SẢN XUẤT SAPONIN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO ĐINH LĂNG

TÓM TẮT: Lá in vitro chồi đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) được nuôi cấy phát sinh tạo mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2 mg/l, kinetin 1 mg/l, sucrose 30 g/l cho tỷ lệ tạo sẹo 94,63 %.

Môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l, kinetin 0,5 mg/l, sucrose 30 g/l, coconut water 10 % thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh khối mô sẹo với tốc độ tăng sinh 19,83. Mô sẹo có màu trắng, xốp và tăng sinh nhanh. Bổ sung yeast extract, chitosan, casein hydrolysate vào môi trường tăng sinh cho thấy bổ sung yeast extract 150mg/l cho hàm lượng saponin tích tụ cao 3480,2 µg/g và tốc độ tăng sinh khối 17,58 lần.

MỞ ĐẦU

Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) thuộc họ ngũ gia bì (Araliaceae), thuộc nhóm cây dược liệu được sử dụng phổ biến ở các Quần đảo Thái Bình Dương và vùng Đông Nam Á như Indonesia, Lào, Malaysia, Papua New Guinea, Philippines, Singapore, Thái Lan và Việt Nam (Brickell, 2003) [2].

Cây đinh lăng có công dụng trong các bài thuốc chống dị ứng, chống mệt mỏi, giải độc thức ăn và làm tăng sức dẻo dai của cơ thể. Trong đinh lăng có hai hợp chất chính quan trọng là polyacetylen và saponin [9]. Ngoài ra, còn có glucosides, alcaloid và 13 loại amino acid trong đó lysin, systein, methionin là những amino acid không thể thay thế được [1]. Hợp chất saponin, đặc biệt saponin triterpen có tác dụng ức chế tạo thành malonyl dialdehyd trong quá trình peroxyd hóa chống stress và triệu chứng trầm cảm [6], chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm [1]. Hàm lượng saponin tích lũy thay đổi phụ thuộc vào: điều kiện tự nhiên, thời vụ, điều kiện canh tác, việc nuôi trồng đòi hỏi diện tích lớn và phải mất từ 3-5 năm mới có thể thu hoạch [8].

Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Masruri et al. (2007) [7] đã phát hiện 3 hợp chất từ vỏ rễ đinh lăng 3-O-β-D-Glucopyranosyl (1→2)-β-D-Glukopiranosyl, 3-O-β-Drhamnopyranosyl (1→2)-β-D-rhamnopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranosyl và 3-O-β-D-glucopyranosyl. Huan et al. (1998) [6] đã định tính trong dịch chiết rễ, thân và lá đinh lăng có các glycosid, alkaloid, tanin, vitamin B1, khoảng 20 loại amino acid khác và phân lập được 11 triterpen. Trần Công Luận và nnk (2001) [16] đã định tính 5 hợp chất polyacetylen từ lá đinh lăng, trong đó 2 hợp chất chủ yếu: panaxynol và heptadeca 1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol có tác dụng kháng khuẩn.

Với nhu cầu sử dụng các loài dược liệu làm thuốc ngày càng tăng, do khai thác liên tục trong nhiều năm không chú ý tới bảo vệ tái sinh, cộng với nhiều nguyên nhân khác đã làm cho nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng, nhiều loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng. Các dịch chiết từ lá sim, ngải cứu, đinh lăng và bách bộ không ức chế sự sinh cytokin kháng viêm IL-10, chứng tỏ chúng là những dịch chiết kháng viêm tiềm năng [10]. Dựa vào đặc điểm hình thái, dược chất và phân tích di truyền là cơ sở khoa học cho phép chọn giống Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms có nguồn từ Hưng Yên) vào sản xuất thuốc [11]. Đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng oleanolic acid trong cao khô đinh lăng bằng HPLC [3]. Nghiên cứu phát triển nguồn gen cây đinh lăng lá nhỏ Polyscias fruticosa L. Harms ở miền Đông Nam Bộ [12]. Và bước đầu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms) [5].

Những tính chất sinh học đặc sắc của Polyscias fruticosa được phát hiện qua nuôi cấy nuôi cấy tạo mô sẹo và dịch huyền phù tế bào [15]. Hoạt chất oleanolic acid glycosides trong dịch chiết sinh khối tế bào qua nuôi cấy trong bioreactor ở Viện Sinh lý thực vật (Viện Hàn lâm Khoa học Moscow) đã thương mại hóa dưới thương hiệu “Vitamal” được uống hàng ngày đặc trị tính thích ứng và miễn dịch môi trường [4]. Trong bài báo này, chúng tôi nghiên cứu khả năng tích lũy saponin bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu được sử dụng là lá non cây đinh lăng một năm tuổi được cung cấp từ bộ sưu tập giống Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Khoa học nông nghiệp và Công nghệ sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành. Lá non được cắt thành từng mảnh 1 x 1 cm và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo.

Môi trường khoáng cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu là Murashige-Skoog (MS), Gamborg (B5). Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy gồm: đường sucrose, 2,4-D (2.4-diclorophenoxyacetic acid), kinetin (6-furfurylaminopurine), nước dừa (15%).

Điều kiện nuôi cấy: Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện tối, nhiệt độ buồng nuôi 26+2oC, độ ẩm phòng 70%, môi trường nuôi cấy được khử trùng ở 1atm trong thời gian 20 phút.
Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình tam giác chứa 50 ml môi trường nuôi cấy, mỗi bình được nuôi cấy 5-10 mẫu và 1 g/chai (đối với thí nghiệm nhân sinh khối mô sẹo). Kết quả nghiên cứu được xử lý thống kê bằng SAS 9.1.

Phương pháp xác định hàm lượng saponin bằng HPLC

Chuẩn bị mẫu phân tích oleanolic acid: Cân 150 mg mẫu vào ống COD, chiết siêu âm 4 lần với 10 mL ethylacetatat chứa 1 % acid formic. Thổi khô ethyl acetat. Hòa tan phần cặn bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.

Chuẩn bị mẫu phân tích saponin tổng số: Cân 150 mg mẫu vào bình cầu cổ nhám. Thêm 50 mL nước nóng và ủ tại 90 oC trong 10 phút. Thêm 7,5 mL HCl đậm đặc và đun hoàn lưu cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x 100 mL dicloromethan. Pha dicloromethan cô quay tới gần cạn, phần còn lại được thổi khô hoàn toàn bằng dòng khí N2. Hòa tan phần cặn bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro trước khi tiêm.

Để định lượng saponin tổng số, các nhánh đường gắn trên aglycone được thủy phân trong môi trường acid để chuyển hết về dạng aglycone. Do đó, saponin tổng số được định lượng thông qua oleanolic acid.

Quy trình HPLC phân tách và định lượng oleanolic acid và saponin.
Pha tĩnh: cột ACE3 C18 (4,6 x 150 mm, kích thước hạt 3,5 micro).
Pha động: đệm triethylamine/ HCl pH3 : MeOH tỉ lệ 10:90 v/v.
Tốc độ dòng pha động 0,5 mL/phút.
Bước sóng 210 nm.
Nhiệt độ cột 20oC.

Thiết kế thí nghiệm

Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy đến tạo mô sẹo đinh lăng: Lá non cây đinh lăng được nuôi cấy trên các môi trường MS, 1/2MS, B5 và có bổ sung 2,4-D (0,5, 1, 2 mg/l), sucrose (30 g/l) và agar (8 g/l). Kết quả được ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy.

Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin đến tạo mô sẹo đinh lăng: được thực hiện trên môi trường MS có bổ sung kinetin (0,5, 1, 2 mg/l), 2,4-D (0,5, 1, 2 mg/l), sucrose (30 g/l) và agar (8 g/l). Kết quả được ghi nhận sau 25 ngày nuôi cấy.

Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin đến nhân sinh khối mô sẹo đinh lăng: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung kinetin (0,5, 1 mg/l), 2,4-D (0,5, 1, 2 mg/l), sucrose (30 g/l) và agar (8 g/l). Kết quả được ghi nhận sau 25 ngày nuôi cấy.
Nghiên cứu ảnh hưởng của đường sucrose và nước dừa đến nhân sinh khối mô sẹo đinh lăng: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có 2,4-D (1 mg/l), kinetin (0,5 mg/l), agar (8 g/l) và bổ sung thêm các chất hữu cơ như đường sucrose (10, 20, 30 g/l), nước dừa (5, 10, 15%). Kết quả được ghi nhận sau 25 ngày nuôi cấy.

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ trợ đến quá trình nhân sinh khối và sự tích tựu saponin trong mô sẹo đinh lăng: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có 2,4-D (1 mg/l), kinetin (0,5 mg/l), agar (8 g/l), sucrose (30 g/l), nước dừa (10 %) và bổ sung yeast extract (50, 100, 150, 200 mg/l), chitosan (50, 100, 150, 200 mg/l), casein hydrolysate (50, 100, 150, 200 mg/l). Kết quả được ghi nhận sau 25 ngày nuôi cấy.

Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần cấy truyền đến sự tích tựu saponin trong mô sẹo đinh lăng: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có 2,4-D (1 mg/l), kinetin (0,5 mg/l), agar (8 g/l), sucrose (30 g/l) và nước dừa (10 %). Xác định hàm lượng saponin ở các lần cấy truyền từ 1-5. Kết quả được ghi nhận sau 25 ngày nuôi cấy.

Các chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ tạo mô sẹo (%): Quan sát số mẫu tạo mô sẹo bằng mắt.
Hệ số tăng sinh = khối lượng mẫu sau thí nghiệm (g) / khối lượng mẫu ban đầu (g)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Ảnh hưởng môi trường khoáng cơ bản đến tạo mô sẹo đinh lăng
Lá non được sử dụng làm mẫu nuôi cấy tạo mô sẹo trên môi trường MS, 1/2MS và B5. Kết quả bảng 1 cho thấy sau 45 ngày nuôi cấy cho thấy hầu hết các môi trường đều hình thành mô sẹo. Trên môi trường MS có bổ sung tăng nồng độ 2,4-D từ 0,5 – 2 mg/l cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất với lá 83,68 % và thân 59,30 %. Kết quả này phù hợp với công bố của Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai (2007) [13] khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá đinh lăng. Môi trường thích hợp cho nuôi cấy tạo mô sẹo ở mẫu lá MS có bổ sung 2,4-D 2 mg/l.

Ảnh hưởng kết hợp 2,4D và kinetin đến tạo mô sẹo đinh lăng
Trên môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4D và kinetin cho thấy chỉ bổ sung 2,4-D 2 mg/l đạt tỷ lệ tạo sẹo 81,27 %, với chỉ có bổ sung kinetin đạt tỷ lệ tạo sẹo 25,4 %, bổ sung kết hợp 2,4-D 2 mg/l và kinetin 1 mg/l đạt tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất 94,63 %. Mô sẹo trên môi trường có bổ sung kinetin có dạng chặt và có sự hình thành rễ bất định; mô sẹo trên môi trường có 2,4-D không có sự phát sinh hình thái. Tế bào mô sẹo trên môi trường có 2,4-D và kinetin có màu trắng, xốp và tăng sinh nhanh. Môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D 2 mg/l và kinetin 1mg/l thích hợp cho sự tạo mô sẹo từ mô lá nuôi cấy (bảng 2). Kết quả này phù hợp với công bố của Phạm Thị Tố Liên & Võ Thị Bạch Mai (2007) [13] khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá đinh lăng.

Ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến nhân sinh khối mô sẹo đinh lăng

Mô sẹo hình thành trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2 mg/l và kinetin 1mg/l được sử dụng trong nghiên cứu tăng sinh khối trên môi trường nuôi cấy tăng sinh khối MS có bổ sung 2,4-D và kinetin. Kết quả cho thấy khả năng tăng sinh khối đạt 13,95 lần trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 0,5 mg/l (bảng 3). Hình thái khối mô sẹo tăng sinh có màu trắng và xốp hơn so với mô sẹo mới bắt đầu nuôi cấy. Kết quả này phù hợp với công bố của Slepyan et al. (1975b) [15] khi nuôi cấy tăng sinh khối mô sẹo đinh lăng.

Ảnh hưởng của đường sucrose và nước dừa đến nhân sinh khối mô sẹo đinh lăng
Trên môi trường MS + 2,4-D 1 mg/l + kinetin 0,5 mg/l có bổ sung đường sucrose và nước dừa nhằm nâng cao hiệu suất nuôi cấy tăng sinh khối tế bào mô sẹo. Qua bảng 4, bổ sung đường sucrose 30 g/l và nước dừa 10 % nâng hiệu suất tăng sinh khối rõ rệt 19,83 lần.
Ảnh hưởng của yeast extract, casein hydrolysate và chitosan đến nhân sinh khối và tích tựu saponin trong mô sẹo đinh lăng

Trên môi trường nuôi cấy tăng sinh MS + 2,4-D 1 mg/l + kinetin 0,5 mg/l + sucrose 30 g/l + nước dừa 10 % bổ sung yeast extract, casein hydrolysate và chitosan nhằm nâng cao hiệu suất tăng sinh khối và tích tụ saponin. Kết quả cho thấy hiệu quả rõ với việc bổ sung yeast extract 150 mg/l đạt hệ số tăng sinh 17,58 và hàm lượng saponin là 3480,2 µg/g (bảng 5). Sự bổ sung yeast extract ở nồng độ cao giúp tạo ra các tiền chất nhưng lại gây cản trở sự phân chia tế bào, ở nồng độ 150 mg/l thích hợp nó kích hoạt việc sản xuất, chuyển hóa các chất thứ cấp [14].

Bảng 6. Sự tích lũy saponin ở các lần cấy truyền mô sẹo đinh lăng

Lần cấy truyền Hàm lượng saponin (µg/g)
F1 1712,6d
F2 1640,3e
F3 2024,6b
F4 2052,2a
F5 1963,7c

Ảnh hưởng của số lần cấy truyền đến hàm lượng saponin tích tựu trong mô sẹo đinh lăng
Hàm lượng saponin trong mô sẹo ở các lần cấy chuyền từ thứ nhất đến thứ ba có sự khác biệt nhưng sự khác biệt này sai khác là hoàn toàn ngẫu nhiên. Khả năng tổng hợp hoạt chất của tế bào mô sẹo đinh lăng được duy trì ổn định trong bốn lần cấy chuyền, đến lần cấy chuyền thứ năm thì hàm lượng saponin giảm 1963,7µg/g (bảng 6). Nên cần tiến hành dòng hóa tế bào thường xuyên để chọn được những dòng tế bào có khả năng tổng hợp hoạt chất tốt nhất [15]

KẾT LUẬN

Lá cây đinh lăng tạo mô sẹo tốt nhất trên
môi trường MS + 2,4-D 2 mg/l + kinetin 1 mg/l + sucrose 20 g/l. Quá trình nhân sinh khối mô sẹo cho kết quả tốt nhất trên môi trường MS + 2,4-D 1 mg/l + kinetin 0,5 mg/l + đường sucrose 30 g/l + nước dừa 10 %. Thế hệ cấy chuyền tế bào mô sẹo thu nhận tốt nhất là thế hệ thứ 4 cho hàm lượng saponin tích tựu là 2052,2 µg/g trọng lượng khô. Bổ sung yeast extract 150 mg/l vào môi trường nuôi cấy làm tăng khả năng tích lũy saponin là 3480,2 µg/g trong mô sẹo.

Tác giả

Đỗ Tiến Vinh1, Mai Thị Phương Hoa1, Lê Thị Như Thảo2,
Nguyễn Hoàng Trang Nhã3, Trần Văn Minh3*
1Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
2Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
3Trường Đại học Quốc tế thành phố Hồ Chí Minh, *drminh.ptntd@yahoo.com

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bensita M.B., Nilani P., Madhu C. D., 1998. On the antipyretic, anti-inflammatory, analgesic and molluscicidal properties of Polyscias fruticosa (L.) Harms. Ancient Science of Life, 8: 1-6.
2. Brickell C. H., 2003. American Horticultural Society A-Z encyclopedia of garden plants. Dorling Kindersley, London, pp. 818-819.
3. Chử Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Kiều Anh, Trịnh Thị Nhung, Nguyễn Huy Văn, Lâm Thị Bích Hồng, 2012. Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong cao khô đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Dược học, 457(10): 34-38; 25-30.
4. Furmanowa M., Nosov A. M., Oresnikov A. V., Klushin A. G., Starościak B., Śliwińska A., Guzewska J., Bloch R., 2002. Antimicrobial activity of Polyscias filicifolia cell biomass extracts. Pharmazie 57: 424-426.
5. Hà Bích Hồng, Vũ Thị Thơm, Vũ Đức Lợi, Lê Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Hải, 2013. Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms). Tạp chí Dược học, 450(10): 25-30.
6. Huan V. D., Yamamura S., Ohtani K., Kasai R., Yamasaki K., Nham N. T., Chau H. M., 1998. Oleane saponins from Polyscias fruticosa. Phytochemistry 47: 451-457.
7. Masruri E. D. I., Kristianingsih E. P. U., Rahman M. F., Rurini R., 2007. Indentification of triterpenoid compound from Polyscias fruticosa Harms (Araliaceae) root bark. International Conference on Chemical Sciences.
8. Nguyễn Trần Châu, Đỗ Mai Anh, Nguyễn Phương Dung, 2007. Nghiên cứu một số tác dụng dược lý thực nghiệm của sản phẩm cấy mô từ cây đinh lăng Polyscias fruticosa Harm (Araliacea). Tạp chí Nghiên cứu y học TPHCM 11(2): 126-131.
9. Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Khảo sát thành phần hóa học lá cây đinh Lăng Polyscias serrata Balf. (Araliaceae). Journal of chemistry 45(1): 102-105.
10. Nguyễn Thị Mai Phương, Trịnh Tất Cường, Trần Thị Nhung, Dương Thị Nụ, Đặng Ngọc Quang, 2013. Xây dựng mô hình sàng lọc chất kháng viêm thông qua thụ thể toll like 4 (TLR4) trên màng tế bào macrophage chuột. Tạp chí Dược học, 443(3): 05-10.
11. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Đặng Trọng Lương, 2014. Nghiên cứu đa hình di truyền tập đoàn các giống đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) có ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí Dược học, 457(5): 25-30.
12. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Nguyễn Văn Thiện, Hoàng Tuyết Minh, Phạm Thị Thùy, 2014. Nghiên cứu phát triển nguồn gen cây đinh lăng lá nhỏ Polyscias fruticosa (L.) Harms ở miền Đông Nam Bộ. Tạp chí Dược học, 462(10): 30-35.
13. Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai, 2007. Bước đầu nghiên cứu sự tạo dịch treo tế bào cây đinh lăng Polyscias Fruticosa L. Harms. Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ 10(7): 11-13.
14. Sanchez-Sampedro M. A., Fernandez-Ta´rrago J., Corchete P., 2005. Yeast extract and methyl jasmonate-induced silymarin production in cell cultures of Silybum marianum (L.) Gaernt. J. Biotech. (119): 60-69.
15. Slepyan L. I., Dzhabava L. A., Loshchilina I. A., 1975b. Khimicheskoe ifarmakologicheskoe zuchenie biomassy kultury tkanei Polyscias filicifolia ailey. Rast. Res. 11: 523-528.
16. Trần Công Luận, Hồ Thị Tuyết Linh, Phạm Thị Xuân Thắm, Nguyễn Thành Nguyên, Nguyễn Thượng Dong, 2001. Hợp chất Polyacetylen trong lá đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms., Araliaceae). Tuyển tập Công trình NCKH 1987-2000. Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 238-240.

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Call Now Button