Sản xuất Cordycepin bằng cách nuôi trồng Cordyceps militaris (Đông trùng hạ thảo) trên bã bia

Đây là báo cáo đầu tiên về quá trình nuôi trồng hệ sợi nấm C. militaris và quả thể trên môi trường rắn có chứa ngũ cốc đã qua sử dụng (Spent Brewery grain-SBG). Năm chủng khác nhau của C. militaris được nuôi trồng trên các môi trường chứa hạt lúa mạch đen và từ 0 đến 60% SBG.

Từ khoá: Cordyceps militaris, bã bia, cordycepin, nuôi trồng, nấm thuốc

Sự hình thành Stromata (cơ chất hay thể đệm) trên môi trường có chứa SBG đã được nhận thấy ở hai chủng C. militaris. Tất cả các chủng đều không phát triển trên các môi trường chứa lượng SBG cao hơn 50%. Nồng độ cordycepin cao nhất (10.42 mg/g) đã được xác định ở chủng CM2 trên nền nuôi cấy 50% SBG. Một gram sinh khối của chủng CM11 có thể sinh ra 787.11 mg/g cordycepin. SBG là sản phẩm phụ đại diện cho một môi trường sẵn có, giá thành rẻ để sản xuất cordycepin trên môi trường rắn. Những nồng độ cordycepin đạt được cho đến nay là những nồng độ cao nhất được báo cáo thu được trên môi trường rắn, do đó chúng ta có thể trao đổi về sự tăng sản xuất cordycepin.

Giới thiệu

Cordyceps militaris

C. militaris thuộc nhóm Ascomycota, là một ký sinh trùng trên cơ thể ấu trùng của loài côn trùng, hình thành các thể quả phát triển bên ngoài ấu trùng côn trùng hoặc nhộng (Buenz và cộng sự, 2005). C. militaris được sử dụng như một loại thuốc bổ dân gian truyền thống, đặc biệt là ở Đông Á (Ying và cộng sự, 1987, Holliday and Cleaver 2008, Bhandari và cộng sự, 2010.). Loài này cũng phát triển ngoài tự nhiên ở Slovenia (Ogris 2013) và ở một số nước Châu Âu khác, nhưng việc sử dụng chúng như thuốc ở châu Âu thì chưa bao giờ được báo cáo.

Các polysaccharide của C. militaris polysaccharide cho thấy các hoạt tính chống tế bào ung thư cổ tử cung và ung thư gan in vitro (Yang và cộng sự, 2014), các chất chiết xuất từ quả thể có hoạt tính như chất chống oxy hóa, chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng thể dòng tế bào ung thư (Rao và cộng sự, 2010, Reis et al. 2013, Yang và cộng sự, năm 2014), kháng viêm (Won và Park 2005, Rao và cộng sự 2010), chống xơ hóa (Nan và cộng sự, 2001), chống quá trình tạo mạch máu ở tế bào ưng thư (Yoo và cộng sự 2004) và tiết insulin (Choi et al. 2004). Loài nấm này được nuôi trồng để sản xuất cordycepin (3′-deoxyadenosine), một chất tương tự như nucleoside chống ưng thư, ức chế tăng sinh, chống di căn, diệt sâu và kháng khuẩn (Song và cộng sự, 1998).

Trong những năm gần đây, C. militaris được nuôi trồng rộng rãi trong môi trường lỏng cũng như môi trường rắn (Das và cộng sự, 2010), và là loài Cordyceps được nuôi trồng phổ biến nhất (Kobayashi 1941, Sung 1996). Các loại ngũ cốc và hạt giống khác nhau được sử dụng để bổ sung vào các môi trường rắn như hạt kê, lúa mạch đen, gạo, gạo nâu, bột đậu, ngũ cốc, vỏ hạt bông, lúa miến (cao lương), lõi ngô, kê, lúa mì, hạt hoa hướng dương (Chen và Wu 1990 , Zhang và Liu 1997, Li 2002, Holliday và các cộng sự 2004, Li et al 2004, Zhao và cộng sự, 2006, Gao và Wang 2008, Wei và Huang 2009, Chen và cộng sự, 2011, Shrestha và cộng sự, năm 2012, Wen và cộng sự 2014, Yi và cộng sự 2014). Cho đến nay SBG vẫn chưa được báo cáo như là một thành phần môi trường. Wu và các đồng nghiệp (năm 2013) đã báo cáo về sự thành công của việc nuôi trồng C. militaris và sản xuất cordycepin dựa trên sự lên men tổng hợp levan. Ni và các đồng nghiệp (2009) đã chiết xuất cordycepin từ môi trường nuôi trồng C. militaris, kết luận rằng nó là nguồn cordycepin thích hợp với nồng độ thu được từ 0.1 đến 1 mg/g.

Ngũ cốc đã qua sử dụng

Ngũ cốc đã qua sử dụng (SBG) là sản phẩm phụ của ngành công nghiệp sản xuất bia, chúng vẫn còn lớp vỏ quả-hạt bên ngoài cảu malt lúa mạch ban đầu (Hordeum vulgare) sau khi chiết xuất lúa mạch bằng nước nóng ở nhiệt độ 65-70 °C (Mussatto và cộng sự, 2006 ). SBG là sản phẩm phụ sẵn có, số lượng lớn, chi phí thấp và vẫn là nguồn tài nguyên quý giá cho việc khai thác công nghiệp. Hiện tại bã bia được sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Thật vậy, các sản phẩm giá trị gia tăng ngày càng được tìm kiếm cho SBG (Robertson và cộng sự, 2010).

Bên cạnh đó tiềm năng sử dụng SBG như nguồn năng lượng thông qua quá trình nhiệt phân trung gian (Mahmooda và cộng sự, 2013), như là một vật liệu tiềm năng cho việc sản xuất than thông qua quá trình cacbon hóa thuỷ nhiệt ướt (Poerschmanna và cộng sự, 2014) hoặc một ứng cử viên tiềm năng cho việc chiết xuất hợp chất phenol (Barbosa-Pereira et al. 2014), SBG đã được sử dụng thành công như là môi trường để nuôi trồng Pleurotus ostreatus (Gregori và cộng sự, 2008), cho việc cố định kefir và Lactobacillus casei để làm bánh mì men tươi (bánh mì bột chua) (Plessas và cộng sự, 2007), nuôi trồng Lactobacillus plantarum (Gupta Et al. 2013), sản xuất sinh khối và xylitol của Debaryomyces hansenii (Carvalheiro và cộng sự, 2005). Cho đến nay chưa có báo cáo nào về việc sử dụng SBG để nuôi trồng C. militaris để sản xuất Cordycepin.

Vật liệu và phương pháp

  • Chuẩn bị chủng giống nuôi trồngCác chủng giống C. militaris CM11, CM14 và CM15 được thu thập từ Sở nghiên cứu nấm thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Thượng Hải, chủng giống CM2 đã được trao tặng bởi giáo sư Wu Wei từ Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Thượng Hải và chủng giống CM5 đã được thu thập được từ Mycomedica d.o.o., Podkoren, Slovenia. Tất cả chủng giống được chuyển vào môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) và ủ ở 24 °C trong bóng tối hoàn toàn. Sau khi hệ sợi nấm mọc phủ kín môi trường agar, nó đã được đồng nhất trong một máy xay với 100 ml nước vô trùng (Sigma Aldrich, USA). Chủng giống lỏng được sử dụng để cấy truyền vào môi trường nuôi trồng.Chuẩn bị môi trường và nuôi cấyLúa mạch đen (Rebernak, Šmartno na Pohorju, Slovenia) và SBG được trộn với nhau theo những tỷ lệ khác nhau (9:1,8:2,7:3, 6:4, 5:5,4:6) và đổ vào lọ thủy tinh 720 mL. Nước được thêm vào hỗn hợp để đạt được độ ẩm 65% và đạt khối lượng 100 g môi trường. Môi trường được chuẩn bị trong ba bộ mẫu. Các lọ thủy tinh được đậy nắp kim loại có lỗ 14 mm ở giữa, được phủ lớp lọc HEPA gồm 14 màng lọc được khử trùng trong 30 phút ở 121 °C và làm nguội dưới dòng không khí vô trùng. Trong quá trình cấy truyền, chủng giống lỏng đã được trộn đều trên một máy khuấy từ sau đó chuyển 5 mL chủng giống lỏng vào lọ chứa môi trường. Các lọ thủy tinh được đóng kín nắp và ủ ở 24 °C dưới ánh sáng trắng huỳnh quang trắng. Sau khi ủ, môi trường và quả thể đã được làm khô trong 48 giờ ở 60 °C và sau đó được nghiền bằng máy xay cà phê.


Hình 1: Cordyceps militaris (chủng CM2) hình thành stromata trên các môi trường có chứa 20% hạt lúa mì và 80% lúa mạch đen

Phân tích Cordycepin

Thêm 10 ml ethanol 20 % vào 200 mg bột mẫu, và chiết xuất trong 2 giờ ở bể siêu âm. Dịch trong suốt thu được sau khi chiết xuất được ly tâm ở 14000 g trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0.22 μm (Macherey Nagel).
Hệ thống bao gồm: Hệ thống HPLC Waters 2695 được trang bị đầu dò UV. Các điều kiện làm việc là: YMC – cột polyamine (5 μm, 250 mm x 4,6 mm); Dung môi A – acetonitrile; Dung môi B – nước cất 2 lần; Gradient tuyến tính – acetonitrile:nước (v:v) – (90:10) 15 phút → (86.5:13.5) 20 phút → (75:25) 30 phút → (70:30) 35 phút; Tốc độ dòng – 1 ml /phút; Nhiệt độ – 30ºC; Bước sóng đầu dò – 259 nm; Thể tích tiêm – 10 μl.

Hình 2. Chủng Cordyceps militaris (CM11) vô trùng không thể tạo thành stromata trên bề mặt chứa 20% hạt lúa mì và 80% lúa mạch đen

Định lượng Cordycepin được sinh ra từ sinh khối nấm

Để xác định nồng độ ergosterol trong mẫu đối chứng 0.2 g C. militaris khô được nuôi cấy trên môi trường PDA, được chiết xuất trong 5 ml ethanol tuyệt đối lạnh theo một quy trình đã được sửa đổi bởi Martin và các đồng nghiệp (1990). Đối với các mẫu thử nghiệm xác định sinh khối, một gram chất nghiền được chiết xuất trong ethanol tuyệt đối (10 ml) trong 30 phút ở 4ºC, ly tâm ở 10000 g trong 10 phút và lọc qua bộ lọc màng 0.22 μm (Macherey Nagel).

Quá trình phân tích được thực hiện trên hệ thống sắc ký HPLC được trang bị đầu dò PDA 996, module tách 2690 và Nucleosil C18, thông số cột 250 x 4.6 mm, 5 μm. Ergosterol đã được rửa giải đẳng dòng với 50% methanol và 50% acetonitrile, tốc độ dòng 1,5 mL/phút và xác định với thời gian lưu chuẩn và ba đỉnh hấp thu đặc hiệu của ergosterol tại các bước sóng ở giữa 260 nm và 300 nm. Đối với định lượng, sử dụng ergosterol chuẩn tinh khiết để dựng đường chuẩn (Nylund và cộng sự 1992) (Sigma, Đức). Lượng rgosterol được tính bằng cách sử dụng đường chuẩn cho sợi nấm và ergosterol.

Hai tham số được tính toán để xác định hiệu quả của quá trình nuôi cấy – hàm lượng cordycepin trong môi trường (CCS) và sản xuất Cordycepin từ sinh khối nấm (FBCP). CCS được tính trên mỗi đơn vị khối lượng môi trường và cho biết nồng độ cuối cùng của cordycepin trong môi trường (w/w). FBCP cho thấy khả năng sản xuất Cordycepin của một lượng sinh khối nấm/số lượng nấm (w/w).

Phân tích thống kê

Dữ liệu được đánh giá bằng ANOVA (chương trình 2.16) và ý nghĩa được chấp nhận ở p < 0.05.

Các kết quả

Nấm C. Militaris mọc kín trên tất cả các hỗn hợp môi trường thử nghiệm nhưng không thể phát triển trên các môi trường chứa lượng SBG từ 60% trở lên. Khi chuyển sang môi trường có chứa SBG, tất cả các chủng ngoại trừ CM11 và CM14 đều tạo thành các hệ sợi nấm có đặc tính hình thành mầm rễ rất mạnh. Sự hình thành Stromata được nhận thấy ở chủng CM2 (0, 10, 20, 30, 40 và 50% SBG) và CM5 (10, 20, 30 và 50% SBG) (Hình 1).

Ở tất cả các chủng, ngoại trừ CM11, sự gia tăng CCS được ghi nhận với sự gia tăng các thành phần của SBG trong quá trình nuôi cấy trên môi trường. Chỉ ở chủng CM5, CCS giảm xuống từ 8.90 đến 6.64 mg/g ở môi trường SBG 50%. CCS tối đa (10.42 mg/g) thu được với chủng CM2 được nuôi trồng trên môi trường SBG 50% (Hình 3).

Mức FBCP cao nhất (787.11 mg/g) được quan sát thấy với chủng CM11 nuôi trồng trên 0% SBG giảm đáng kể (đến 305.75 mg/g) khi bổ sung SBG vào môi trường (Hình 4). Khuynh hướng giảm FBCP tương tự khi bổ sung SBG đã được nhận thấy với chủng CM5. FBCP giữ ở mức cao nhất ở tất cả các nồng độ SBG với các chủng khác, FBCP đứng thứ 2 là chủng CM5 tiếp theo là CM2, CM14 và CM15. FBCP thấp nhất đạt được là với chủng CM15 (Hình 2).
So sánh giữa các chủng C. militaris khác nhau cho thấy chúng phản ứng khác với SBG thêm vào môi trường, với chủng CM2 là nhà sản xuất CCS mạnh nhất và nhà sản xuất FBCP mạnh thứ 3. CM11 là nhà sản xuất FBCP mạnh nhất (787.11 mg/g), có nghĩa là 1 g sinh khối CM11 có thể sản sinh ra đến 787.11 mg cordycepin từ nội bào và ngoài bào (hình 4).

Hình 3: Lượng Cordycepin trung bình trong môi trường (CCS) chứa hạt lúa mạch đen và bả bia với Cordyceps militaris.

Hình 4. Sinh khối nấm Cordyceps militaris trung bình cho sản xuất cordycepin (FBCP) trên các môi trường chứa SBG

 

Thảo luận

Theo những kết quả của chúng tôi về việc bổ sung SBG vào môi trường nuôi trồng C. militaris rất có hiệu quả làm tăng CCS và đồng thời giảm FBCP. Sự tăng sản lượng CCS khi môi trường có chứa SBG có thể là do nồng độ của các hợp chất phân tử thấp trong SBG cao hơn (đường đơn và các sản phẩm lên men khác được sản xuất qua quá trình sản xuất bia) so với các hạt lúa mạch đen chưa lên men.

Nhiều thành phần hóa học bổ sung khác nhau được sử dụng trong nuôi trồng thương mại C. militaris, một số nhà nghiên cứu (Xie và cộng sự 2009) báo cáo rằng các thành phần tự nhiên như gạo nâu, mạch nha và đậu nành là nguồn dinh dưỡng tốt hơn cho C. militaris so với các môi trường hóa học. Điều này cho thấy nồng độ cordycepin cao trong môi trường bổ sung SBG có thể đạt được bởi vì SBG là một nguyên vật liệu hỗn hợp chỉ gồm các thành phần tự nhiên.

Những đặc điểm của C. militaris (màu trắng, không có khả năng hình thành stromata) được ghi nhận với chủng CM11 được báo cáo bởi Sreshtha và cộng sự (2012) và liên quan đến vấn đề thoái hóa chủng (Hình 2). Điều này có thể có nghĩa là CM11 là một chủng C. militaris thoái hóa, có khả năng sản xuất FBCP cao chỉ trên môi trường là lúa mạch đen. Đồng thời CM11 là chủng duy nhất mà CCS không bị ảnh hưởng mạnh bởi việc bổ sung SBG vào môi trường.
Holliday và các đồng nghiệp (2004) báo cáo rằng lượng CCS đạt được là 2.25 mg/g trong các sản phẩm thương mại C. sinensis thu được qua quá trình nuôi trồng trên môi trường rắn và 0.65 mg/g cordycepin thu được từ stromata của C. sinensis tự nhiên. Ni và các đồng nghiệp (năm 2009) báo cáo hàm lượng CCS từ 0.1 đến 1 mg/g thu được từ nuôi trồng C. militaris, Wen và các đồng nghiệp (2014) đã tối ưu hóa thành phần môi trường rắn để nuôi trồng C. militaris và đạt được CCS là 9.17 mg/g. Tất cả các nồng độ được báo cáo đều thấp hơn so với kết quả (10.42 mg/g) trong nghiên cứu của chúng tôi, cho thấy SBG là môi trường chất lượng, sẵn có và rẻ tiền cho sản xuất Cordycepin thông qua nuôi trồng C. militaris.

Tại sao tất cả các chủng không phát triển trên các môi trường chứa lượng SBG 60% và cao hơn vẫn còn chưa rõ. Theo báo cáo của Gao và các đồng nghiệp (2000), hiện tượng này có thể liên quan đến hàm lượng Nitơ quá cao đã ức chế sự phát triển của C. militaris.

Kết luận

SBG đại diện cho một môi trường có sẵn, giá thành thấp để sản xuất cordycepin trên môi trường rắn. Những nồng độ cordycepin được báo cáo ở đây cho đến nay là nồng độ cao nhất (10.42 mg/g) thu được khi nuôi trồng trên môi trường rắn.

Việc sử dụng SBG trong sản xuất Cordycepin từ C. militaris được đề cập ở đây như là một kỹ thuật rất hiệu quả để sản xuất phụ gia thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có giá trị cao – chỉ cần sấy khô SBG đã được xử lý trước khi nuôi trồng C. militaris.

Cần có thêm các nghiên cứu để xác định chính xác các thành phần và/hoặc các tính chất vật lý dẫn tới tăng lượng cordycepin khi nuôi trồng trên môi trường có chứa SBG và tối ưu hóa các thông số nuôi trồng như nhiệt độ, thời gian ủ, ánh sáng và quá trình sục khí.
Kỹ thuật sử dụng SBG được mô tả ở đây trong quá trình tối ưu hóa và thương mại hoá tập trung vào việc sản xuất thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hàm lượng cordycepin.

Tài lệu tham khảo

Andrej Gregori
Institute for Natural Sciences (Zavod za naravoslovje), Ulica bratov Učakar 108, SI-1000 Ljubljana, Slovenia
Correspondence: andrej.gregori@zanaravo.com

Barbosa-Pereira, L., Bilbao, A., Vilches, P., Angulo, I., LLuis, J., Fité, B., Paseiro-Losada, P., Cruz, J.M., 2014. Brewery waste as a potential source of phenolic compounds: Optimisation of the extraction process and evaluation of antioxidant and antimicrobial activities. Food Chemistry, 145, 191-197.
Bhandari, A.K., Negi, J.S., Bisht, V.K., Rana, C.S., Bharti, M.K., Singh, N., 2010. Chemical Constituent, Inorganic Elements and Properties of Cordyceps sinensis – a Review (Cordyceps sinensis – a Review). Nature and Science, 8 (9), 253-256.
Buenz, E.J., Bauer, B.A., Osmundson, T.W., Motley, T.J., 2005. The traditional Chinese medicine Cordyceps sinensis and its effects on apoptotic homeostasis. Journal of Ethnopharmacology, 96, 19–29.
Carvalheiro, F., Duarte, L.C., Lopes, S., Parajo, J.C., Pereira, H., Gı́ rio, F.M., 2005. Evaluation of the detoxification of brewery’s spent grain hydrolysate for xylitol production by Debaryomyces hansenii CCMI 941. Process Biochemistry, 40 (3-4), 1215–1223.
Chen, S.Z., Wu, P.J., 1990. A brief introduction to bottle culture technique of Cordyceps militaris. Edible fungi, 4, 31-37. Chen, Y.S., Liu, B.L., Chang, Y.N., 2011. Effects of light and heavy metals on Cordyceps militaris fruit body growth in rice grain-based cultivation. Korean Journal of Chemical Engineering, 28 (3), 875-879.
Choi, S.B., Park, C.H., Choi, M.K., Jun, D.W., Park, S., 2004. Improvement of insulin resistance and insulin secretion by water extracts of Cordyceps militaris, Phellinus linteus, and Paecilomyces tenuipes in 90% pancreatectomized rats. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 68 (11), 2257–2264.
Das, S.K., Masuda, M., Sakurai, A., Sakakibara, M., 2010. Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: Current state and prospects. Fitoterapia 81 (8), 961–968.
Gao, S.Y., Wang, F.Z., 2008. Research of commercialized cultivation technology on Cordyceps militaris. Northern Horticulture, 9, 212-215.
Gao, X.H., Wu, W., Qian, G.C., 2000. Study on influence of abiotic factors on fruitbody differentiation of Cordyceps militaris. Acta Agriculture Shanghai, 16, 93-98.
Gregori, A., Švagelj, M., Pahor, B., Berovič, M., Pohleven, F., 2008. The use of spent brewery grains for Pleurotus ostreatus cultivation and enzyme production. New Biotechnology, 25 (2-3), 157-161.
Gupta, S., Jaiswal, K. A., Abu-Ghannam, N., 2013. Optimization of fermentation conditions for the utilization of brewing waste to develop a nutraceutical rich liquid product. Industrial Crops and Products, 44, 272–282.
Holliday, J.C., Cleaver, M., 2008. Medicinal Value of the Caterpillar Fungi Species of the Genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). A Review. International Journal of Medicinal Mushrooms, 10 (3), 219–234.
Holliday, J.C., Cleaver. P., Loomis-Powers, M., Patel, D., 2004. Analysis of quality and techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis. International Journal of Medicinal Mushrooms, 6, 151-164.
Kobayashi, Y., 1941. The genus Cordyceps and its allies. Science reports of the Tokyo Bunrika Daigaku, 84, 53-260.
Li, C.B., Tong, X.D., Bai, J., Fan, S.D., 2004. Artificial stromata production of Cordyceps militaris. Journal of Dalian National University, 6 (5), 29-31.
Li, X., 2002. Manmade cultivates of Cordyceps militaris (L) Link. Journal of microbiology. 22 (6), 56-57.
Mahmooda, A.S.N., Brammera, J.G., Hornunga, A., Steeleb, A., Poulstonb, S., 2013. The intermediate pyrolysis and catalytic steam reforming of Brewers spent grain. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 103, 328–342.
Martin, F., Delaruelle C., Hilbert, J.L., 1990. An improved ergosterol assay to estimate fungal biomass in ectomycorrhizas. Mycological Research, 94, 1059-1064.
Mussatto, S.I., Dragone, G., Roberto, I.C., 2006. Brewers’ spent grain: generation, characteristics and potential applications. Journal of Cereal Science, 43, 1–14.
Nan, J.X., Park, E.J., Yang, B.K., Song, C.H., Ko, G., Sohn, D.H., 2001. Antibiotic effect of extracellular biopolymer from submerged mycelial cultures of Cordyceps militaris on liver fibrosis induced by bile duct ligation and scission in rats. Archives of Pharmacal Research, 24 (4), 327–332.
Ni, H., Zhou, X.H., Li, H.H., Huang, W.F., 2009. Column chromatographic extraction and preparation of cordycepin from Cordyceps militaris waster medium. Journal of Chromatography B, 877, 2135-2141.
Nylund, J.E., Wallander, H., 1992. Ergosterol analysis as a means of quantifying mycorrhizal biomass. Methods in Microbiology, 24, 77-88.
Ogris, N., 2013. Podatkovna zbirka gliv Slovenije Boletus informaticus. Plessas,S., Trantallidi, M., Bekatorou, A., Kanellaki,M., Nigam, P., Koutinas, A.A., 2007. Immobilization of kefir and Lactobacillus casei on brewery spent grains for use in sourdough wheat bread making. Food Chemistry, 105 (1), 187–194.
Poerschmanna, J., Weinera, B., Wedwitschkab, H., Baskyra, I., Koehlera, R., Kopinkea, F.D., 2014. Characterization of biocoals and dissolved organic matter phases obtained upon hydrothermal carbonization of brewer’s spent grain. Bioresource Technology, 164, 162–169.
Raoa, Y.K., Fangb, S.H., Wuc, W.S., Tzenga, Y.M., 2010. Constituents isolated from Cordyceps militaris suppress enhanced inflammatory mediator’s production and human cancer cell proliferation. Journal of Ethnopharmacology, 131, 363–367.
Reis, F.S., Barros, L., Calhelha, R.C., Ćirić, A., van Griensven, L., Soković, M., Ferreira, I., 2013. The methanolic extract of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body shows antioxidant, antibacterial, antifungal and antihuman tumor cell lines properties. Food and Chemical Toxicology, 62, 91–98.
Robertson, J.A., I’Anson, K.J.A., Treimo, J., Faulds, C.B., Brocklehurstb T.F., Eijsinkc, V.G.H., Waldrona, K.W., 2010. Profiling brewers’ spent grain for composition and microbial ecology at the site of production. LWT – Food Science and Technology, 43 (6), 890–896.
Shrestha, B., Han, S. K., Sung, J. M., Sung, G. H., 2012. Fruiting Body Formation of Cordyceps militaris from Multi-Ascospore Isolates and Their Single Ascospore Progeny Strains. Mycobiology, 40 (2), 100-106.
Song, C.H., Jeon, Y.J., Yang, B.K., Ra, K.S., Sung, J.M., 1998. Anti-complementary activity of exopolymers produced from submerged mycelial cultures of higher fungi with particular reference to Cordyceps militaris. Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, 536–539.
Sung, J.M., 1996. The insect-borne fungus of Korea in color. Kyohak Publishing Co. Ltd., Seul. Wei, Q., Huang, M.Q., 2009. Effects of nutrient ingredient in culture medium on the growth of Cordyceps militaris. Beijing agriculture, 27, 36-38.
Wen, T.C., Li, G.R., Kang, J.C., Kang, C., Hyde, K.D., 2014. Optimization of Solid-state Fermentation for Fruiting Body Growth and Cordycepin Production by Cordyceps militaris. Chiang Mai Journal of Science, 41 (4), 858-872.
Won, S.Y., Park, E.H., 2005. Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris. Journal of Ethnopharmacology, 96, 555–561.
Wu, F.C., Chen, Y.L., Chang, S.M., Shih, I.L., 2013. Cultivation of medicinal caterpillar fungus, Cordyceps militaris (Ascomycetes), and production of cordycepin using the spent medium from levan fermentation. International Journal Of Medicinal Mushrooms, 15 (4), 393-405.
Xie, C.Y., Gu, Z.X., Fan, G.J., 2009. Production of cordycepin and mycelia by submerged fermentation of Cordyceps militaris in mixture natural culture. Applied Biochemistry and Biotechnology, 158, 483-492.
Yang, S., Jin, L., Ren, X., Lu, J., Meng, Q., 2014.Optimization of fermentation process of Cordyceps militaris and antitumor activities of polysaccharides in vitro. Journal of Food and Drug Analysis, In Press. Yi., Z.L., Huang, W.F., Ren, Y., Onac, E., Zhou, G.F., Peng, S., Wang, X.J., Li, H.H., 2014. LED lights increase bioactive substances at low energy costs in culturing fruiting bodies of Cordyceps militaris. Scientia Horticulturae, 175, 139-143.
Ying, J., Mao. X., Mao, Q., Zong, Y., Wen, H., 1987. Icons of Medicinal Mushroom from China, Science Press, Beijing, 151–155.
Yoo, H.S., Shin, J.W., Cho, J.H., Son, C.G., Lee, Y.W., Park, S.Y., Cho, C.K., 2004. Effects of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth. Acta Pharmacologica Sinica, 25 (5), 657-65.
Zhang, X.K., Liu, W.X., 1997. Experimental studies on planting Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link with different culture materials. Edible fungi of China, 16 (2), 21-22.
Zhao, C.Y., Li, H., Zhang, M., 2006. Optimization on conditions of artificial cultivation of Cordyceps militaris. Journal of Shenyang Agricultural University, 37, 209-212.

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *