro của Eulophia graminea mọc lên một cách tự nhiên, ra hoa và sau đó được kết thúc để hoàn thành một vòng đời hoàn chỉnh mà không cần thụ phấn nhân tạo trong môi trường Woody Plant (WPM) , 1981) đã được bổ sung với 1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA, 1gl1 AC và 20 g/l sucrose. Tổng cộng có 4 thế hệ được nuôi cấy trong khoảng thời gian 4 năm.

Cơ chế có thể của hoa in vitro trong hoa lan


Một số báo cáo đã chỉ ra rằng sự ra hoa trong hoa lan được thực hiện bằng hiệu ứng đồng bộ kết hợp của nhiều chất nội sinh, đặc biệt là PGR (Bhadra & Hossain, 2003; Hsiao et al., 2011; Kostenyuk et al., 1999; Wang, 1988). Thao tác thích hợp của PGR với liều lượng thích hợp cho một explant thích hợp có thể tạo ra sự ra hoa trong ống nghiệm, đặc biệt là trong hoa lan (Vaz & Kerbauy, 2008a). Tuy nhiên, các điều kiện thí nghiệm khác nhau và các loại lan có thể có tác dụng khác nhau. Đối với Phalaenopsis, CK (ví dụ BA) kích thích ra hoa, và auxin ngăn chặn tác dụng của BA; GA3 không hiệu quả khi áp dụng một mình nhưng khi được thêm vào kết hợp với BA, nó dường như tăng tốc hiệu quả của BA một chút (Goh & Arditti, 1985; Goh & Yang, 1978; Hew & Clifford, 1993). Đối với Dendrobium (Lee & Koay, 1986), Doritaenopsis và Phalaenopsis (Blanchard & Runkle, 2008), GA3 không kích thích tác dụng của BA. Việc khuyến khích ra hoa bằng cách áp dụng BA dường như cho thấy rằng các CK đóng vai trò trong việc điều chỉnh sự khởi đầu phát hoa của Doritaenopsis và Phalaenopsis, mặc dù việc thúc đẩy ra hoa phụ thuộc vào một số điều kiện nhất định (Blanchard & Runkle, 2008).

Gibberellin được cho là đóng một vai trò thiết yếu trong sự phát triển sinh dưỡng và sinh sản của thực vật (Arditti, 1992; Cecich, 1985; Tymoszuk et al., 1979). Chỉ 2,5 uM GA3 thúc đẩy hiệu quả sự phát sinh hoa ở Miltoniopsis (Matsumoto, 2006) bằng cách tăng chiều dài và kích thước flower spike (Sakai et al., 2000). Dewir et al.(2007) báo cáo rằng bắt buộc cần GA3 để chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản ở Spathiphyllum (Araceae), một cây cảnh nhiệt đới quan trọng. Tuy nhiên, Chen và cộng sự (1997) đã báo cáo rằng sự ra hoa của Phalaenopsis lai đã được gây ra rõ ràng bởi GA3 ở mức 1 mg/chồi ở nhiệt độ cao hơn (30 C ngày / 25 C đêm), và sự kéo dài nguyên thủy/khởi sự của hoa, mặc dù được thúc đẩy bởi GA3, đã bị ức chế hoàn toàn bởi phương pháp xử lí BA trong khi điều trị kết hợp với BA tăng chất lượng hoa. Trong Cymbidium niveo-marginatum, nồng độ cao của GA3 (15 mg/l) làm chậm sự ra hoa và làm giảm tỷ lệ cây biểu hiện cảm ứng hoa. Tuy nhiên, nó không hoàn toàn ngăn chặn cảm ứng hoa (Kostenyuk et al., 1999). Sự tắc nghẽn của sự phát triển hoa dưới nhiệt độ cao có thể được giải cứu bằng cách áp dụng GA3 một cách ngoại sinh, như đã thấy trong Phalaenopsis hybrida (Su et al., 2001).

Kiểm soát phân tử thời gian ra hoa và các chốt chặn (triggering) ở in vitro và ex vitro


Giai đoạn sinh sản trong thực vật hạt kín liên quan đến những thay đổi đáng kể ở đỉnh chồi thực vật và / hoặc chồi bên, mô phân sinh trong khi cây thân thảo hàng năm thường chết sau khi mang hoa / hạt (monocarpy), cây lâu năm (cây và cây bụi) tạo ra hoa trong suốt cuộc đời của chúng (polycarpy) (Ruan & Teixeira da Silva, 2012). Tuy nhiên, thật thú vị khi để ý rằng, mặc dù có cấu trúc thân thảo, tất cả các loài thuộc họ Phong lan đều là polycarpic.

Bất kể thói quen ra hoa, thành công sinh sản trong thực vật hạt kín phụ thuộc vào tuổi của cây, cũng như tín hiệu theo mùa của môi trường, như ánh sáng ban ngày (photoperiodism) và mùa đông (vernalization), trước đây được cảm nhận bởi lá trưởng thành (sắc tố phytochrom) trực tiếp trong chồi ngọn hoặc lá (Hình 2). Một số điều kiện môi trường thoáng qua, chẳng hạn như chất dinh dưỡng và dao động nước, cũng có thể ảnh hưởng đến thời gian ra hoa ở một số loài. Khi xem xét khả năng cung cấp chất dinh dưỡng, sự ra hoa trong ống nghiệm của chồi Dendrobium Second Love đã được cải thiện trong quá trình ủ trong môi trường pha loãng hơn của VW, khi so sánh với công thức MS đậm đặc hơn. Thói quen dinh dưỡng oligotrophic của loài lan epiphytic này được coi là một lời giải thích có thể cho kết quả in vitro đã đề cập ở trên (Ferreira, 2003).

Sự chuyển đổi từ sinh dưỡng sang tăng trưởng sinh sản xảy ra khi các tế bào mô phân sinh có khả năng phản ứng với các tín hiệu khởi đầu của ra hoa. Quá trình phát triển này, đại diện cho một sự kiện phức tạp và ít được hiểu rõ, liên quan đến nhiều cơ chế kiểm soát tín hiệu (Bernier et al., 1993; Huijser & Schmid, 2011), sẽ được thảo luận tiếp theo.

Nó đã được chứng minh rằng tín hiệu môi trường kích hoạt những thay đổi đáng kể trong quá trình trao đổi chất và tình trạng nội tiết tố trong thực vật. Tác dụng cảm ứng của phương pháp xử lí với cytokinin ngoại sinh và gibberellin đối với sự phát triển của cây đã được chứng minh đối với một số loài lan trưởng thành (Goh et al., 1982; Matsumoto, 2006). Tác dụng thuận lợi của cytokinin trong việc ra hoa lan in vitro đã được thảo luận rộng rãi trong tổng quan này. Tuy nhiên, mặc dù có rất ít nghiên cứu đã đề cập đến vai trò của hormone nội sinh trong quá trình phát triển này ở các loài phong lan, nhưng kết quả thu được đã chứng thực những gì được tìm thấy thông qua các phương pháp điều trị ngoại sinh. Mức độ nội tiết tố và sự ra hoa của hoa lan đã được nghiên cứu chủ yếu ở các loài lan thermoperiodic (Campos & Kerbauy, 2004; Chou et al., 2000; Sakanishi et al., 1980). Trong trường hợp này, các cây Phalaenopsis và Dendrobium được xử lý lạnh (nhóm Nobile) dẫn đến nồng độ các cytokinin nội sinh tăng lên, được đánh dấu bằng sự phong phú của các loại riboside zeatin và zeatin (Campos & Kerbauy, 2004; Chou et al., 2000). Theo Wang et al (2002), sự giảm ABA nội sinh trong chồi Phalaenopsis có thể liên quan đến sự phát triển chồi sinh sản bên. Hơn nữa, việc không ra hoa trong các cây đối chứng của Dendrobium Second Love được xử lý bằng 200 mg/l BA, chỉ ra rằng, mặc dù CK có thể là một tín hiệu cần thiết, chúng không có khả năng kích hoạt sự biệt hóa của nụ hoa (Campos & Kerbauy, 2004).

Gibberellin đại diện cho một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) quan trọng khác, với tác dụng dễ thấy, không chỉ ở một số cây ra hoa ngắn ngày, mà còn ở một số loài lan trưởng thành (Goh et al., 1982; Matsumoto, 2006). Cảm ứng ra hoa lạnh và tích lũy carbohydrate trong cây Phalaenopsis trưởng thành đều được thay thế bằng phương pháp điều trị gibberellin (Chen et al., 1994; Su et al., 2001). Tầm quan trọng của đường, như một yếu tố báo hiệu trong sự ra hoa, được thể hiện trong Hình 2.

Từ những quan sát trên, câu hỏi đặt ra là: điều gì dẫn đến sự phát triển sớm trong ống nghiệm của giai đoạn sinh sản ở một số cây lan non? Một kết luận dễ hiểu là một câu trả lời cho câu hỏi này rất khó, đặc biệt là khi xem xét rằng giai đoạn quan trọng này trong phát triển thực vật, được kiểm soát bởi nhiều con đường sinh lý và phân tử, ít được hiểu. Có lẽ, một số cái nhìn sâu sắc có thể được tìm thấy, nếu kiểm soát đa yếu tố của sự ra hoa thực vật đã được xem xét (Bernier et al., 1993). Theo các tác giả này, cảm ứng ra hoa sẽ xảy ra do kết quả của các cơ chế kiểm soát đa yếu tố, được thể hiện chủ yếu bằng các con đường truyền tín hiệu đường và hormone. Thực vật nuôi cấy in vitro được coi là có ít khả năng quang hợp để đạt được sự cân bằng carbon tích cực (Hew & Yong, 1977). Môi trường nuôi cấy, thông thường chứa tất cả các yếu tố chính liên quan đến việc ra hoa phong lan, chẳng hạn như PGR, đường và chất dinh dưỡng, bắt chước giả thuyết đa yếu tố, theo đề xuất của Bernier et al. (1993). Trên thực tế, môi trường bổ sung sucrose / CK rất quan trọng cho cả tăng sinh chồi (Ferreira & Kerbauy, 2002) và kích thích ra hoa trong ống nghiệm của Dendrobium Second Love (Ferreira, 2003). Tác dụng đáng kể của sucrose đối với sự ra hoa trong ống nghiệm cũng đã được chứng minh trong Doriella Tiny (Duan & Yazawa, 1994a). Do đó, có thể cho rằng trong một số trường hợp, thành phần môi trường, cùng với một số điều kiện ươm tạo môi trường, có thể bắt chước trạng thái nội sinh này (multifactorial), vì vậy cần thiết cho sự ra hoa của cây lan trưởng thành, bằng cách chuyển đổi mô phân sinh sinh dưỡng thành mô sinh sản.

Mặc dù có tính đa dạng cao và tầm quan trọng kinh tế của một số chi họ Phong lan, nghiên cứu về sinh lý phát triển của hoa lan vẫn còn tương đối khan hiếm. Các nghiên cứu có sẵn về đặc điểm này tập trung vào giai đoạn chuyển tiếp sinh dưỡng sang sinh sản hoặc đặc điểm cơ quan hoa (sepal, cánh hoa, label, nhị và carpel). Hơn nữa, những nghiên cứu này được đi sâu vào các nghiên cứu được thực hiện với mô hình cây mù tạt nhỏ, Arabidopsis thaliana (Brassicaceae).

Rõ ràng, một trong những trường hợp đầu tiên của bằng chứng liên quan đến kiểm soát chuyển đổi hoa ở cây lan đã được Yu & Goh (2000a) trình bày trong Dendrobium Madame Thong-In, nuôi cấy in vitro. Gen DOH1 bị cô lập có sự tương đồng lớn với gen KNOX thể hiện trong mô phân sinh đỉnh của A. thaliana.

Các nghiên cứu phân tử với A. thaliana đã chứng thực ý tưởng trước đây, rằng quá trình chuyển đổi mô phân sinh hoa có thể được kiểm soát, bằng một quá trình tín hiệu đường dài liên quan đến các tín hiệu hình thành lá di động (photoperiodism), hoặc trực tiếp bằng tín hiệu hình thành mô phân sinh (nhiệt hóa / phản ứng hóa) , cả hai được trình bày ngắn gọn trong Hình 2. Các tín hiệu ra hoa chính được tìm thấy ở A. thaliana, tức là photoperiodism, vernalization và hormone, giống như các tín hiệu được mô tả cho cây lan, cả ex vitro và in vitro. Mặc dù tên của các gen được sử dụng trong Hình 2 đề cập đến A. thaliana, các gen có chức năng tương đương (orthologous/không so sánh được) đã được mô tả trong các thực vật hạt kín khác, bao gồm cả hoa lan (Hou & Yang, 2009; Pan et al., 2011). Nghiên cứu gần đây về biểu hiện gen ở Phalaenopsis aphrodite, cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản; trong khi 762 được thể hiện ở trước, 2608 đã được tìm thấy trong giai đoạn sau (Su et al., 2011).

Ngày nay, FLOWERING LOCUS T (FT) có thể được coi là một gen tích hợp tốt hoa ly khai, đóng một vai trò quan trọng trong thời gian ra hoa (Huang và cộng sự, 2012). Protein FT nhỏ của nó có khả năng hoạt động như một tín hiệu florigen di động. ‘Bằng chứng tập thể từ một số phòng thí nghiệm, chủ yếu từ nghiên cứu về photoperiod, chỉ ra rằng FT và các chất tương đồng của nó (như TSF, ví dụ – Hình 2), là các phân tử tín hiệu phổ biến cho các loài thực vật có hoa (Turnbull, 2011).

Phân tích chức năng của FT ortholog trong Oncidium Gower Ramsey cho thấy sự tham gia của nó trong kiểm soát quang hóa của quá trình chuyển đổi hoa (Hou & Yang, 2009). Trong sự ra hoa của A. thaliana được điều khiển bằng photoperiodic phụ thuộc vào gen của họ phytochrom (PhY) liên quan đến photoperiodism/hệ thống đồng hồ sinh học. Hơn nữa, trong mô hình thực vật này, thụ thể protein PhY dường như có liên quan đến biểu hiện lá FT thông qua hoạt động gibberellin (Hình 2). Trong các cây được xử lý lạnh của Phalaenopsis hybrida, sự trùng hợp đã được quan sát giữa lượng gibberellin nội sinh tăng cường và khởi đầu của sự ra hoa. Theo Turnbull (2011), nhận thức/cảm biến lạnh (cold perception) có thể xảy ra ở vùng lân cận hoặc bên ngoài mô phân sinh đỉnh chồi, tức là trong lá. Trong xoài, một loại cây nhiệt đới điển hình, sự ra hoa dường như được xác định bởi một chất kích thích florigenic điều hòa nhiệt độ (FT), được tổng hợp trong lá và chuyển sang chồi, thông qua phloem (Ramirez et al., 2010). Các phương pháp điều trị lạnh cũng giúp tăng cường mức độ cytokinin nội sinh trong toàn bộ cây Phalaenopsis (Chou et al., 2000) và Dendrobium (Campos & Kerbauy, 2004).

Sự tham gia của ánh sáng trong kiểm soát thời gian ra hoa dường như cũng xảy ra thông qua đường, đặc biệt là sucrose sẵn có (quang hợp) (King et al., 2008). Một mối quan hệ giữa biểu hiện gen FT và sucrose synthase gần đây đã được đề xuất cho A. thaliana (Seo et al., 2011).

Từ đề xuất trên, bất kể các vị trí của biểu hiện FT – lá hoặc đỉnh chồi – sản phẩm của biểu hiện này tương tác trực tiếp với phần tử FD (FLOWERING LOCUS D), phức hợp sau đó  biểu hiện LEAFY (LFY) và APETALA1 (AP1) cần thiết và đủ để chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản (Hình 2). Con số này cũng cho thấy sự tham gia giả định của gibberellin trong biểu hiện của LFY. Nghiên cứu với Oncidium có ý nghĩa trong việc xác định một số gen liên quan đến quy định thời gian ra hoa (Hsu et al., 2003). Gen OMADS1 và gen giống AGL6 được phân lập từ loài phong lan này có khả năng điều chỉnh tăng sự biểu hiện của cả gen FT(thời gian ra hoa) và gen nhận dạng mô phân sinh hoa LFY và AP1, trong cây chuyển gen A. thaliana (Hsu et al., 2003) . Sự hiện diện của OnFT mRNA đã được phát hiện trong các cơ quan khác nhau (chồi nách, lá, pseudobulbs và hoa) của cây Oncidium Gower Ramsey gây quang cảm ứng (Hou & Yang, 2009). Cây Oncidium Gower Ramsey biến đổi biểu hiện gen OMADS1 (liên quan đến gen ABCDE MADS box), ra hoa sớm hơn đáng kể so với các cây không chuyển gen (Hsu & Yang, 2002; Thiruvengadam et al., 2012). Các chất kích thích đặc hiệu mô như vậy là chìa khóa để chuyển đổi gen của hoa lan (Teixeira da Silva và cộng sự, 2011). Xu et al (2006) đã phân lập các ứng cử viên cho các gen chức năng A, B, C, D và E từ Dendrobium crumenatum, bao gồm các gen giống AP2-, PI / GLO-, AP3 / DEF-, AG- và SEP. Các biểu hiện của các gen này thể hiện các kiểu khác nhau từ các tương đồng trình tự (orthologs) của Arabidopsis trong việc tạo hình hoa. Các nghiên cứu chức năng cho thấy DcOPI và DcOAG1 có thể thay thế chức năng của PI và AG trong Arabidopsis, tương ứng, DcOAP3A được tìm thấy là một gen chức năng B giả định khác. Hơn nữa, phân tích hai loại nấm men đã chứng minh rằng DcOAP3A / B và DcOPI có thể tạo thành các chất dị vòng, có thể tương tác với DcOSEP để tạo thành phức hợp protein cao hơn.

Khi mô phân sinh đỉnh chồi đã đạt được yêu cầu ra hoa, biểu hiện bắt đầu trong các gen liên quan đến nhận dạng cơ quan hoa (mô hình ABC). Pan et al (2011) đã mô tả các gen gia đình (family) thuộc nhóm B thuộc nhóm orthologous APETALA (AP) và PISTILATA (PI) trong 11 loài phong lan, trong đó, 24 được xác định là gen giống AP3 và 11 là gen giống PI. Trong cả hai nhóm, sự khác biệt là rộng lớn và mối quan hệ phức tạp, trong số các loài phong lan được nghiên cứu, do đó đưa ra bằng chứng về sự bất khả thi của việc phát triển hoa thông thường và hoàn hảo trong hoa lan, bằng mô hình hình thái ABC của zygantic (Pan et al., 2011). Các chồi ngủ đông của Phalaenopsis chứa một lượng ABA tự do tương đối cao, trong khi không tìm thấy ABA tự do hoặc ràng buộc nào trong các chồi hoa. Giảm ABA tự do trong chồi có thể liên quan đến kích hoạt chồi và sự phát triển của chồi hoa (Hsiao et al., 2011).

Các kỹ thuật phân tử đã được áp dụng để nghiên cứu cơ chế ra hoa của hoa lan và hơn 70 gen đã được nhân bản từ 7 chi lan, một số gen này có liên quan đến ra hoa. Hồ sơ biểu hiện gen trong quá trình chuyển đổi ra hoa đã được thiết lập trong Dendrobium spp. sử dụng hệ thống ra hoa trong ống nghiệm (Yu & Goh, 2000b). Ví dụ, bốn gen liên quan đến màu sắc trong Oncidium, bao gồm OgCHS, OgCHI, Ogans và OgDFR, đã được xác định và được thể hiện trong quá trình phát triển hoa (Chiou & Yeh, 2008). Trong số đó, OgCHI và OgDFR cho thấy biểu hiện đặc biệt thấp ở mô màu đỏ cam (yellow lip) nhưng biểu hiện lớn hơn ở phần màu đỏ của hoa Oncidium (Hsiao et al., 2011). Một loại UDPglucose anthocyanidin flavonoid glucosyltransferase (UFGT), được phân lập từ nụ hoa P. Equestris, cho thấy biểu hiện cao ở các giống màu đỏ (Chen et al., 2011). Hạ biểu hiện của PeUFGT3 bằng sự can thiệp RNA dẫn đến các mức độ phai màu khác nhau trong Phalaenopsis. Do đó, PeUFGT3 có thể được liên kết với sự hình thành màu đỏ trong Phalaenopsis. Chiou et al (2008) đã xác định OgCHRC và promoter của nó (Pchrc) trong Oncidium đặc biệt thể hiện trên hoa. Thiruvengadam et al. (2012) đã báo cáo rằng sự biểu hiện quá mức của gen Oncidium MADS (OMADS1) thúc đẩy sự ra hoa sớm ở cây Oncidium Gower Ramsey biến đổi gen. Gần đây, một số tiến bộ đáng kể đã được thực hiện theo sự hiểu biết của chúng tôi về bản sao của Cymbidium sinense, cho phép các cơ chế chịu trách nhiệm cho sự phát triển của hoa, và do đó việ ra hoa in vitro trong loài lan này được hiểu rõ hơn (Zhang et al., 2013).

Trong nghiên cứu đó, có tổng số 41 687 trình tự duy nhất đã được chú thích, 23 092 trong số đó được chỉ định cho các quá trình trao đổi chất cụ thể trong khi 120 cơ sở dữ liệu gen liên quan tới hoa (lowering-associated unigenes), 73 MADS-box unigenes và 28 CONSTANS-LIKE (COL) unigenes đã được xác định. Các chất kích thích đặc hiệu mô như vậy là chìa khóa để chuyển đổi gen đúng mô xác định (Teixeira da Silva et al., 2011). Guo et al. (2006) đã nhân bản gen pPI9 từ Phalaenopsis nhưng nó chỉ biểu hiện ở các cơ quan sinh sản, cho thấy rằng nó có thể liên quan đến việc điều chỉnh hình thái hoa. Một đánh giá chi tiết hơn về cơ sở phân tử làm nền tàng cho màu sắc hoa và sự phát triển của hoa lan đã được Hsiao et al (2011) giới thiệu gần đây, và do đó chi tiết sẽ không được đề cập ở đây.

Triển vọng tương lai


Các nghiên cứu sinh lý và phân tử đã góp phần vào những tiến bộ lớn trong sự hiểu biết của chúng ta về quá trình ra hoa. Bên cạnh những kỹ thuật này, nuôi cấy in vitro chắc chắn đã đóng góp cho tiến trình nghiên cứu này. Cho đến nay, xem xét cơ sở tương đối rằng một số cây lan non ra hoa trong điều kiện in vitro, chúng có thể được coi là mô hình tự nhiên và đáng chú ý để nghiên cứu quá trình chưa biết về chuyển đổi mô phân sinh, đặc biệt là trong các cây có thời gian sinh trưởng dài. Các điều kiện gây ra sự hình thành nụ hoa in vivo có thể khác với các tín hiệu khởi sự trong nuôi cấy in vitro, được đặc trưng bởi một số tác giả như một môi trường nhân tạo. Không phụ thuộc vào điều này, trong cả hệ thống in vivo và in vitro, sự ra hoa đạt được khi cây còn nguyên vẹn hoặc chồi bị cô lập đạt đến độ trưởng thành nhất định và có thể chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản (Teixeira da Silva & Nhut, 2003b). Thật hợp lý khi nghĩ rằng thành phần môi trường, PGR hoặc thậm chí cả việc thay đổi điều kiện khí quyển cụ thể trong lọ có thể đẩy nhanh tốc độ tăng trưởng, rút ​​ngắn thời gian sinh dưỡng và dẫn đến ra hoa sớm. Mặc dù thực tế đã có nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên hoa lan in vitro, việc làm sáng tỏ thêm mối quan hệ giữa biểu hiện gen và thiết lập mối liên hệ có thể có giữa chúng và các hoạt động của PGR, carbohydrate, chất dinh dưỡng khoáng và tín hiệu môi trường vẫn là cần thiết để làm sáng tỏ các cơ chế phức tạp của quá trình chuyển đổi hoa và để hỗ trợ các chương trình nhân giống hoa lan. Điều này có nghĩa là vẫn còn nhiều con đường nghiên cứu để khám phá.

Trong nhiều hoa lan thương mại, thời kỳ juvenile dao động từ hai đến bốn năm. Các nhà nhân giống hoa lan thường mất vài năm để trồng hàng ngàn cây con từ mỗi hạt giống đến khi trưởng thành trước khi có thể đánh giá chất lượng hoa. Do đó, sự phát triển của một phương pháp ra hoa sớm, in vitro sẽ có tác động đáng kể đến ngành công nghiệp hoa lan. Một hệ thống như vậy sẽ cho phép đánh giá sớm hơn các đặc điểm mong muốn nhất định của hoa như kích thước, hình dạng, tông màu và sự thay đổi màu sắc. Một khi các đặc tính mong muốn được chọn, bản sao có thể được nhân giống hàng loạt thông qua nuôi cấy mô. Ngoài ra, những cây phong lan thu nhỏ như hoa có giá trị thương mại tiềm năng là quà tặng hoặc trang trí, ‘bó hoa in vitro’ (Sudhakaran et al., 2006). Hơn nữa, việc rút ngắn đáng kể giai đoạn juvenile có thể cung cấp một hệ thống mô hình để nghiên cứu sự khởi đầu và phát triển hoa (Sim et al., 2007).

Tee và cộng sự (2008) chỉ báo cáo rằng 4% cảm ứng hoa trên thân Dendrobium Sonia 17 có thể ra hoa và kích thước của hoa in vitro tạo ra nhỏ hơn nhiều so với kích thước hoa ban đầu. Các loại cấu trúc hoa không hoàn chỉnh khác nhau đã được quan sát, ví dụ, những bông hoa bất thường có ít cánh hoa hoặc đài hoa hơn, hoa không có cấu trúc môi (lip), hoa có màu sắc và kích cỡ khác nhau, và hoa hồi phục và không được phục hồi. Những bất thường tương tự đã được quan sát trước đây bởi những người khác đối với Doriella (Duan & Yazawa, 1994a) và hoa hồng (Zeng et al., 2013). Nhiều bất thường khác nhau của nụ hoa in vitro hình thành cho thấy các điều kiện khác nhau có thể được yêu cầu cho sự khởi đầu và phát triển của hoa. Tuy nhiên, trong công nghệ sinh học trang trí, ngoại trừ trường hợp cần sản xuất vô tính, sự khác biệt trong các yếu tố đó thực sự có thể là một yếu tố có lợi bằng cách tạo ra các kiểu hình mới với giá trị trang trí mới và độc đáo.

Tóm lại, một hệ thống ra hoa in vitro của hoa lan được coi là một công cụ thuận tiện để nghiên cứu cơ chế ra hoa của hoa lan. Thiết lập một giao thức in vitro đáng tin cậy để tạo ra hoa sớm trong hoa lan là rất quan trọng để thúc đẩy các nghiên cứu về cơ chế phân tử và di truyền của cảm ứng hoa nhanh hơn và hỗ trợ các chương trình nhân giống hoa lan, cũng có lợi cho ngành công nghiệp hoa lan.

Nguồn tham khảo:

Arditti J. (1967). Factors affecting the germination of orchid seeds. Bot Rev, 33, 1–97.
Arditti J. (1992). Fundamentals of Orchid Biology. New York John Wiley and Sons.
Bernier G. (1988). The control of floral evocation and morphogenesis. Ann Rev Plant Physiol Mol Biol, 39, 175–219.
Bernier G, Havelange A, Houssa C, et al. (1993). Physiological signs that induce flowering. Plant Cell, 5, 1147–55.
Bhadra SK, Hossain MM. (2003). In vitro flowering in Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr. J Orchid Soc India, 17, 63–6. Blanchard MG, Runkle ES. (2008). Benzyladenine promotes flowering in Doritaenopsis and Phalaenopsis orchids. J Plant Growth Regul, 27, 141–50.
Campos KO, Kerbauy GB. (2004). Thermoperiodic effect on flowering
and endogenous hormonal status in Dendrobium (Orchidaceae). J Plant Physiol, 161, 1385–7.
Cecich RA. (1985). White spruce (Picea glauca) flowering in response
to spray application of gibberellin A. Can J For Res, 15, 170–4.
Cen XF, Huang CH, Wei PX. (2010). Effects of hormone factors on the
in vitro culture flowering induction of Dendrobium officinale Kimura
et Migo. Agric Sci Tech, 11, 75–9.
Chang C, Chang WC. (2003). Cytokinins promotion of flowering in Cymbidium ensifolium var. misericos in vitro. Plant Growth Regul, 39, 217–21.
Chang YY, Kao NH, Li JY, et al. (2010). Characterization of the possible
roles for B functional MADS box genes in regulation of perianth
formation in orchid (Oncidium Gower Ramsey). Plant Physiol, 152,
837–53.
Chen JT. (2012). Induction of petal-bearing embryos from root-derived callus of Oncidium ‘Gower Ramsey’. Acta Physiol Plant, 34, 1337–43.
Chen WH, Hsu CY, Cheng HY, et al. (2011). Down regulation of putative UDP-glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase gene alters flower coloring in Phalaenopsis. Plant Cell Rep, 30, 1007–17.
Chen WS, Liu HY, Liu ZH, et al. (1994). Gibberellin and temperature influence carbohydrate content and flowering in Phalaenopsis. Physiol Plant, 90, 391–5. Chen WS, Chang HY, Chen WH, Lin YS. (1997). Gibberellic acid and cytokinin affect Phalaenopsis flower morphology at high temperature. HortScience, 32, 1069–73. Chia TF, Arditti J, Segeren MI, Hew CS. (1999). Review: in vitro flowering in orchids. Lindleyana, 14, 60–76. Chiou CY, Wu K, Yeh KW. (2008). Characterization and promoter activity of chromoplast specific carotenoid associated gene (CHRC) from Oncidium Gower Ramsey. Biotechnol Lett, 30, 1861–6. Chiou CY, Yeh KW. (2008). Differential expression of MYB gene (OgMYB1) determines color patterning in floral tissue of Oncidium Gower Ramsey. Plant Mol Biol, 66, 379–88. Chiu YT, Lin CS, Chang C. (2011). In vitro fruiting and seed production in Erycina pusilla. Prop Ornamental Plants, 11, 131–6. Chou CC, Chen WS, Huang KL, et al. (2000). Changes in cytokinin levels of Phalaenopsis leaves at high temperature. Plant Physiol Biochem, 38, 309–14. Corbesier L, Coupland G. (2006). The quest for florigen: a review of recent progress. J Exp Bot, 57, 3395–403. Deb CR, Sungkumlong. (2009). Rapid multiplication and induction of early in vitro flowering in Dendrobium primulinum Lindl. J Plant Biochem Biotech, 18, 241–4. Dewir YH, Chakrabarty D, Ali MB, et al. (2007). Influence of GA3, sucrose and solid medium/bioreactor culture on in vitro flowering of Spathiphyllum and association of glutathione metabolism. Plant Cell Tiss Organ Cult, 90, 225–35. Duan JX, Yazawa S. (1994a). Induction of floral development xDoriella Tiny (Doritis pulcherrima x Kingiella philippinensis). Sci Hortic, 59, 253–64. Duan JX, Yazawa S. (1994b). In vitro flowering of Doriella, Phalaenopsis and Dendrobium. Proceedings of NIOC; Nagoya, Japan, 87–96. Duan JX, Yazawa S. (1995a). Floral induction and development in Phalaenopsis in vitro. Plant Cell Tiss Organ Cult, 43, 71–4. Duan JX, Yazawa S. (1995b). Induction of precocious flowering and seed formation of x Doriella Tiny (Doritis pulcherrima x Kingiella philippinensis) in vitro and in vivo. Acta Hortic, 397, 103–10. Ferreira WM. (2003). Comportamento organogene´tico de meristemas caulinares de Dendrobium ‘‘Second Love’’ (Orchidaceae) in vitro [PhD Thesis]. Brazil: Universidade de Sa˜o Paulo. 142 p. Ferreira WM, Kerbauy GB. (2002). The effects of different concentrations of thidiazuron and sucrose on shoot proliferation and flowering of Dendrobium nobile Second Love (Orchidaceae) in vitro. In Vitro Cell Dev Biol –Plant, 38, 117 (Abstract). Ferreira WM, Kerbauy GB, Kraus JE, et al. (2006). Thidiazuron influences the endogenous levels of cytokinins and IAA during flowering of isolated shoots of Dendrobium. J Plant Physiol, 163, 1126–34. Ge L, Yong JWH, Tan SN, Ong ES. (2006). Determination of cytokinins in coconut (Cocos nucifera L.) water using capillary zone electrophoresis-tandem mass spectrometry. Electrophoresis, 27, 2171–81. Goh CJ, Arditti J. (1985). Handbook of Flowering. Boca Raton, Florida: CRC Press. Goh CJ, Strauss MS, Arditti J. (1982). Flower induction and physiology of orchids p. 214–241. Orchid Biology. Review and Perspectives. Vol. 2. Ithaca NY: Cornell University Press. Goh CJ, Yang AL. (1978). Effects of growth-regulators and decapitation on flowering of Dendrobium orchid hybrids. Plant Sci Lett, 12, 287–92. Guo B, Chen DH, Dai W, et al. (2006). Cloning and expression analysis of a Phalaenopsis flowering-related gene pPI9. J Fudan Uni (Nat Sci), 45, 277–82. Guan P, Shi JM. (2009). Tissue culture of stem segment and induction of floral buds of Dendrobium denndanum. Lishizhen Med Materia Med Res, 20, 205–6. Hee KH, Loh CS, Yeoh HH. (2007). Early in vitro flowering and seed production in culture in Dendrobium Chao Praya Smile (Orchidaceae). Plant Cell Rep, 26, 2055–62. Hew CS, Clifford PE. (1993). Plant-growth regulators and the orchid cut-flower industry. Plant Growth Regul, 13, 231–9. Hew CS, Yong JWH. (1997). The Physiology of Tropical Orchids in Relation to the Industry. Singapore: World Scientific.

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Call Now Button