Ra hoa và thụ phấn in vitro: Phương pháp hữu ích cho ngành công nghiệp nhân giống Hoa Lan

Tóm lược:  Chúng tôi phát triển thành công phương pháp khiến cây ra hoa in vitro sớm trên loài lan Dendrobium nhiệt đới lai (Hee et al. 2007; Sim et al. 2007, 2008). Sử dụng một trong các loài lai, Dendrobium Chao Praya Smile, như là một hệ thống hiện đại, phương pháp ra hoa và thụ phấn in vitro được mô tả. Hoa có thể hình thành trong nuôi cấy khoảng 5-6 tháng sau khi gieo hạt trên các nghiệm thức thích hợp với benzyladenine (BA).

Trong thời gian ngắn hơn so với yêu cầu 2-3 năm theo cách thông thường với phương pháp trong nhà kính. Kết quả cho thấy có thể đánh giá sớm đặc tính hoa. Sau khi ra hoa in vitro, thụ phấn được tiến hành in vitro và hình thành hạt. Vì thế chu kỳ sinh sản của lan được rút ngắn. Cần thảo luận về phương pháp hữu ích này và làm thế nào để mang lại lợi ích cho ngành công nghiệp hoa lan.

Giới thiệu:

Chu kỳ nhân giống của hoa lan thông thường là một quá trình dài. Chu kỳ thông thường bao gồm các giai đoạn chính sau: 1) thụ phấn và sự trưởng thành của hạt giống, 2) nảy mầm hạt in vitro, sự phát triển protocorms và tăng trưởng của cây con, 3) thiết lập cây con ex vitro và trồng cây con trưởng thành, và 4) đánh giá đặc tính và chất lượng hoa (Hee và cộng sự, 2007). Do giai đoạn cây lan con dài, toàn bộ chu kỳ sinh sản có thể từ 3 đến 5 năm tùy thuộc vào kiểu gen (Kamemoto và cộng sự, 1999. Hee và cộng sự, 2007). Những người gây giống lan thường phải trồng hàng ngàn cây con từ hạt giống đến lúc trưởng thành trước khi có thể đánh giá chất lượng hoa (Sim và cộng sự 2007). Sự nỗ lực, thời gian, sức lao động và đầu tư vốn vào việc gây giống lan là rất lớn và trong hầu hết các trường hợp, chỉ có một vài cây ưu tú với các đặc tính mong muốn được lựa chọn trong số hàng ngàn cây giống nảy mầm từ hạt.

Trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đã phát triển một phương pháp để gây ra hoa in vitro của một số Dendrobium lai (Sim et al 2007, 2008, Hee et al.2007). Phương pháp này làm rút ngắn giai đoạn trưởng thành của hoa phong lan trong điều kiện tối ưu, chúng ta có thể gây ra hoa và đánh giá chất lượng hoa khoảng 5-6 tháng sau khi nảy mầm hạt. Kết quả là, thời gian cần thiết cho chu kỳ nhân giống có thể rút ngắn và có thể tiết kiệm chi phí. Ngoài ra, chúng tôi đã chứng minh sự thành công của quá trình thụ phấn in vitro, sự hình thành cây giống, sự trưởng thành và sinh sản ra các thế hệ cây con in vitro trong tương lai. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày thêm về kinh nghiệm của chúng tôi trong việc ra hoa in vitro của Dendrobium Chao Praya Smile, như là một hệ thống hiện đại và thảo luận về hữu ích của việc ra hoa và thụ phấn in vitro cho ngành công nghiệp hoa lan.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu


Vật liệu thực vật, môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy

Hạt giống từ hạt trưởng thành của Dendrobium Chao Praya Smile (Dendrobium Pinky × Dendrobium Kiyomi Beauty) được nảy mầm vô trùng trong các đĩa Petri 90 mm với 25 ml môi trường Knudson C cải tiến (Knudson 1946) bổ sung 2% (w/v) sucrose, 15% (v/v) nước dừa và 0.3% (w/v) gelrite. Môi trường và môi trường được sử dụng tiếp theo được chỉnh đến pH 5.8, trước khi hấp ở 121°C trong 20 phút.

Kích thích sự ra hoa in vitro



Các phương pháp của Hee et al. (2007) và Sim et al. (2007, 2008) được nối tiếp. Tóm tắt, các protocorm 8 tuần tuổi được chuyển sang 50 ml môi trường nuôi cấy KH lỏng (Hee et al. 2007) chứa 2% (w/v) sucrose, 15% (v/v) nước dừa và có/không có 11,1 μM BA trong chai Erlenmeyer 100 ml. Các chai được đặt trên máy lắc quay ở 120 rpm cho sự phát triển. Sau 3 lần nuôi cấy trong môi trường lỏng KH trong khoảng 3 tuần, cây con được chuyển sang môi trường KH 2 lớp (Sim et al. 2007) trong bình Magenta GA7TM. Phương pháp nuôi cấy hai lớp bao gồm 50 ml môi trường rắn Gelrite phủ lớp chất lỏng cùng thể tích và thành phần (Sim và cộng sự, 2007). Tất cả các mẫu nuôi cấy được nuôi ở 25 ± 2°C và thời gian chiếu sáng là 16 giờ quang phổ là 40 μmol m-2s-1 từ đèn huỳnh quang.
Ra hoa và thụ phấn in vitro
Thụ phấn in vitro

Để thực hiện việc thụ phấn, hoa được tạo ra trong nuôi cấy được tự thụ phấn trong tủ cấy sử dụng một cặp kẹp. Khi thụ phấn, cây con được quan sát sự hình thành hạt. Các hạt giống này được thu hoạch khi trưởng thành và khui ra. Các phôi từ những hạt in vitro được nảy mầm trên môi trường KC cải tiến (Knudson 1946).

Kết quả và thảo luận


Kích thích sự ra hoa trong ống nghiệm



Như đã báo cáo trước đây (Hee và cộng sự, 2007), sau khi nuôi vài ngày, phôi gia tăng và chuyển thành màu xanh lá cây (Hình 1a) và sau đó phát triển thành các protocorm (Hình 1b). Protocorm tám tuần tuổi được nhân trong môi trường lỏng. Trong môi trường này, các protocorm phát triển thành cây có lá nhỏ (Hình 1c). Cây giống bình thường đã được chọn và sau đó chuyển sang môi trường 2 lớp chứa 11,1 μM BA (Hình 1d). Khoảng 4-8 tuần sau khi chuyển, có thể quan sát thấy phát hoa hoặc hoa từ đỉnh cây (Hình 2a). Khoảng 70% số protocorms được chọn ra hoa trong ống nghiệm thành công (Hình 2b). Do đó, khoảng thời gian ước tính từ hạt đến khi ra hoa là khoảng 6 tháng.

Trong phương pháp này, BA là cần thiết cho sự kích thích có hiệu quả quá trình hoa ra trong ống nghiệm. Không quan sát thấy hoa từ các cây nuôi cấy ở môi trường không có BA. Trong Dendrobium Madame Thong-In, có đến 94% số cây con được nuôi cấy trong môi trường 2 lớp bổ sung 4,4 uM BA quan sát thấy có phát hoa phát triển sau 15 tuần nuôi cấy (Sim et al., 2007). Cytokinin là những tín hiệu quan trọng trong sự ra hoa (Bernier et al.1993, Bonhomme và cộng sự, 2000, Lindsay và cộng sự, 2006) và thường được kết hợp trong môi trường nuôi cấy in vitro (Bernier 1988; Peeters et al.1991). Bổ sung cytokinin iPAdos (isopentenyl adenosine) được thấy có hiệu quả trong việc kích thích sự hình thành cuống hoa sớm và nụ hoa in vitro ở Arabidopsis (He và Loh 2002). Chính xác BA gây ra hoa sớm của hoa lan Dendrobium như thế nào vẫn được làm sáng tỏ. Tuy nhiên, bằng cách sử dụng D. Madame Thong-In làm vật liệu thực nghiệm, chúng tôi thấy rằng do kết quả của tác dụng BA, IP nội sinh và IPA tăng lên đến mức cao bất thường (Sim và cộng sự, 2008). Vì vậy, người ta gợi ý rằng sự gia tăng IP nội sinh và IPA ngoại sinh có liên quan đến sự ra hoa sớm in vitro ở Dendrobium (Sim và cộng sự, 2008). Các thí nghiệm để kiểm tra xem liệu sự gia tăng tương tự của IP và IPA xảy ra trong quá trình ra hoa in vitro Dendrobium Chao Praya Simile đang trong tiến trình.

Môi trường 2 lớp (chất lỏng/gelrit rắn) rõ ràng là rất quan trọng để thành công kích thích sự ra hoa in vitro. Không quan sát thấy hoa từ các cây con của D. Chao Praya Smile (Hee và cộng sự, 2007) và D. Madame Thong-in (Sim và cộng sự, 2007, 2008) nuôi cấy trong môi trường gelrit rắn. Tuy nhiên, trong D. Second Love, các chồi có thể được tạo ra để tạo ra hoa in vitro sau khi nuôi cấy trong môi trường Phytagel rắn với 1,8 μM TDZ (Ferreira và cộng sự, 2006). Lý do chính xác vẫn còn được làm sáng tỏ.

phat triển của hoa lan Denro invitro.

 

hình 4 phát triển của hoa invitro

 

Trồng hoa in vitro

 

Cây hoa in vitro có chiều cao khoảng 2-3 cm không bao gồm hoa trong khi đó một cây bình thường trồng trong nhà kính có chiều cao khoảng 11-13 cm (Hình 3, Bảng 1). Bảng 1 tóm tắt một số đặc điểm giữa cây hoa in vitro và cây trong nhà kính.
Mỗi cây con ra hoa tạo ra một cuống hoa với trung bình 3-4 chồi hoa. Hơn 70% số cây có thể cho hoa kép, trong khi các cây còn lại cho hoa đơn (Hình 4). Các hoa được tạo ra bởi sự ra hoa in vitro của D.Chao Praya Smile (Hình 5) và D. Madame Thong-In nhỏ hơn các hoa từ cây trong nhà kính (Sim và cộng sự, 2007, Hee và cộng sự, 2007). Tuy nhiên, hình dạng là bình thường và có thể được sử dụng để đánh giá sơ bộ. Ngoài ra, thí nghiệm với D. Madame Thong-In cho thấy sự phân chia màu sắc trong hoa in vitro ở một cây lan lai. Có ít nhất 4 loại hoa đặc trưng liên quan đến màu hoa (Sim và cộng sự 2007). Do đó chọn lọc hình dạng và màu sắc hoa có thể đạt được bằng cách sử dụng nuôi cấy in vitro.

 

Thụ phấn in vitro và sản xuất hạt giống



Trái được hình thành khi thụ phấn được tạo ra trong nuôi cấy. Hình. 6a cho thấy sự phát triển của hạt giống trong nuôi cấy. Toàn bộ thời gian hạt giống trưởng thành trong nuôi cấy dao động từ 12 tuần đến 14 tuần. Hình. 6b cho thấy các hạt được hình thành từ những trái giống này. Những hạt giống này có thể sống được, nảy mầm (Hình 6c) và có thể phát triển thành cây con. Sự thành công của quá trình thụ phấn in vitro và sự hình thành hạt của D. Chao Praya Smile (Hee và cộng sự, 2007) và D. Madame Thong-In (Sim và cộng sự, 2007) cho thấy giao tử được tạo ra từ hoa in vitro có chức năng. Do đó, một hệ thống như vậy cũng có thể được sử dụng để xác định sớm khả năng sinh sản lai.

hình 5 hoa invitro
hình 6 hoa invitro

Phần kết luận



Hoa lan được trồng chủ yếu cho hoa đẹp (Sim và cộng sự, 2007). Như vậy trong bất kỳ chương trình chọn giống lan nào, việc đánh giá và lựa chọn chất lượng hoa như hình dáng và màu sắc hoa là rất quan trọng. Trong bài báo này, chúng tôi đã chứng minh được khả năng kích thích sự ra hoa in vitro của Dendrobium với thời gian cần thiết ngắn hơn phương pháp nhân giống thông thường. Không chỉ có thể ra hoa sớm trong nuôi cấy khi so sánh với các phương pháp trồng hoa lan thông thường, trái giống với hạt có thể được tạo ra (Hình 4, Hee và cộng sự, 2007, Sim và cộng sự, 2007). Do đó, toàn bộ chu kỳ nhân giống có thể được rút ngắn. So sánh các giai đoạn trong cả hai phương pháp được giải thích trong sơ đồ dưới đây (Hình 7).

quy trình nhân giống invitro

Sử dụng các phương pháp này, khoảng thời gian ước tính từ nảy mầm hạt đến tạo phôi in vitro đã được rút ngắn từ 35 tháng xuống còn khoảng 10 tháng (Hee và cộng sự, 2007). Phương pháp tạo phôi in vitro sẽ tạo ra 6 thế hệ phôi với thời gian cần thiết cho 2 thế hệ trong chọn tạo hoa lan thông thường (Hee và cộng sự, 2007).

 

Kết luận lại, ưu điểm của việc ra hoa và thụ phấn in vitro trong nhân giống hoa lan có thể được tóm tắt như sau:

 

1) Hình dáng và màu sắc của hoa có thể được đánh giá 5-6 tháng sau khi nảy mầm hạt thay vì 2-3 năm bằng các phương pháp nhân giống thông thường.
2) Sự phân tách màu hoa trong cây con lai trong ống nghiệm có thể tạo điều kiện cho sự chọn lọc.
3) Việc thụ phấn trong ống nghiệm cho phép đánh giá sớm khả năng sinh sản lai.
Điều quan trọng nhất là tiết kiệm được thời gian, công sức, không gian, sức lao động và chi phí cho việc gây giống lan bằng cách áp dụng các phương pháp ra hoa và thụ phấn trong các chương trình gây giống lan. Những phương pháp này chắc chắn sẽ đóng góp và mang lại lợi ích cho ngành công nghiệp hoa lan nói chung.

 

Tài liệu tham khảo



Bernier G (1988) The control of floral evocation and morphogenesis. Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology 39: 175-219
Bernier G, Havelange A, Housa C, Petitjean A,Lejeune P (1993) Physiological signals that induce flowering. Plant Cell 5: 1147-1155
Bonhomme F, Kurz B, Melzer S, Bernier G, Jacqmard A (2000) Cytokinin and gibberellin activate SaMADSA, a gene apparently involved in regulation of the floral transition in Sinapis alba. Plant Journal 24: 103-111
de Melo Ferreira W, Kerbauy GB, Kraus JE, Pescador R, Suzuki RM (2006) Thidiazuron influences the endogenous levels of cytokinins and IAA during the flowering of isolated shoots of Dendrobium. Journal of Plant Physiology 163: 1126-1134
He YW, Loh CS (2002) Induction of early bolting in Arabidopsis thaliana by triacontanol, cerium and lanthanum is correlated with increased endogenous concentration of isopentyl adenosine (iPAdos). Journal of Experimental Botany 53: 505-512
Hee KH, Loh CS, Yeoh HH (2007) In vitro flowering and rapid in vitro embryo production in Dendrobium Chao Praya Smile (Orchidaceae). Plant Cell Reports 26: 2055-2062.
Kamemoto H, Amore TD, Kuehnle AR (1999) Breeding Dendrobium orchids in Hawaii. University of Hawaii Press, Honolulu.
Knudson L (1946) A new nutrient solution for germination of orchid seed. American Orchid Society Bulletin 15: 214-217
Lindsay DL, Sawhney VK, Bonham-Smith PC (2006) Cytokinin-induced changes in CLAVATA1 and WUSCHEL expression temporally coincide with altered floral development in Arabidopsis. Plant Science 170: 1111-1117
Peeters AJM, Gerards W, Barendse GWM, Wullems GJ (1991) In vitro flower bud formation in tobacco: interaction of hormones. Plant Physiology 97: 402-408
Sim GE, Loh CS, Goh CJ (2007) High Frequency early in vitro flowering of Dendrobium Madame Thong-In (Orchidaceae). Plant Cell Reports 26: 383-393
Sim GE, Goh CJ, Loh CS (2008) Induction of in vitro flowering in Dendrobium Madame Thong-In (Orchidaceae) seedlings is associated with increase in endogenous N6-(∆2-isopentenyl)-adenine (iP) and N6-(∆2-isopentenyl)-adenosine (iPA) levels. PlantCell Reports 27: 1281-1289

Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com

Facebook Comments

2 Replies to “Ra hoa và thụ phấn in vitro: Phương pháp hữu ích cho ngành công nghiệp nhân giống Hoa Lan”

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *