SỬ DỤNG THIDIAZURON(TDZ) TRONG TÁI SINH CHỒI TỪ MÔ SẸO CÂY MÍA ĐƯỜNG

Tóm tắt: Hệ thống tái sinh chồi nhanh từ mô sẹo được nuôi cấy của giống mía NiF8 (loài Saccharum officinarum L) được thiết lập. Các mô phân sinh đỉnh thu hoạch từ chồi mía non được nuôi cấy trong môi trường Murashige và Skoog có sửa đổi, chứa 2mg/l axit 2,4-dichlorophenoxyacetic để tạo ra mô sẹo.

Mô sẹo sau đó được chuyển lên các môi trường với các nồng độ Thidiazuron khác nhau (TDZ) (0.5, 1, 2 và 3mg/l ) có hoặc không có 0,1 mg/l axit 1- naphthaleneacetic (NAA) để tái sinh chồi. Tần số tái sinh cao nhất (80,0%) được quan sát thấy sau ba tuần nuôi cấy trên môi trường chứa 1mg/l TDZ và 0,1mg / l NAA. Quan sát mô học cho thấy sự các cấu trúc tiền phôi(proembryoid) với các sợi tiền mạch(pro-vascular) được tìm thấy sau 3 ngày khi chuyển lên môi trường tối ưu(thuận lợi), sau đó hình thành mô phân sinh đỉnh và cấu trúc giống lá sau 5 đến 7 ngày, cho thấy TDZ giúp tái sinh chồi nhanh chóng thông qua một quá trình tương tự như tạo phôi soma (somatic embryogenesis). Nghiên cứu này đã chứng minh một quy trình tái sinh nhanh chóng, có thể tái sản xuất và hiệu quả của cây mía, phù hợp cho ứng dụng công nghệ sinh học bao gồm cả biến đổi gen.

Kể từ khi cây mía (Saccharum officinarum L.) trở thành một trong những cây trồng quan trọng nhất trên thế giới, bất kỳ nỗ lực nào nhằm tăng sản lượng của nó đều có tầm quan trọng to lớn. Mía cung cấp tới 60% nguồn cung đường thế giới (Grivet và Arruda 2001) và được sử dụng làm nguồn năng lượng tái tạo (De Oliveira et al. 2005; Patzek and Pimentel 2005). Để tăng năng suất của giống mía, công nghệ sinh học như nuôi cấy tế bào và mô và kỹ thuật biến đổi gen là rất quan trọng (Lakshmanan et al. 2005). Cho đến nay, các phương pháp tái sinh thực vật khác nhau đã được phát triển trên cây mía, chẳng hạn như phương pháp tạo chồi trực tiếp(direct shoot organogenesis) (Gill và cộng sự 2006; Khan và cộng sự 2009; Lakshmanan và cộng sự 2006) và tạo phôi soma (Ahloowalia và Maretzki 1983; Chengalrayan và Gallo-Meagher 2001; Chengalrayan và cộng sự 2005; Desai và cộng sự 2004; Franklin và cộng sự 2006; Gallo-Meagher và cộng sự 2000; Garcia và cộng sự 2007; Ho và Vasil 1983; Lakshmanan và cộng sự 2006). Trong số đó, Gallo-Meagher và các đồng tác giả đã chứng minh sự tái sinh thực vật nhanh chóng thông qua sự nuôi cấy mô sẹo phôi hoá (embryogenic callus) bằng cách sử dụng TDZ (Chengalrayan và Gallo-Meagher 2001; Gallo-Meagher et al. 2000). Mặc dù quy trình tái sinh bằng dung môi TDZ có tiềm năng đáng kể cho các ứng dụng công nghệ sinh học như biến đổi gen, nhưng vẫn chưa rõ liệu quy trình này có hiệu quả đối với một loạt các giống mía hay được chỉ tác dụng đối với giống CP84-1198 được sử dụng trong nghiên cứu của họ. Ngoài ra, cơ chế phát triển của quá trình tái sinh nhanh vẫn chưa được khám phá. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là 1) để áp dụng phương pháp tái sinh nhanh qua trung gian TDZ cho giống mía hàng đầu Nhật Bản, NiF8 và 2) để quan sát sự thay đổi mô học của mô sẹo ở giai đoạn đầu sau điều trị TDZ.

Cây mía (Saccharum hybrid sp.) cv. NiF8 được trồng trong nghiên cứu của Đại học tỉnh Osaka(Osaka Prefecture University) đã được sử dụng làm nguyên liệu. Các mô chồi chứa mô phân sinh đỉnh (dài 100mm dài x10mm đường kính) được thu hoạch và khử trùng bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorit (clo hoạt tính 1%) chứa 0,1% (v / v) Tween 20 trong 15 phút, sau đó rửa sạch với ethanol 70% (v / v ) trong 2 phút. Các mô được khử trùng được rửa ba lần bằng nước cất vô trùng và cắt thành các đoạn nhỏ (10 đến 15 mm) để nuôi cấy in vitro. Các mẫu nghiên cứu được nuôi cấy tạo mô sẹo trên môi trường Murashige and Skoog (MS) đã được thay đổi (Murashige và Skoog 1962), trong đó thành phần nitơ của chúng được thay thế bằng môi trường N6 (Chu et al. 1975) và được bổ sung 30g/l sucrose, 500mg/l axit casamino, 2mg/l 2,4-D và 10g/l agar (pH 5,8). Các mẫu được nuôi cấy ở 25 độ C trong bóng tối.
Trên môi trường tạo mô sẹo, xuất hiện hai loại mô sẹo, mô sẹo màu trắng tách rời(white friable callus) và mô sẹo màu vàng kết tụ (yellow compact callus), thu được sau 30 ngày nuôi cấy (Hình 1A).

HÌnh 1: Tái sinh cây nhanh từ mô sẹo mía. (A) mô sẹo vàng (c) và mô sẹo trắng (f) được lấy từ các mô phân sinh đỉnh của mía NiF8 sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường MS đã được bổ sung 2mg/l 2,4-D. Bar=1mm. (B) Các đốm đỏ được thể hiện trong mô sẹo vàng được nuôi cấy với 1mg/l TDZ và 0,1mg/l NAA trong 3 ngày. Bar=1mm. (C) Hình thành chồi sau 9 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh. Bar=1mm. (D) Phát triển nhiều chồi sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh. Bar=5mm. (E) Rễ in vitro của chồi tái sinh được nuôi cấy trên môi trường MS sửa đổi không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Bar=5mm. (F) Cây mía thích nghi. Bar=50mm

Các mô sẹo màu vàng tăng sinh tốt trên môi trường tạo mô sẹo mà không chuyển sang màu nâu, trong khi mô sẹo màu trắng cho thấy sự tăng trưởng chậm hơn và dễ dàng chuyển sang màu nâu. Khi hai loại mô sẹo này được chuyển vào môi trường chứa 1mg / l TDZ, mô sẹo vàng cho thấy khả năng tái sinh chồi cao hơn (73,0%) so với mô sẹo trắng có tần số tái sinh nhỏ hơn 1% (dữ liệu không được hiển thị).

Các nghiên cứu trước đây cũng đã báo cáo về sự khác biệt của khả năng tái sinh chồi giữa hai loại mô sẹo này(Chengalrayan và Gallo-Meagher 2001; Ho và Vasil 1983; Matsuoka et al. 1998). Khi các mô sẹo được chuyển sang môi trường MS đã được sửa đổi mà không có chất điều tiết tăng trưởng thực vật, dẫn đến chỉ một tỉ lệ nhỏ chồi được tái sinh (khoảng 20%). Ảnh hưởng của nồng độ TDZ khác nhau (0.5, 1, 2 và 3mg /l) và NAA (0,1mg / l) đối với tái sinh chồi từ mô sẹo vàng đã được kiểm tra bằng môi trường MS có sửa đổi (được biểu thị ở trên) có chứa 30g /l sucrose, 300mg/l axit casamino và agar 10g/l (pH 5,8). Mười lăm cụm callus nhỏ gọn (Ho và Vasil 1983), mỗi cụm mô sẹo vàng tương ứng với 0,1g trọng lượng tươi được đặt trên môi trường tái sinh chồi và được ủ ở 25 ° C dưới ánh sáng huỳnh quang trắng, mát ở 60 umol/m2s trong photoperiod 12h. Thí nghiệm được sắp xếp theo khuôn hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại trên mỗi lần thử nghiệm.

Hình 3. Quan sát mô học của mẫu ở các giai đoạn tái sinh khác nhau. (A) Phần của mô sẹo vàng vào ngày chuyển vào môi trường tạo mô sẹo. (B) Phân biệt cấu trúc giống tiền phôi (đầu mũi tên) bao gồm các tế bào tế bào chất dày đặc nhỏ (ngày 0). (C), (D) Phân biệt các sợi tiền mạch (đầu mũi tên) cùng với tiền phôi hình cầu sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh chứa 1mg/l TDZ và 0,1mg/l NAA. (E), (F) Các cấu trúc giống phôi phát triển tốt đã hình thành các mô phân sinh (đầu mũi tên) và lá bao mầm (dấu sao) sau 5 (E) và 7 (F) trên môi trường tái sinh. Bar = 50um

Dữ liệu được thu thập hàng tuần trong suốt 3 tuần và được phân tích bằng một cách phân tích phương sai (ANOVA), và kiểm tra theo phương pháp Scheff (Scheff’s F-test) (P<0,05). Theo đó, nồng độ TDZ rõ ràng ảnh hưởng đến tần số tái sinh chồi. Trong bốn nồng độ được kiểm tra, 1mg/l cho tần số tái sinh chồi cao nhất (73,0%) sau ba tuần nuôi cấy (Hình 2). Ở nồng độ TDZ này, việc sử dụng đồng thời 0,1mg/l NAA đã tăng tần số tái sinh (80,0%) nhưng không đáng kể (P <0,05). Gallo-Meagher và cộng sự (2000) cũng báo cáo sự tái sinh nhanh chóng và tần số cao (~ 100%) của chồi từ cấu trúc giống phôi trên môi trường có chứa 5-10 uM (khoảng 1,1 đến 2,2mg/l) TDZ. Những kết quả này cho thấy TDZ có thể có hiệu quả trong việc tạo ra các chồi từ mô sẹo vàng trong một loạt các giống mía, và tần số tái sinh phụ thuộc vào nguyên liệu ban đầu dùng để tái tạo mô sẹo. Như một nguyên liệu cho tái tạo mô sẹo, Gallo-Meagher và cộng sự (2000) đã sử dụng các mô chưa trưởng thành xuất hiện trước trong các mô phát triển, trong khi chúng tôi sử dụng các mô phân sinh, thường dễ lấy hơn.

Khi mô sẹo vàng được chuyển vào môi trường tái sinh tối ưu chứa 1mg/l TDZ và 0,1mg/l NAA, các đốm đỏ xuất hiện trong vòng 3 ngày. Màu của các đốm đỏ tăng dần theo thời gian nuôi cấy (Hình 1B) và các chồi xuất hiện chủ yếu từ khu vực đốm đỏ sau 4 ngày nuôi cấy. Sau 9 ngày, một loạt các chồi với chiều dài khoảng 5 mm đã được quan sát rõ ràng (Hình 1C) và nhiều chồi dài hơn 10 mm đã được quan sát trên mô sẹo (> 20 chồi trên mỗi cụm mô sẹo) 21 ngày sau khi chuyển (Hình 1D). Quá trình tái sinh có phần ngắn hơn so với báo cáo trước đây của GalloMeagher và cộng sự (2000), trong đó chồi dài hơn 10 mm thu được sau bốn tuần nuôi cấy tái sinh.

Để kiểm tra tiến trình ban đầu của quá trình tái sinh chồi nhanh trên môi trường chứa TDZ, quan sát mô học của mô sẹo được thực hiện ở giai đoạn đầu sau khi chuyển vào môi trường chứa 1mg/l TDZ và 0,1mg/l NAA. Các mô sẹo và/hoặc chồi tái sinh được thu thập 0 (chưa được xử lý) đến 7 ngày sau khi nuôi cấy và được nhúng vào Technovit 7100 (Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim, Đức) sau khi thử nghiệm bằng các quy trình tiêu chuẩn về lắng tụ và khử nước(fixation and dehydration). Các phần dày khoảng 4um được cắt bằng Microtome (Công ty TNHH Yamato Kohki, Asaka, Nhật Bản) (Yamato Kohki Co. Ltd., Asaka, Japan) và nhuộm màu xanh toluidine. Hình ảnh hiển vi được chụp bằng hệ thống kiểm soát hình ảnh VB-6000 (Keyence, Osaka, Nhật Bản) và được trang bị kính hiển vi IX71 (Olympus, Tokyo, Nhật Bản).

Ở giai đoạn ban đầu (ngày 0), các mô sẹo bao gồm các kích thước khác nhau của các cụm tế bào, mỗi mô được bao quanh bởi một lớp tế bào riêng biệt, có lẽ là một vỏ phân sinh ngọn (protoderm) (Hình 3). Ở giai đoạn này, một số cụm tế bào đã tạo ra các cụm tế bào nhỏ giống tiền phôi (proembryoid) (Ho và Vasil 1983) bao gồm các tế bào nhỏ có tỷ lệ nhân (nucleus) cao so với tế bào chất ở lớp tế bào ngoại vi (Hình 3B; được chỉ ra bởi mũi tên). Các cấu trúc giống như phôi đã hình thành các mô phân sinh và cấu trúc giống như lá bao mầm (coleoptile) sau 5 ngày nuôi cấy (Hình 3E) và các cấu trúc tiếp tục phát triển sau 7 ngày nuôi cấy (Hình 3F). Tuy nhiên, sự phát triển của rễ nguyên thủy (root primordia) không được quan sát ở giai đoạn này. Tuy nhiên, mô hình phát triển của tiền phôi (proembryoids) và cấu trúc giống phôi tương tự như mô hình phôi soma được quan sát trong các nghiên cứu trước đây (Franklin et al. 2006; Garcia et al. 2007; Ho and Vasil 1983), sử dụng zeatin cùng với/ hoặc không axit gibberellic (GA), 6-benzylaminopurine (BA) với NAA và không có chất điều chỉnh tăng trưởng, tương đối. Sự hình thành phôi soma cũng được kích thích bởi TDZ trong nuôi cấy thóc lúa (rice caryopsis) (Gairi và Rashid 2004), cho thấy TDZ thường có thể ảnh hưởng đến sự khác biệt của các phôi sẹo trong cây trồng (gramineous plants). Do đó, người ta cho rằng sự tái sinh chồi nhanh được kích thích bằng TDZ đạt được thông qua một quá trình tương tự như quá trình tạo phôi soma và TDZ đã kích thích sự biệt hóa chồi của cấu trúc giống phôi nhưng không phải là rễ nguyên thủy trong cây mía. NiF8 được sử dụng trong nghiên cứu này.

Các chồi được tạo ra trên môi trường có chứa TDZ dễ dàng tạo rễ (100%) khi chúng được chuyển vào lọ nuôi cấy (đường kính 55mmxchiều cao 110 mm) có chứa môi trường MS không có chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật (Hình 1E). Trong các nghiên cứu trước đây, rễ cũng được tái sinh trong môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Desai et al. 2004; Franklin et al. 2006; Garcia et al. 2007; Lakshmanan et al. 2006), mặc dù IBA đã được sử dụng cho tái sinh rễ của chồi được xử lí TDZ (TDZ-treated shoots ) (Chengalrayan and Gallo-Meagher 2001; Chengalrayan et al. 2005; Gallo-Meagher et al. 2000). Những cây có rễ in vitro này đã được thích nghi thành công (100%) trong đất trong chậu (Hình 1F) và sau đó được trồng trong nông trường. Kể từ khi mô sẹo được sử dụng trong nghiên cứu có thể duy trì khả năng tái sinh trong hơn một năm, nên một biến đổi gen hiệu quả và có thể thực hiện số lượng lớn (an efficient and reproducible genetic transformation) bằng phương pháp tái tạo mô sẹo nhanh sẽ khả thi trong tương lai gần.

Nhận định (Acknowledgements)

Chúng tôi cảm ơn Tiến sĩ T. Sakaigaichi, Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia cho Vùng Kyushu Okinawa, vì đã cung cấp nguyên liệu mía và Tiến sĩ M. Mizuhiro đã hỗ trợ chuẩn bị bản thảo. Công trình này được hỗ trợ bởi Quỹ nghiên cứu sau đại học của Đại học tỉnh Osaka

Mwathi Jane Wamaitha1,a, Kyoko Suwa2, Ken-ichi Fukuda2, Masahiro Mii3, Hiroyuki Daimon2, Kei-ichiro Mishiba2,*
1 Kenya Agricultural Research Institute, P. O. Box 14733, Nairobi, Kenya; 2 Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture University, Sakai, Osaka 599-8531, Japan; 3 Graduate School of Horticulture, Chiba University, Matsudo, Chiba 271-8510, Japan
*E-mail: mishiba@plant.osakafu-u.ac.jp Tel & Fax: +81-72-254-9416
Ngày nhận được 12 tháng 4 năm 2010; được chấp nhận ngày 21 tháng 5 năm 2010 (Sửa đổi bởi M. Nakano)

Tham khảo (References)

Ahloowalia BS, Maretzki A (1983) Plant regeneration via somatic embryogenesis in sugarcane. Plant Cell Rep 2: 21–25
Chengalrayan K, Gallo-Meagher M (2001) Effect of various growth regulators on shoot regeneration of sugarcane. In Vitro Cell Dev Biol Plant 37: 434–439
Chengalrayan K, Abouzid A, Gallo-Meagher M (2005) In vitro regeneration of plants from sugarcane seed-derived callus. In Vitro Cell Dev Biol Plant 41: 477–482
Chu CC, Wang CC, Sun CS, Hsu C, Yin KC, Chu CY, Bi FY (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Sci Sin 18: 659–668
De Oliveira MED, Vaughan BE, Rykiel EJ (2005) Ethanol as fuel: energy, carbon dioxide balances, and ecological footprint. Bioscience 55: 593–602
Desai NS, Suprasanna P, Bapat VA (2004) Simple and reproducible protocol for direct somatic embryogenesis from cultured immature inflorescence segments of sugarcane (Saccharum spp.). Curr Sci 87: 764–768
Franklin G, Arvinth S, Sheeba CJ, Kanchana M, Subramonian N (2006) Auxin pretreatment promotes regeneration of sugarcane (Saccharum spp. hybrids) midrib segment explants. Plant Growth Regul 50: 111–119
Gairi A, Rashid A (2004) TDZ–induced somatic embryogenesis in non-responsive caryopses of rice using a short treatment with 2,4-D. Plant Cell Tissue Organ Cult 76: 29–33
Gallo-Meagher M, English RG, Abouzid A (2000) Thidiazuron stimulates shoot regeneration of sugarcane embryogenic callus. In vitro Cell Dev Biol Plant 36: 37–40
Garcia R, Cidade D, Castellar A, Lips A, Magioli C, Callado C, Mansur E (2007) In vitro morphogenesis patterns from shoot apices of sugarcane are determined by light and type of growth regulator. Plant Cell Tissue Organ Cult 90: 181–190
Gill R, Malhotra PK, Gosal SS (2006) Direct plant regeneration from cultured young leaf segments of sugarcane. Plant Cell Tissue Organ Cult 84: 227–231
Grivet L, Arruda P (2001) Sugarcane genomics: depicting the complex genome of an important tropical crop. Curr Opin Plant Biol 5: 122–127
Ho WJ, Vasil IK (1983) Somatic embryogenesis in sugarcane (Saccharum officinarum L.) I. The morphology and physiology of callus formation and the ontogeny of somatic embryos. Protoplasma 118: 169–180
Khan IA, Dahot MU, Seema N, Yasmeen S, Bibi S, Raza G, Khatri A, Naqvi MH (2009) Direct regeneration of sugarcane plantlets: a tool to unravel genetic heterogeneity. Pak J Bot 41: 797–814
Lakshmanan P, Geijskes RJ, Aitken KS, Grof CLP, Bonnett GD, Smith GR (2005) Sugarcane biotechnology: The challenges and opportunities. In Vitro Cell Dev Biol Plant 41: 345–363 Lakshmanan P, Geijskes RJ, Wang L, Elliott A, Grof CPL, Berding N, Smith GR (2006) Developmental and hormonal regulation of direct shoot organogenesis and somatic embryogenesis in sugarcane (Saccharum spp. interspecific hybrids) leaf culture. Plant Cell Rep 25: 1007–1015
Matsuoka M, Fukuoka H, Ogawa T, Yano H, Ujihara K, Sugimoto A (1998) Efficient plant regeneration from protoplasts of sugarcane. Plant Biotechol 15: 135–137
Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473–497
Patzek TW, Pimentel D (2005) Thermodynamics of energy production from biomass. Crit Rev Plant Sci 24: 327–364

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *