Các gRNA được thiết kế đặc hiệu để xác định vị trí chèn hoặc loại bỏ sẽ xảy ra. Khi gRNA và Cas9 được biểu hiện trong các tế bào mục tiêu, các gRNA sẽ điều khiển Cas9 liên kết với trình tự mục tiêu và cắt DNA tại vị trí nhận biết-đặc tính chuyên biệt của các endonuclease. Tế bào có thể sửa chữa tại vị trí cắt với những đoạn trung gian không tương đồng như NHEJ hoặc tương đồng HDR.