SỰ TÁI SINH IN VITRO CÀ RỐT DAUCUS CAROTA L

Các thí nghiệm được tiến hành để tối ưu hóa điều kiện để tạo ra hình thái mô sẹo và tái sinh cà rốt  bằng cách sử dụng bốn giống cà rốt được trồng ở Iran. Các đoạn trụ dưới mầm được đặt vào môi trường có bổ sung 0,2 mg/L 2,4 D để hình thành và phát triển mô sẹo. Những phần mô sẹo nhỏ (25 mg) được cắt ra và chuyền vào môi trường mới với nồng độ 2,4-D lần lượt là 0,2; 0,5 và 1 mg/L.

Môi trường MS (Murashige và Skoog 1962) và MSm (Masuda và cộng sự, 1981) được sử dụng trong thí nghiệm này để cho thấy sự khác nhau giữa hai môi trường trong việc hình thành mô sẹo, phôi và cây con.

Kết quả đạt được cho thấy khi nồng độ 2,4-D thấp (0,2 mg/L) có ảnh hưởng nhiều hơn đến sự hình thành hình thái mô sẹo, trong khi đó hàm lượng cao chất này (0,5 mg/L và 1 mg/L) sẽ làm cho mô sẹo phát triển. Nồng độ Kinetin là 0,1 mg/L có ảnh hưởng nhiều đến sự tái sinh hơn là BAP (được sử dụng ở nồng độ 1 mg/L) nhất là trong việc tạo phôi. Môi trường MSm có hiệu quả hơn MS trong tạo phôi và tái sinh cà rốt thành cây. Trong số các giống được sử dụng có giống Nantes Improved có nhiều khả năng sản sinh ra cây sống được.

GIỚI THIỆU

Sự hình thành và tái sinh mô sẹo chịu ảnh hưởng bởi kiểu gen, kiểu mẫu vật, loại và nồng độ của hóc môn được sử dụng trong môi trường. Nhiều thí nghiệm đã được thực hiện để thiết lập nên hệ thống tái sinh cho cà rốt (Daucus carota L.) (Tukavin và Shmikova 2000; Kalashnikova 2003; Polyakov 2005; Polyakov và Chikrizova 2009).

Auxin được sử dụng rộng rãi để cảm ứng sự sản sinh ra mô sẹo. Loại auxin thường được sử dụng nhất để tạo mô sẹo là 2,4-D. Trong nhân giống việc tạo ra phôi mô sẹo là rất quan trọng. Quá trình phát sinh phôi vô tính thường được khởi đầu trong môi trường có nồng độ cao auxin, nhất là 2,4-D, nhưng phôi thường không phát triển nữa cho tới khi nồng độ auxin được giảm đi (theo Edwin và cộng sự, 2008). Sharp và cộng sự (1980) đưa ra rằng auxin đã gây ra sự hình thành phôi trong một phần của các tế bào trong mô sẹo hoặc trong nuôi cấy huyền phù, nhưng cùng lúc sẽ làm cho chúng phát triển xa hơn hình thành phôi. Người ta đưa ra giả thiết rằng sự phân chia của tế bào tiền phôi và sự phát triển của chúng thành phôi chỉ diễn ra ở nồng độ auxin thấp hơn (theo Edwin và công sự, 2008).

Ảnh hưởng của cytokinin được chú ý nhất trong nuôi cấy mô, thường thì chất này được sử dụng cùng với auxin để kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái. Cytokinin tổng hợp thường được dùng nhất trong vi nhân giống là Kinetin và benzylaminopurine (BAP). Nồng độ thấp của cytokinin (điển hình là 0,5 – 2,5 μM) thường được cho vào môi trường để cảm ứng hình thành phôi mô sẹo, nhất là ở các loại cây lá rộng (theo Edwin và cộng sự, 2008). Mỗi loại cytokinin được ghi nhận là sự khởi phát cho việc hình thành phôi (theo Fujimura và Komamine, 1979)

Nghiên cứu này được thực hiện để xác định sự ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên sự hình thành phôi mô sẹo và đưa ra hiệu quả của BAP và kinetin lên sự phát sinh hình thái và phát sinh phôi của cây cà rốt.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học của Viện nghiên cứu All Russian Research Institute of Vegetable Crops RAAS, năm 2008-2009. Hạt của bốn loại cà rốt được trồng ở Iran bao gồm Monarch, Nantes Improved, Tam Tam và Vilmorn được sử dụng để tạo ra các đoạn trụ dưới mầm. Trong thí nghiệm này hạt cà rốt được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong ethanol 70% (v/v) khoảng 30 giây và trong dung dịch sodium hypochlorite 1% khoảng 10 phút, sau đó rửa 3 lần với nước vô trùng khoảng 5 phút. Rồi đem hạt đặt vào môi trường MS (Murashgue và Skoog 1962) có chứa 30 g/L đường sucrose, agar 5g/L và đem ủ ở nhiệt độ 25±1°C. Môi trường được hấp khử trùng 2 lần trong 30 phút (15 phút + 15 phút) ở nhiệt độ 25±1°C, sau khi pH được chỉnh về 5,6. Việc nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ phòng nuôi cấy với cường độ ánh sang là 1000 μmol/m2. giây, nhiệt độ 25±1°C và độ ẩm tương đối là 70-80% với chu kì sáng/tối là 16/8 giờ. Sau 2 tuần những đoạn trụ dưới mầm dài từ 4-6 mm sẽ được cắt và đặt vào môi trường MS có chứa 0,2 mg/L 2,4-D để tạo sẹo. Dự đoán ảnh hưởng của 2,4-D lên sự phát triển mô sẹo, các mẩu mô sẹo được chia ra khoảng 25 mg và chuyển vào môi trường MS và MSm mới có bổ sung 2,4-D ở nồng độ 0,1; 0,5 và 1 mg/L. 10 mẫu mô sẹo trên mỗi đĩa petri được sử dụng và lập lại 3 đĩa cho mỗi thí nghiệm. Các đặc điểm của mô sẹo bao gồm phát sinh hình thái, phát sinh phôi (đếm số lượng mô sẹo phát sinh hình thái và phát sinh phôi trên số lượng mô sẹo, tính theo %) được xác định và ghi nhận sau 1 tháng nuôi. Phân tích sự khác biệt khối lượng của mô sẹo được thực hiện dưới dạng thí nghiệm hệ số dựa trên bố trí khối hoàn toàn ngẫu nhiên sử dụng phần mềm SAS phiên bản 9. Giá trị trung bình được so sánh, sử dụng Duncan’s Multiple Range Test với mức xác suất P = 0,05.

Để nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và kinetin lên phát sinh hình thái, các mẫu mô sẹo được nuôi trên môi trường MS và MSm có chứa kinetin 0,2 mg/L và BAP 1 mg/L, để đếm số lượng phôi và chồi. Tương tự như thí nghiệm đầu tiên, 10 mẫu mô sẹo được đặt trên mỗi đĩa petri và lặp lại 3 đĩa cho mỗi thí nghiệm. Sự uớc tính phát sinh hình thái và phôi được thể hiện lên biểu đồ bằng Excel 2007.

Cây con và phôi được tái sinh được lấy ra khỏi môi trường và đặt lên giấy lọc trong ống nghiệm thủy tinh có chứa MS lỏng chứa 15 mg/L sucrose. Sau một tháng nuôi cấy tốt, các cây con phát triển hệ rễ sẽ được chuyển khỏi ống nghiệm chứa môi trường và rửa sạch bằng nước máy. Sau đó đem chuyển chúng vào các túi nhựa có chứa đất đã được khử trùng. Để cho cây con thích nghi cần duy trì độ ẩm cao trong túi nhựa khóa kín trong vòng 3 tuần, để ở nơi có bóng mát và nhiệt độ 22 ± 2ºC. Trong tuần cuối cùng thích nghi với khí hậu bên ngoài, cho cây con tiếp xúc trực tiếp với không khí tự nhiên, mở túi ra vài lần một ngày và phun nước cho cây. Sau khi cây đã thích nghi thì chuyển sang nhà kính.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sự hình thành mô sẹo phát sinh hình thái

Phân tích sự khác biệt khối lượng mô sẹo cho thấy các giá trị trung bình đối với môi trường, hóc môn, và giống cây có sự khác biệt đáng kể nhưng không có khác biệt lớn trong khi phối hợp các yếu tố này với nhau (bảng 1). So sánh các giá trị trung bình (bảng 2) cho thấy giá trị trung bình khối lượng mô sẹo trong môi trường MSm (42,8 mg) cao hơn so với môi trường MS (39,6 mg). Trên môi trường MSm không chỉ khởi sinh và phát triển mô sẹo tốt hơn MS mà tỉ lệ mô sẹo phát sinh hình thái cũng cao hơn với mỗi giống (bảng 3). Điểm khác nhau chủ yếu giữa môi trường MS và MSm là sự diện diện của casein hydrolysed (500 mg/L) trong MSm. Casein hydrolysate là nguồn canxi, phốt phát, một vài nguyên tố vi lượng, vitamin và quan trọng nhất là hỗn hợp này có tới 18 amino acid. Casein hydrolysate rất hiệu quả cho sự phát triển trong nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy chồi và phát sinh phôi (Edwin và cộng sự, 2008)

Bảng 1-Phân tích sự khác biệt khối lượng mô sẹo

Sự khác biệt DF MS
Khối
Môi trường
Nồng độ 2,4-D
Giống
Môi trường và nồng độ 2,4-D
Môi trường và giống
Nồng độ 2,4-D và giống
Môi trường và nồng độ 2,4-D và giống
2
1
2
3
2
3
6
6
94,5*
172,05**
558,6**
18,5**
16,6ns
27ns
3,69ns
2,5ns

*Đáng kể ở mức 0,05; ** Đáng kể ở mức 0,01; ns: không đáng kể

Bảng 2 – So sánh giá trị trụng bình của khối lượng mô sẹo (mg) cho từng môi trường, nồng độ 2,4-D và giống cây

Môi trường Khối lượng mô sẹo (trung bình) 2,4-D Giống cây
Nồng độ Trung bình Tên Trung bình
MS 39.6 a* 0.2 37.1 a Monarch 39.4 a
MSm 42.8 b 0.5 40.0 b Nantes Improved 37.7 a
  42.8 b 0.5 40.0 b Nantes Improved 37.7 a
        Vilmorn 44.4 b

*Những số được theo sau bởi cùng chữ cái thì không có khác biệt đáng kể

Tỉ lệ phát triển mô sẹo bị ảnh hưởng bởi nồng độ 2,4-D đưa vào môi trường.

Nói chung, trong thí nghiệm của chúng tôi khi nồng độ 2,4-D cao dẫn đến phát sinh khối lượng mô sẹo nhiều hơn (46,5 mg), nhưng theo kết quả được thể hiện trong bảng 3 thì mô sẹo phát sinh hình thái thấp hơn trong điều kiện này (40%). Giá trị trung bình khối lượng mô sẹo trong môi trường chứa 0,2 mg/L 2,4-D (37,1 mg) thì thấp nhất trong số các nồng độ, nhưng tỉ lệ mô sẹo phát sinh hình thái lại cao nhất (72%).

Trường hợp này tương tự cho lượng mô sẹo phát sinh hình thái đối với mỗi loại giống. Nguồn mẫu từ giống Nantes Improved được nuôi trong môi trường MSm có chứa 0,2 mg/L 2,4-D sinh ra nhiều mô sẹo phát sinh hình thái nhất (90%) (bảng 3). Và cũng nhiều hơn hơn so với các giống khác được nuôi trong môi trường tương tự với 1 mg/L 2,4-D (50%). Lượng mô sẹo phát triển cũng phụ thuộc vào loại giống. Ví dụ giống Vilmorn có khối lượng mô sẹo cao nhất (33,4 mg) và Nantes có khối lượng thấp nhất 37,7 mg, nhưng lượng mô sẹo phát sinh hình thái của Nantes Improved (64%) cao hơn so với Vilmorn (46%). Sự khác nhau giữa các giống trong phát sinh mô sẹo của vài giống cây trồng khác đã được báo cáo trong nghiên cứu của Oggema và cộng sự, 2007; Silvertand và cộng sự, 1996.

Bảng 3. Sự hình thành mô sẹo phát sinh hình thái của các giống cà rốt trong sự phụ thuộc vào môi trường và nồng độ 2,4-D

Kiểu gen Môi trường Nồng độ 2,4-D Tỉ lệ mô sẹo phát sinh hình thái
Monarch MS 0.2 70 ± 8.4
0.5 43 ± 9.0
1.0 40 ±8.9
MSm 0.2 83 ±6.8
0.5 50 ±9.1
1.0 47 ±9.1
Nantes
Improved
MS 0.2 77 ±7.6
0.5 60 ±8.9
1.0 43 ±9.0
MSm 0.2 90 ±5.5
0.5 60 ±8.9
1.0 50 ±9.1
Tam Tam MS 0.2 63 ±8.8
0.5 50 ±9.1
1.0 34 ±8.7
MSm 0.2 73 ±8.1
0.5 53 ±9.1
1.0 40 ±8.9
Vilmorn MS 0.2 47 ±9.1
0.5 40 ±8.9
1.0 30 ±8.4
MSm 0.2 67 ±8.6
0.5 50 ±9.1
1.0 40 ±8.9

Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo phát sinh hình thái được nghiên cứu bởi các nhà khoa học khác. Nuôi cấy mô sẹo của Arabidopsis thaliana được khởi phát và duy trì trên môi trường chứa 2,4-D, nhưng khả năng phát sinh hình thái của chúng bị mất dần khi duy trì lâu ngày trên môi trường, cuối cùng sau 6-8 tháng tái sinh khả năng này bị mất hoàn toàn (Edwin và cộng sự, 2008). Fujimura và Komamine (1979), De Vries và cộng sự (1988) và Ribnicky (1996) đã báo cáo rằng tế bào phôi Daucus carota hình thành từ mẫu vật trụ dưới lá mầm khi có 2,4-D.

Một thí nghiệm được tiến hành bởi Dinghou (1994) sử dụng nồng độ 2,4-D khác nhau để kiểm tra xem ảnh hưởng của chất này lên sự tạo ra mô sẹo phát sinh hình thái đối với lúa. Khi môi trường không có 2,4-D các mẫu đều không phát sinh hình thái. Khi có 2,4-D từ 1 hoặc 2 mg/L, mô sẹo không phôi, xốp được hình thành và khi nồng độ 2,4-D là 0,2 và 0,5 mg/L thì mô sẹo và chồi bất định được hình thành.

Oggema và cộng sự (2007) cũng báo cáo rằng nồng độ 2,4-D trong môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến tần suất, kiểu và chất lượng của mô sẹo được hình thành. Họ xác định rằng nồng độ tối ưu của 2,4-D mang lại hiệu quả hơn khi ở mức thấp. Radhakrishnan và cộng sự (2001) cũng báo cáo rằng các tế bào phát triển trong 2,4-D nồng độ cao có biểu hiện bị ảnh hưởng diệt cỏ và làm chậm quá trình phát sinh mô sẹo.

Sự tái sinh

Kết quả đạt được cho thấy rằng môi trường MSm có ảnh hưởng nhiều hơn MS trong sự phát sinh hình thái và phát sinh phôi của cà rốt. Hầu hết các trường hơp tỉ lệ mô sẹo phát sinh hình thái trong môi trường MSm cao hơn MS (bảng 4). Tỉ lệ phát sinh hình thái cao nhất (82,8%) đạt được khi mô sẹo của giống Nantes Improved được chuyền từ MSm chứa 0,2 mg/L 2,4-D sang MSm chứa 0,1 mg/L kinetin, trong khi tỉ lệ này trên môi trường MS với cùng lượng hóc môn là 65%. Sự khác biệt rõ ràng hơn khi so sánh số lượng chồi trên cụm mô sẹo và tỉ lệ mô sẹo phát sinh phôi. Số lượng chồi sản sinh ra trên mỗi mô sẹo là 3,17 và 2,53 cho môi trường MS và MSm. Tỉ lệ mô sẹo phát sinh phôi đối với hai môi trường này lần lượt là 73,3 và 53,3. Cũng có kết quả tương tự cho các biến số khác đối với các giống cây khác. Có thể kết luận rằng môi trường MSm có ảnh hưởng trực tiếp đến sự gia tăng mô sẹo phát sinh hình thái và phát sinh phôi của cà rốt nhờ vào sự có mặt của casein hydrolysate trong môi trường (bảng 4).

Việc thêm casein hydrolysate vào môi trường MS được cho là cần thiết cho sự hình thành chồi từ mô sẹo (Chand và Roy, 1981). Nuôi cấy huyền phù tế bào cà rốt hoang dại trong môi trường có casein hydrolysate đóng vai trò là nguồn cung cấp ni tơ để sản sinh phôi vô tính (Anderson, 1976). Mặc dù có nhiều báo cáo về sự phát sinh phôi được thúc đẩy bằng cách thêm casein hydrolysate, nhưng trong nhiều trường hợp mô sẹo phôi hóa và hoặc sự hình thành phôi không xảy ra khi có mặt của nguồn amino acid này (Radojevic 1988; Nuti Ronchi và cộng sự,1984; Gupta và cộng sự 1987; Osifo, 1988).

Ảnh hưởng tích cực khi sử dụng nồng độ thấp 2,4-D lên sự phát sinh hình thái trong giai đoạn đầu của mô sẹo và tái tạo mẫu vật ở giai đoạn sau dễ dàng thấy được ở bảng 4. Hầu hết các giống và môi trường, tỉ lệ mô sẹo phát sinh hình thái, mô sẹo phôi hóa và số lượng chồi trên mỗi mô sẹo có giá trị có giá trị cao nhất khi 2,4-D ở nồng độ 0,2 mg/L được sử dụng để khởi sinh mô sẹo và kinetin ở nồng độ 0,1 mg/L được sự dụng cho tái sinh. Nói chung, nồng độ cao 2,4-D trong môi trường làm giảm khả năng tái sinh. Hơn nữa, BAP ít ảnh hưởng hơn kinetin lên sự phát sinh phôi. Tỉ lệ phát sinh hình thái thấp nhất (16,7%) được thấy ở giống Vilmorn khi 2,4-D (1 mg/L) và BAP (1 mg/L) được sử dụng trong môi trường. Việc sử dụng kinetin thay cho BAP dấn đến sản sinh ra 53,3% mô sẹo phát sinh hình thái và tăng dạng phôi hóa từ 3,3% đến 30%. Số lượng chồi ít nhất trên mô sẹo (0,1) đối với giống Tam Tam, khi mô sẹo phát triển trên MS chứa 2,4-D (1 mg/L) được chuyển sang MS chưa BAP.

Bảng 4. Ảnh hưởng của giống, môi trường, 2,4-D, BAP và Kinetin lên sự phát sinh hình thái và phôi của cà rốt

Kiểu gen Môi trường Nồng độ 2.4-D Cytokinin Phát sinh hình thái (%) Số lượng chồi / mô sẹo Phát sinh phôi (%) Số lượng cây con tái sinh
Monarch MS 0.2 BAP 30.0 ± 8.4 0.53 6.70 ± 4.6 2
Kin 55.0 ± 9.1 2.03 44.3 ± 9.1 8
0.5 BAP 23.3 ± 7.7 0.57 3.30 ± 3.3 2
Kin 45.6 ± 9.1 1.10 30.0 ± 8.4 7
1 BAP 18.3 ± 6.2 0.30 0 1
Kin 36.7 ± 8.8 0.90 22.4 ± 7.6 3
MSm 0.2 BAP 33.0 ± 8.6 0.53 6.70 ± 4.6 3
Kin 69.0 ± 8.4 1.47 56.6 ± 9.0 8
0.5 BAP 28.0± 8.2 0.77 6.70 ± 4.6 3
Kin 55.5 ± 9.1 1.33 40.0 ± 8.9 6
1 BAP 26.7 ± 8.1 0.57 3.30 ± 3.3 2
Kin 50.0 ± 9.1 1.10 30.0 ± 8.4 6
Nantes Improved MS 0.2 BAP 46.0 ± 9.1 0.80 6.70 ± 4.6 5
Kin 65.0 ± 8.7 2.53 53.3 ± 9.1 10
0.5 BAP 43.2 ± 9.0 0.73 10.0 ± 5.5 5
Kin 52.0 ± 9.1 1.47 43.3 ± 9.0 7
1 BAP 40.3 ± 9.0 0.60 3.30 ± 3.3 3
Kin 45.4 ± 9.1 1.03 36.7 ± 8.8 6
MSm 0.2 BAP 56.7 ± 9.0 1.23 10.0 ± 5.5 8
Kin 82.8 ± 6.9 3.17 73.3 ± 8.1 14
0.5 BAP 45.5 ± 9.1 1.07 6.70 ± 4.6 7
Kin 71.3 ± 8.3 1.83 62.6 ± 8.8 11
1 BAP 39.3 ± 8.9 0.70 10.0 ± 5.5 5
Kin 60.0 ± 8.9 1.87 46.7 ± 9.1 10
Tam Tam MS 0.2 BAP 36.7 ± 8.8 0.67 6.70 ± 4.6 3
Kin 49.4 ± 9.1 1.27 38.8 ± 8.9 8
0.5 BAP 20.0 ± 7.3 0.50 0 2
Kin 43.3 ± 9.0 0.97 30.0 ± 8.4 7
1 BAP 6.70 ± 4.6 0.10 0 0
Kin 40.1 ± 8.9 1.00 26.7 ± 8.1 6
MSm 0.2 BAP 40.2 ± 9.0 0.97 6.70 ± 4.6 7
Kin 70.0 ± 8.4 2.10 56.7 ± 9.0 12
0.5 BAP 32.2 ± 8.5 0.57 6.70 ± 4.6 3
Kin 56.6 ± 9.0 1.53 43.3 ± 9.0 8
1 BAP 23.3 ± 7.7 0.37 3.30 ± 3.3 2
Kin 36.7 ± 8.8 0.60 23.3 ± 7.7 3
Vilmorn MS 0.2 BAP 42.5 ± 9.0 0.30 6.70 ± 4.6 1
Kin 62.3 ± 8.8 1.90 36.7 ± 8.8 11
0.5 BAP 35.0 ± 8.7 0.27 3.30 ± 3.3 2
Kin 46.7 ± 9.1 1.00 28.2 ± 8.2 9
1 BAP 34.0 ± 8.6 0.23 3.30 ± 3.3 1
Kin 40.0 ± 8.9 1.00 23.3 ± 7.7 7
MSm 0.2 BAP 47.0 ± 9.1 0.73 10.0 ± 5.5 6
Kin 71.3 ± 8.3 2.33 53.3 ± 9.1 12
0.5 BAP 40.3 ± 9.0 0.33 6.60 ± 4.6 1
Kin 62.3 ± 8.8 1.43 44.4 ± 9.1 9
1 BAP 16.7 ± 6.8 0.23 3.30 ± 3.3 1
Kin 53.3 ± 9.1 1.23 30.0 ± 8.4 8

Tuy nhiên, số lượng cơ quan phát sinh nhiều nhất trên mỗi mô sẹo (3,17 cho giống Nantes Improved) đạt được khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường có 2,4-D ở nồng độ 0,1 mg/L và trên môi trường có kinetin 0,2 mg/L

Sử dụng 2,4-D ở nồng độ thấp sản sinh ra mô sẹo và phát sinh phôi, kinetin đối với sự tái sinh của cà rốt và những cây trồng khác được đề cập tới trong nhiều báo cáo. Silvertand và cộng sự, 1996 đã báo cáo rằng, đối với tỏi tây (Allium ampeloprassum L.) khi nồng độ 2,4-D cao sẽ tạo ra mô sẹo mềm và nhiều nước trong khi nồng độ 2,4-D thấp lại cho mô sẹo có phôi rắn chắc. Komamine và công sự (1990) mô tả rằng đối với cà rốt khi nuôi cấy trong môi trường có 2,4-D nồng độ là 0,05 μM, trong khoảng 6 tuần sẽ cảm ứng các tế bào đơn phát sinh thành phôi vô tính. Ngoài thời gian này auxin bị ức chế. Satoh và cộng sự, 1986, sử dụng đoạn trụ dưới mầm 1 tuần tuổi của cà rốt để sản sinh ra mô sẹo trong môi trường chứa 1 mg/L 2,4-D, sau đó chuyền sang môi trường mới để tái sinh. Sự hình thành phôi vô tính bị ức chế mạnh và vừa khi nồng độ 2,4-D lần lượt là 1 µM và 0.1 µM, nhưng lại không bị ức chế bởi 10 nM 2,4-D.

Loại cytokinin và ảnh hưởng của nó đến sự phát sinh hình thái phụ thuộc cơ bản vào giống cây trồng. Halperin và Wetherell (1964) lưu ý rằng 0,2 mg/L kinetin có thể sử dụng trong nhiều môi trường khác nhau để thúc đẩy sự phát sinh hình thái của mô sẹo cà rốt. Shary và cộng sự (2006) báo cáo rằng đối với Melia azedarach, BAP thích hợp cho phát sinh cơ quan hơn kinetin, kinetin chỉ cảm ứng tạo ra mô sẹo không phát sinh cơ quan. Điều này tương tự với kết quả của Nirmalakumari và cộng sự (1993) và Drew (1996) đối với cây “neem” (Azadirachta indica Juss.), khi chỉ có mặt kinetin sẽ cảm ứng tạo ra mô sẹo không phát sinh hình thái. Có nhiều báo cáo cho thấy kinetin có thể cảm ứng hoặc thúc đẩy sự phát triển rễ (Fries, 1960) hoặc hình thành rễ bất định khi có mặt auxin (Nemeth, 1979). Trong hầu hết các trường hợp, chỉ có nồng độ thấp cytokinin là có hiệu quả. Ví dụ, chồi của củ cải đường ra rễ trên môi trường MS chứa 0,5 mg/L kinetin mà không có mặt của auxin (Konwar và Coutts 1990).

Trong thí nghiệm của chúng tôi có 271 cây xanh, có thể sống và đáp ứng với điều kiện in vivo (bảng 4). Trong số đó, cây con của các giống Monarch, Nantes Improved, Tam Tam và Vilmorn lần lượt là 19.8%, 34.5%, 23.5% và 22.2%. Có thể thấy rằng giống Nantes Improved là giống thích hợp cho các thí nghiệm nuôi cấy mô về sau. 74% cây con được tái sinh từ phôi cho thấy rằng sử dụng 2,4-D và kinetin đem lại hiệu quả tái sinh thông qua phôi đối với thí nghiệm nuôi cấy mô cà rốt.

KẾT LUẬN

Sử dụng 2,4-D với nồng độ là 0,2 mg/L mang lại hiệu quả tốt nhất cho sự khởi sinh và phát triển mô sẹo trong nuôi cấy mô cà rốt. Nồng độ cao 2,4-D làm tăng tốc độ tăng trưởng mô sẹo nhưng làm giảm khả năng phát sinh hình thái.
BAP được sử dụng ở nồng độ 1 mg/L ảnh hưởng trực tiếp đến phát sinh hình thái nhưng kinetin được sử dụng với nồng độ 0,1 mg/L cho phát sinh phôi và tái sinh cây con từ phôi.
Thuận tiện nhất cho tái sinh in vitro cà rốt là sử dụng 2,4-D 0,2 mg/L để khởi sinh mô sẹo và sử dụng kinetin 0,1 mg/L ở giai đoạn kế tiếp để phát sinh phôi và tạo cây có thể sống được.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Keramat RABIEI1, Aleksey POLYAKOV2, Mahmood KHODAMBASHI1,
Olga SHARAFOVA2, Elena KALASHNIKOVA3, Saadollah HOOSHMAN1, Mansour OMIDI4
1Đại học Shahrekord, Shahrekord, Iran,
2All Russian Research Institute of Vegetable Crops RAAS, Vereja, Ramenskydistrict, Moscow region, Russia
3Đại học Russian State Agrarian – MSXA đặt theo tên K.A. Timiriazev
4Đại học Tehran University, Iran
Đã nhận: 31/01/2010; Chấp nhận đăng: 25/08/2010
Anderson J.O. 1976. Embryogenesis in wild carrot cells. In Vitro 12: 332.
Chand S., Roy S.C. 1981. Induction of organogenesis in callus cultures of Nigella sativa L. Ann. Bot. 48: 1-4.
De Vries S.C., Booij H., Meyerink P., Huisman G., Wilde D.H., Thomas T.L., Van Kamen A. 1988. Acquisition of embryogenic potential in carrot cell-suspension culture. Planta 176: 196-204.
Dinghou L. 1994. Some regulations of somatic embryogenesis and organogenesis in indica rice. Journal of Tropical and Subtropical Botany 2: 70-78.
Drew R. 1996. Clonal propagation of neem by tissue culture. pp. 999-1005. In: Neem and environment (Sing R.P., Chari M.S., Raheja A.K., Kraus W. ed.) (2) Science Publishers, Inc., Lebanon, New Hampshire.
Edwin F.G., Micheal A.H., Geert-Jan D.K. 2008. Plant propagation by tissue culture. 3rd Edition, Volume 1, The Background. Springer, Netherland. Fries N. 1960. The effect of adenine and kinetin on growth and differentiation of Lupinus. Physiol. Plant 13: 468-481.
Fujimura T., Komamine A. 1979. Involvement of endogenous auxin in somatic embryogenesis in a carrot cell suspension culture. Z. Pflanzenphysiol 95: 13-19.
Gupta S., Sen B., Bhattacharya S. 1987. Embryogenesis and differentiation in two species of Trigonella. Phytomorph. 37: 95-101
Halperin W., Wetherell D.F. 1964. Adventive embryony in tissue cultures of the wild carrot (Daucus carota L). Am. J. Bot. 51: 274-283.
Kalashnikova E.A. 2003. Cell selection of plants on resistance to fungous diseases. Authoref. of the doctor thesis. Moscow: 50.
Komamine A., Matsumoto M., Tsukahara M., Fujiwara A., Kawahara R., Ito M., Smith J., Nomura K., Fujimura T. 1990. Mechanism of somatic embryogenesis in cell cultures – physiology, biochemistry and molecular biology. In Nijkamp et al. (eds.): 307-313.
Konwar B.K., Coutts R.H.A. 1990. Rapid regeneration of sugar beet (Beta vulgaris L.) plants from in vitro cultures. In Nijkamp et al. (eds.).: 114-118.
Masuda K., Kikuta Y., Okazava Y. 1981. A revision of the medium for somatic embryogenesis in carrot suspension culture. J. Fac. Agr. Hokkaido Univ. 60: 183-193.
Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497.
Nemeth G. 1979. Benzyladeninestimulated rooting in fruit-tree rootstocks cultured in vitro. Z. Pflanzenphysiol 95: 389-396.
Nirmalakumari A., Ramaswamy N., Sree Rangaswamy S. 1993. Tissue culture studies in neem (Azadirachta indica A. Juss). pp. 981-992. In: Proceedings of World Neem Conference 24th-28th February 1993, Bangalore, India.
Nuti Ronchi V., Caligo M.A., Nozzolini M., Lussarini G. 1984. Stimulation of carrot somatic embryogenesis by proline and serine. Plant Cell Rep. 3: 210-214.
Oggema J.N., Kinyua M.G., Ouma J.P. 2007. Optimum 2,4-D concentration suitable for embryogenic callus induction in local Kenyan sweet potato cultivars. Asian Journal of Plant Sciences 6 (3): 484-489
Osifo F.O. 1988. Somatic embryogenesis in Dioscorea. J. Plant Physiol 133: 378-380.
Polyakov A.V. 2005. Regenerant obtaining of vegetable crops and its propagation in vitro. Methodical recommendation. Moscow: RAAS: 27. Polyakov A.V., Chikrizova O.F. 2009. Cell selection of carrot (Daucus carota L.) on resistanse to biotic stresses. Research papers on vegetable crop production. Moscow: ARRIVC: 484-488.
Radhakrishnan T., Murthy T.G.K., Chandran K., Banyopadhyay A. 2001. Somatic embryogenesis in Arachis hypogaea. Aust. J. Bot. 49: 753-759.
Radojevic L. 1988. Plant regeneration of Aesculus hippocastanum L. (Horse Chestnut) through somatic embryogenesis. J. Plant Physiol 132: 322-326.
Ribnicky D.M., Ilic N., Cohen J.D., Cooke T.J. 1996. The effects of exogenous auxins on endogenous indole-3-acetic acid metabolism – The implications for carrot somatic embryogenesis. Plant Physiol. 112: 549-558.
Satoh S, Kamada H., Harada H., Fujii T. 1986. Auxin-controlled glycoprotein release into the medium of embryogenic carrot cells. Plant Physiol. 81: 931-933.
Sharp W.R., Sondahl M.R., Caldas L.S., Maraffa S.B. 1980. The physiology of in vitro asexual embryogenesis. Hort. Rev. 2: 268-310.
Sharry S., Cabrera Ponce J.L., Estrella L. H., Rangel Cano R. M., Lede S., Abedini W. 2006. An alternative pathway for plant in vitro regeneration of chinaberry tree Melia azedarach L. derived from the induction of somatic embryogenesis. Electronic Journal of Biotechnology 9(3) Special Issue.
Silvertand B., Rooyen A., Van Lavrjsen P., Harlem A. M., Van Jacobsen E. 1996. Plant regeneration via organogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures derived from mature zygotic embryos of leek (Allium ampeloprassum L.). Euphytica 71: 261-270.
Tukavin G.B., Shmikova N.A. 2000. Mothodical recommendations on double haploid production by androgenesis method. Moscow: Academy of agricultural sciences: 56

Khải Mùi
SBC Scientific

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *