TÁI SINH CÂY IN VITRO TỪ LÁ MẦM LOÀI ỚT NAGA KING Capsicum chinense Jacq

Việc tái sinh cây in vitro từ lá mầm của loài ớt Naga King Capsicum chinense Jacq., một loài ớt rất cay ở Ấn Độ. Cấu trúc rosette (RLS) thu được trên mẫu vật khi chuyền vào môi trường có chứa indol-3-acetic acid (IAA) đã tạo được nhiều chồi theo thời gian. Môi trường MS cơ bản có agar bổ sung 18.16 µM thidiazuron (TDZ) là môi trường tốt nhất để cảm ứng tạo thành RLS và chồi.

Số lượng nhiều nhất của chồi được nhân lên là 9,5 ± 0,39, của rễ là 8,6 ± 0,50, độ dài rễ 2,4 ± 0,02 cm. Môi trường có chứa 5,70 µM IAA tạo ra được các dạng cấu trúc hình hoa thị. Kết hợp của Putrescine (Put) (5,6 µM) và TDZ (4,54 µM) có ảnh hưởng trực tiếp đến sự nhân chồi (5,8 ± 0,44). Cây con đã cho ra rễ in vitro được chuyển sang nhà kính để thuần dưỡng cho cứng cáp và thích nghi với môi trường, 90% cây có thể sống được. Cây sau khi đã cứng cáp được đem trồng ra đất, cho quả bình thường sau 4 tháng trồng. Hàm lượng capsaicin trong quả chín của cây ớt được nhân giống in vitro là 0,05236 g/g (theo khối lượng khô) (837.760 đơn vị cay Scoville, SHU), trong khi đó cây trồng trong điều kiện in vivo có hàm lượng là 0,0545 g/g – theo khối lượng khô (872.000 SHU).

1.GIỚI THIỆU

Capsicum chinense Jacq. là một loại cây trồng quan trọng thuộc họ Solanaceace, có nguồn gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, nhất là ở Nagaland (Bhagowati và Changkija, 2001). Loài này nhận được sự quan tâm của cộng đồng khoa học thế giới do có tính cực cay 1.001.304 SHU và hương thơm độc đáo. Nó được gọi với các tên khác nhau như ‘Bhoot jolokia’ hoặc ‘Bih jolokia’ ở Assam, “Ớt Naga King” ở Nagaland, ‘Umorok’ ở Manipur và ‘Ghost pepper’ theo truyền thông phương Tây. Nó cũng được biết với các tên ‘Saga jolokia’, ‘Indian mystery chili’ và ‘Indian rough chili’ (Meghvansia và cộng sự, 2010). C. chinense được biết đến là loài ớt cay nhất thế giới (Guinness World Records, 2006). C. chinense, đây là loài tự thụ phấn, tuy nhiên khả năng thụ phấn chéo diễn ra cao dẫn đến hình thành nhiều biến dị trong loài (Kehie và cộng sự, 2012). Ớt được sử dụng trên thế giới để làm thức ăn. Đây là một phần không thể thiếu được trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp chăn nuôi gia cầm …Vị cay của ớt là do chất “capsaicinoid” tạo nên. Trong tự nhiên, “capsaicin” và “dihydrocapsaicin” chiếm 90% hàm lượng “capsaicinoid” tổng trong quả ớt (Suzuki và cộng sự., 1981). Nhân giống ớt theo phương pháp truyền thống bị hạn chế do thời gian sống ngắn và tỉ lệ nảy mầm của hạt thấp. Việc sản xuất ớt chịu ảnh hưởng của các yếu tố sinh học và phi sinh học, dẫn đến giảm chất lượng và năng suất (Nuez và cộng sự, 1996). Vì cây ớt khó nhân giống trong tự nhiên nên việc tìm ra một phương pháp công nghệ sinh học thay thế để tăng năng suất của thành viên họ Solanaceous này là rất cần thiết. Việc thiết lập một quy trình hiệu quả và đầy hứa hẹn cho tái sinh in vitro loài C. chinense là cần thiết cho việc áp dụng các công cụ công nghệ sinh học hiện đại trong sinh sản vô tính những quần thể có đặc tính ưu việt, phục hồi các biến thể dòng soma, bảo tồn nguồn gen và sản xuất cây chuyển gen có các đặc tính nông nghiệp cải tiến, cây lai và cây đơn bội plants (Ezura, 1997; Aguado-Santacruz và cộng sự, 2004). Một số nghiên cứu tái sinh in vitro chi Capsicum thông qua các quy trình và các cách phát sinh hình thái khác nhau, được ghi nhận trong nghiên cứu của Subhas và Christopher, 1988; Agrawal và cộng sự, 1989; Wang và cộng sự, 1991; Szasz và cộng sự,1995; Ramirez-Malagon và Ochoa-Alejo, 1996; Husain và cộng sự 1999; Reddy và cộng sự, 2002; Venkataiah và cộng sự, 2003; Khan và cộng sự, 2006; Sanatombi và Sharma, 2008a. Hầu hết các nghiên cứu đều tiến hành trên Capsicum annum và Capsicum frutescens, chỉ có một báo cáo duy nhất về C. chinense có sử dụng mẫu vật nuôi cấy là lá mầm (Sanatombi và Sharma, 2008b). TDZ là một phenyl urea, ban đầu được phát triển như chất làm rụng lá cây bông, nhưng đã trở thành một chất điều hòa sinh trưởng thực vật có hiệu quả cho việc nhân giống in vitro các loại cây trồng (Fiola và cộng sự, 1990; Hutchinson và cộng sự, 1996). Polyamines (PAs), putrescine (Put), spermidine và spermine đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và phân chia của tế bào nhân sơ và nhân thực. Hợp chất diamine, putrescine có vai trò quan trọng bởi vì nó hoạt động như là tiền chất của các polyamine khác (Evans và Malmberg, 1989). Ảnh hưởng của polyamine các quá trình phát triển được ghi nhận trong các nghiên cứu sau đây Fierer và cộng sự, 1984; Gerats và cộng sự, 1988; Bais và cộng sự, 2000; Parimalan và cộng sự, 2011. Theo sự hiểu biết của chúng tôi, chưa có nghiên cứu về ảnh hưởng của TDZ và Put lên mẫu vật lá mầm của C. chinense. Lá mầm được lựa chọn làm mẫu vật để tạo chồi bất định bởi vì có đáp ứng tốt với các xử lý để tái sinh cây in vitro, sự tái sinh thường gặp bao gồm cả chồi chưa hình thành rõ ràng, cấu trúc giống lá hoặc chồi, nhưng không thể dài ra và hiếm khi phát triển thành chồi hoàn chỉnh (Arroyo và Revilla, 1991; Mathew, 2002; Mezghani và cộng sự, 2007). Capsicum là cây khó nhân giống in vitro tế bào, mô và biệt hóa cơ quan (Kothari và cộng sự, 2010). Rất khó để đưa ra quy trình hiệu quả, đáng tin cậy và phù hợp cho tất cả các thành viên trong chi này. Bởi vì, theo như chúng tôi biết, không có bất cứ báo cáo nào về việc định lượng capsaicin trong quả của cây C. chinense nhân giống in vi tro. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là là phát triển quy trình hiệu quả để tái sinh in vitro C. chinense từ lá mầm, và so sánh hàm lượng capsaicin trong quả của cây nhân giống in vitro với cây in vivo.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Hạt của cây C. chinense được thu từ các cánh đồng địa phương tại làng Rüziephema, Nagaland, Ấn Độ. Hạt được sửa sạch bằng nước máy, rồi đem xử lý với 2% Labolene (v/v) khoảng 10 phút và rửa lại 5 lần với nước cất. Khử trùng bề mặt với 0,1 % HgCl2 (Himedia), khoảng 5 phút, rồi rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng. Hạt vô trùng được cấy lên môi trường MS chứa 3% (w/v) sucrose và 0,8% (w/v) (Himedia), chỉnh pH về 5,8. Lá mầm được cắt ra từ hạt đã nảy mầm được 2 tuần tuổi và đặt sao cho mặt dưới lá tiếp xúc với môi trường. Môi trường tạo chồi (20 mL MS trong ống nghiệm 55 mL, 25 mm đường kính ngoài, 150 mm chiều dài) có bổ sung riêng lẻ các chất 6-benzyl aminopurine, BAP (4,18–66,88 µM) hoặc thidiazuron, TDZ (2,27–36,32 µM), hoặc kết hợp với putrescine, Put (1,13–11,3 µM). Tất cả các môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,05 kg cm-2 khoảng 15 phút. Nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng 25 ±2oC, chu kì quang 14/10 giờ, độ sáng 62,2 µmol m−2 s−1 bởi đèn huỳnh quanh màu lạnh. Các cấu trúc rosette (RLS) và chồi sinh ra từ môi trường cảm ứng tạo chồi được chuyển sang môi trường MS có chứa indole-3-acetic acid, IAA (2.8, 5.7 và 11.4 µM) để cho ra rễ. Sau 4 tuần cấy chuyền, số lượng chồi, rễ và độ dài rễ được ghi nhận lại. Các cây con tái sinh được chuyền sang môi trường MS để sinh trưởng và phát triển. Các chồi ra rễ được lấy ra và rửa sạch với nước cất để loại bỏ môi trường. Cây con đã có hệ rễ phát triển sau khi tiếp xúc với IAA (2,8; 5,7 và 11,4 µM) được trồng vào chậu chứa đất và phân chuồng (tỉ lệ 3:1), và tưới nước mỗi ngày trong nhà kính. Cây con được trồng trong điều kiện nhiệt độ 25 ±2oC, độ ẩm tương đối 80%, ánh sáng 100 µmol m−2 s−1 và thời gian sáng mỗi ngày là 12 giờ. Tỉ lệ sống sót trung bình được tính toán sau 4 tuần thích nghi. Cuối cùng, những cây cứng cáp được chuyển ra trồng trong chậu đất.

2.1 Phân tích thống kê

Tất cả các thí nghiệm được lập lại 3 lần với 6 lần lần lặp lại cho mỗi mẫu vật hoặc ống nghiệm nuôi cấy, và dữ liệu được phân tích sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) bằng phần mềm JMP® phiên bản 7.0.1. Sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị trung bình, được đánh giá bằng Tukey’s test ở mức xác suất 5%.

2.2 Tách chiết capsaicinoid

Quả ớt chín được thu từ 20 cây khỏe mạnh có nguồn gốc từ cây in vitro và in vivo, tiến hành tách lấy chất capsaicinoid. Quả được đồng nhất trong methanol (1:10, w/v) và lọc qua giấy lọc Whatman paper No.1 trên Na2SO4 khan. Dịch chiết được làm bay hơi đến khô trong chân không, phần còn lại sau khi khô được hòa với 10 mL acetonitrile. Mẫu được ly tâm 14.000 vòng/phút khoảng 10 phút và lọc qua màng lọc Millipore FH (0.45 µm) trước khi tiêm vào hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

2.3 Phân tích sắc kí lỏng

Phân tích sắc kí HPLC được thực hiện bằng máy Shimadzu LC System với cột C18, supercosilTM 516 (250 mm × 4.6 mm), 5 µm. Pha động bao gồm hỗn hợp acetonitrile (CH3CN) trong nước theo tỉ lệ 50:50 với pH 3.0 (chỉnh bằng acetic acid). Xác định tại bước sóng 280 nm, tốc độ dòng duy trì ở mức 1 mL/phút. Tất cả thuốc thử được sử dụng là loại dành cho HPLC. Capsaicin và Dihydrocapsaicin (Sigma) được sử dụng làm chất chuẩn. Dung dịch chuẩn được chuẩn bị trong dãy nồng độ từ 2-10 µg, được tiêm vào để làm đường chuẩn để xác định peak. Mẫu thử (10 µL) được tiêm vào và tách nhau trong cùng điều kiện HPLC.

2.4 Định lượng Capsaicinoid

Capsaicin and dihydrocapsaicin được xác định bằng cách sử dụng dãy chuẩn được tiêm vào ở cùng điều kiện. Việc xác định chất nào dựa vào thời gian lưu được đo cùng điều kiện HPLC, trong khi đó định lượng chúng trong các mẫu khác nhau được tiến hành trên vùng peak sắc kí.

2.5 Chuyển đổi đơn vị cay Scoville

Nồng độ Capsaicinoid được chuyển đổi thành đơn vị cay Scoville (SHU), bằng cách nhân khối lượng ớt khô (g/g) với hệ số tương quan với giá trị độ cay capsaicin chuẩn là 1.6 × 107 (Othman và cộng sự,2011).

3. KẾT QUẢ

3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự tái tạo chồi

Mảnh lá mầm được nuôi trên môi trường MS bổ sung chỉ riêng cytokinin (BAP hoặc TDZ), bị phồng lên ở cuối vết cắt. Sau khi phồng lên, BLS và GLS phát triển thành RLS trong khoảng thời gian 3-5 tuần nuôi cấy (Hình 1A-F). Khi BLS và GLS được tách ra và nuôi trên cùng môi trường, đều không thấy hoạt động phát sinh cơ quan. Mặc dù có sự kéo dài chồi trong môi trường tạo chồi hoặc chứa 18,16 µM TDZ (với 3 ± 0,57 chồi dài ra), hoặc 16,72 µM BAP (với 2 ±0,75 chồi dài ra), nhưng đây là mức độ thấp. Tuy nhiên, giới hạn này được phá vỡ khi RLS được cấy chuyền vào môi trường chứa lần lượt 2,8; 5,7 và 11,4 µ IAA, đã làm tăng sự phát triển chồi và rễ (hình 1G). BLS được tạo thành tốt nhất trong nôi trường MS chứa hoặc 35,52 µM BAP hoặc 18,16 µM TDZ (Hình 1A). Tương tự, tỉ lệ GLS cao nhất được thấy ở môi trường có 17,76 µM BAP hoặc 9,08 µM TDZ (hình 1D). Việc xác định chính xác số lượng BLS và GLS là rất khó bởi vì các cấu trúc phát sinh cơ quan thì dính lại với nhau. RLS được phát triển thông qua GLS và BLS. Sự phát triển RLS hiệu quả nhất trong môi trường chứa 18,16 µM TDZ hoặc 33,44 µM BAP, 2-3 chồi phát triển sau 6 tuần nuôi cấy (hình 1C). Quá trình hình thành nhiều chồi mới diễn ra khi RLS được chuyền vào môi trường chứa 5,7 µM IAA (hình 1G). Thông tin về số lượng chồi lớn nhất (9,5 ± 0,39), rễ (8,6 ± 0,50) và độ dài rễ (2,4 ± 0,02 cm) được ghi nhận sau 4 tuần (Bảng 1)

3.2 Ảnh hưởng kết hợp giữa cytokinin và polyamine lên sự tái sinh chồi

Sử dụng polyamine trong nuôi cấy mô nhằm tăng cường khả năng tái sinh thực vật, đã gia tăng trong những năm gần đây. Trong nghiên cứu này cho thấy sự kết hợp giữa cytokine (BAP hoặc TDZ) và polyamine (Put) có ảnh hưởng ở những mức độ khác nhau. Sự trương phồng lên của tế bào đã diễn ra trong suốt giai đoạn nuôi cấy ban đầu, và hình thành nên cấu trúc rosette và tạo ra nhiều chồi (hình 1 H-K). Ảnh hưởng mạnh nhất lên sự khởi phát chồi (5,8 ± 0,44) diễn ra trên môi trường có TDZ (4,54 µM) và Put (5,6 µM) (hình 2). Khi nồng độ TDZ và Put cao hơn sẽ làm giảm sự tạo chồi, nhưng lại gia tăng hình thành RLS. Số lượng RLS nhiều nhất được quan sát thấy trong môi trường có TDZ 36,32 µM) và Put (1,13 µM). Khi bổ sung BAP (17,6 µM) và Put (11,3 µM) cũng ảnh hưởng đến nhân chồi, sau 6 tuần nuôi cấy có 3.4 ± 0.19 chồi hình thành (Hình 3). Khi nồng độ BAP thấp hơn kết hợp với Put sẽ làm cho tế bào trương phồng lên và không hình thành chồi, được thể hiện ở hình 1H. Chồi được tái sinh được chuyền vào môi trường chứa 5.7 µM IAA để cho ra rễ. Mặc dù cây khỏe và ra rễ tốt, nhưng không có sự phát sinh thêm chồi mới trong môi trường ra rễ.


Hình 1. Hình thành chồi bất định và tái sinh cây ở loài C. chinense (A) Cấu trúc như chồi (BLS) (thước ngang = 0,5 cm). (B) BLS hình thành cấu trúc rosette (RLS) (thước ngang = 0,5 cm). (C) RLS với vài chồi kéo dài (thước ngang = 0,5 cm). (D) Hình thành cấu trúc như hình cầu (GLS) (thước ngang = 0,5 cm). (E) Cụm GLS biến đổi thành RLS (thước ngang = 0,5 cm) (F) RLS với chồi dài ra nữa (thước ngang = 0,5 cm). (G) Sự phát triển nhiều chồi, kéo dài chồi và ra rễ trên cây (thước ngang = 1 cm). (H) Sự trương phồng lên của tế bào trong MS + 8,8 µM BAP and 5.6 µM Put (thước ngang = 1 cm). (I) Khởi phát hình thành cấu trúc hoa hồng trong môi trường MS + 36,32 µM TDZ + 1,13 µM Put (thước ngang = 1 cm). (J) Hình thành cấu trúc rosette trong MS+ 36,32 µM TDZ + 1,13 µM Put (thước ngang = 1 cm) (K) Sự hình thành nhiều chồi trong MS+ 36,32 µM TDZ + 1,13 µM Put (thước ngang = 1 cm) sau 6 tuần nuôi cấy. (L) Cây đã dài ra được chuyển sang môi trường MS cơ bản cho sinh trưởng và phát triển lâu hơn (thước ngang = 1 cm). (M) Cây tái sinh được dưỡng cứng cáp được trồng trong chậu chứa đất và phân bò (1:1)

Bảng 1 Các biểu hiện bất định của C. chinense từ mẫu vật lá mầm được nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung BAP, TDZ và IAA ở các nồng độ khác nhau

Môi trường khởi phát PGR (µM) Hình thành cấu trúc hoa hồng thông qua GLS và BLS sau 3 tuần Số lượng chồi dài ra sau 6 tuần MS + IAA (µM) Sau 4 tuần cấy chuyền
GLS BLS Hình thành of RLS Sau 5 tuần Số lượng chồi dài ra Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm)
Đối chứng
0,0
BAP 4,44 S S S 2,85
5,70
11,40
0,0
8,88 ++ + + 2,85
5,70
11,40
0,0
17,76 +++ ++ ++ 2,85 1,5 ± 0,55de 2,6 ± 0,24gh 0,4 ± 0,04l
5,70 2,0 ± 0,45de 5,2 ± 0,37def 2,0 ± 0,04bcd
11,40 1,3 ± 0,45e 6,6 ± 0,40bcde 0,5 ± 0,05kl
0,0 2,0 ± 0,57de
35,52 + +++ +++ 2,85 1,6 ± 0,45de 3,8 ± 0,37fgh 1,1 ± 0,05hi
2,0 ± 0,57a 5,70 5,2 ± 0,39bc 7,4 ± 0,24bcd 2,1 ± 0,05bcd
11,40 3,0 ± 0,45cde 10 ± 0,44a 1,0 ± 0,04ij
0,0 1,2 ± 0,25e
71,044 + ++ ++ 2,85 2,6 ± 0,45de 2,4 ± 0,24h 1,4 ± 0,04fg
1,2 ± 0,25a 5,70 3,2 ± 0,35de 5,2 ± 0,20def 2,0 ± 0,04bcd
11,40 1,5 ± 0,39e 7,6 ± 0,24bc 1,9 ± 0,08cde
0,0
TDZ 2,27 + + + 2,85
5,70
11,40
0,0
4,54 ++ + + 2,85 1,3 ± 0,45e 3,6 ± 0,24fgh 0,7 ± 0,03k
5,70 2,7 ± 0,39de  6,4 ± 0,24bcde 2,2 ± 0,06abc
11,40 1,5 ± 0,55de 5,2 ± 0,58def 1,2 ± 0,03ghi
0,0
9,08 +++ ++ ++ 2,85 1,6 ± 0,45de 2,4 ± 0,24h 1,0 ± 0,02ij
5,70 3,5 ± 0,55bcde 6,2 ± 0,73cde 2,2 ± 0,10ab
11,40 1,5 ± 0,55de 4,8 ± 0,96efg 1,6 ± 0,14ef
0,0 1,6 ± 0,25de
18,16 ++ +++ +++ 3,0 ± 0,57a 2,85 4,0 ± 0,55bcd 5,2 ± 00,58def 1,3 ± 0,05fgh
5,70 9,5 ± 0,39a 8,6 ± 0,50ab 2,4 ± 0,02a
11,40 6,0 ± 0,45b 10,2 ± 0,48a 1,2 ± 0,02ghi
0,0 1,6 ± 0,25de
36,32 + ++ ++ 1,6 ± 0,25a 2,85 2,2 ± 0,39de 2,2 ± 0,20h 0,7 ± 0,02fgh
5,70 4,0 ± 0,45bcd 5,2 ± 0,20def 1,8 ± 0,02a
11,40 2,0 ± 0,39de 8,6 ± 0,24ab 1,1 ± 0,02ghi

PGR: chất điều hòa sinh trưởng thực vật; GLS: cấu trúc như hình cầu; BLS: Cấu trúc như chồi; ≠ : không có biểu hiện; S: trương phồng lên; + : thấp; ++: trung bình; +++ : cao; Giá trị trung bình ± SE. Giá trị trung bình được theo sau bởi những chữ cái giống nhau thì không có khác biệt đáng kể, theo Turkey test HSD.

Hình 2. Ảnh hưởng của thidiazuron và putrescine lên sự khởi phát chồi từ lá mầm của Capsicum chinense Jacq. (Ớt Naga king) trong môi trường MS. Dữ liệu được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy. Kiểm định Tukey’s post-hoc cho thấy giá trị trung bình không khác biệt đáng kể giữa các nhóm, thể hiện qua các chữ cái giống nhau.

3.3 Cho cây tái sinh thích nghi với môi trường

Cây con đã ra rễ in vitro sau 4 tuần, có ít nhất 2 rế dài từ 0,4-2,4 cm được rửa cẩn thận bằng nước và chuyển ra chậu chứa hỗn hợp đất và phân chuồng trại (3:1). Cây có hệ rễ phát triển tốt thích hợp để chuyển sang giai đoạn làm cây cứng cáp. Điều này sẽ tạo điều kiện thuận lợi giúp cho cây phát triển mạnh mẽ. Khoảng 90% cây còn sống trong điều kiện nhà kính và tương tự nhau về hình thái. Tuy nhiên, bởi vì cây ra rễ ở các nồng độ IAA khác nhau được trồng chung với nhau, nên không thể xác định được ảnh hưởng của nồng độ auxin khác nhau lên quá trình thích nghi. Những cây cứng cáp được trồng ra đất và cho quả bình thường (Hình 1L và M).

3.4 Tách chiết, định danh và định lượng

Trong thí nghiệm này, việc xác định capsaicinoid sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC, bởi vì đây là phương pháp tách chiết có thời gian phân tích ngắn và hiệu quả cao, đơn giản, nhanh chóng và chính xác. Hiệu quả tách, định danh và định lượng capsaicinoid từ quả ớt chín có nguồn gốc in vitro và in vivo, bằng HPLC được thể hiện trong hình 4. Hàm lượng capsaicin trong ớt chín có nguồn gốc in vitro là 0,05236 g/g – tính theo khối lượng khô (837,760 SHU), trong khi đó hàm lượng này đối với ớt in vivo là 0,0545 g/g – tính theo khối lượng khô (872,000 SHU).

Hình 3. Ảnh hưởng của 6-benzylaminopurine và putrescine lên sự khởi phát chồi từ lá mầm của Capsicum chinense Jacq. (Ớt Naga king) trong môi trường MS. Dữ liệu được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy. Kiểm định Tukey’s post-hoc cho thấy giá trị trung bình không khác biệt đáng kể giữa các nhóm, thể hiện qua các chữ cái giống nhau. Cấu trúc rosette (+: thấp, ++ : trung bình; +++: cao), S = trương phồng

Hình 4. Sắc kí đồ sắc kí lỏng hiệu năng cao tại bước sóng 280 nm (A) Sắc kí đồ HPLC của capsaicin chuẩn (9,32 phút). (B) Đường chuẩn của capsaicin ở các nồng độ khác nhau. (C) Sắc kí đồ HPLC của dihydrocapsaicin (12,46 phút) (D) Đường chuẩn của dihycapsaicin ở các nồng độ khác nhau. (E) ) Capsaicin (9,32 phút) và Dihydrocapsaicin (12,43 phút) từ mẫu quả ớt nhân giống in vivo (F) Capsaicin (9,32 phút) và Dihydrocapsaicin (12,43 phút) từ mẫu quả ớt nhân giống in vivo.

4. THẢO LUẬN

Mặc dù cây ớt có tầm quan trọng trong kinh tế, nhưng hế thống tái sinh cây in vitro cho loài Capsicum không phát triển nhanh như những loài khác trong họ Solanacea. Trong trường hợp các thành viên của loài Capsicum, rất khó để tái ính được toàn bộ cây từ mẫu vật hoặc các mô khác (Ochoa-Alejo và Ramirez-Malagon, 2001).Việc tái sinh cây in vitro thông qua sự phát sinh cơ quan bất định ở loài Capsicum thì không mang lại thành công do tạo ra chồi không rõ rang, bị còi cọc, lá biến dạng theo kiểu hình thái của súp lơ trắng (Liu và cộng sự 1990). Tuy nhiên, trong những năm gần đây, đã có nhiều báo cáo nghiên cứu về các kiểu gen của ớt (Ochoa-Alejo và Ramirez-Malagon, 2001; Venkataiah và cộng sự, 2003; Kumar và cộng sự, 2005; Valera-Montero và Phillips, 2005; Golegaonkar và Kantharajah, 2006; Mezghani và cộng sự, 2007; Sanatombi và Sharma, 2008a; Valadez-Bustos và cộng sự, 2009). Trong nghiên cứu này, chúng tôi, chúng tôi nhận thấy RLS có tiềm năng tái sinh cây từ lá mầm thấp. Quan sát này của chúng tôi phù hợp với các kết luận ở trước đó (Ochoa-Alejo và Ramirez-Malagon, 2001). Tuy nhiên, nhược điểm không tăng thêm chồi mới của RLS đã được khắc phục khi chuyền RLS vào môi trường chứa 5,7 µM IAA. Các phát hiện này của chúng tôi cho thấy rằng sự kết hợp của cytokinin (BAP và TDZ) trong môi trường đem lại kết quả là kích thích các cấu trúc có thể phát sinh cơ quan. Vai trò đặc biệt quan trọng của cytokinin trong việc kích thích hình thành các cơ quan đã được ghi nhận trong nuôi cấy mô tế bào của nhiều loại ớt (Christopher và Rajam, 1996; Venkataiah và Subhash, 2001). Trong nghiên cứu này, RLS cảm ứng tốt nhất trong môi trường chỉ bổ sung 18,16 µM TDZ. Cấu trúc này được chuyển sang môi trường chứa 5,7 µM IAA để tạo ra nhiều chồi, Ảnh hưởng của liều lượng thấp (1,0 µM TDZ) lên cảm ứng nhân chồi từ phần đốt của C. annuum đã được đưa ra trong các báo cáo trước đây (Ahmad và cộng sự, 2006), nhưng trong nghiên cứu này của chúng tôi với C. chinense, khi liều lượng TDZ cao hơn thì có ưu thế tạo ra các cấu trúc rosette từ lá mầm hơn. TDZ là chất điều hòa sinh trưởng tiềm năng, thể hiện vai trò của cytokinin trong hệ thống nuôi cấy bao gồm cả tạo cơ quan và tạo phôi vô tính đối với vài loài thực vật (Manoharan và cộng sự, 1998; Dolendro và cộng sự, 2003; Venkataiah và cộng sự, 2003; Ahmad và cộng sự, 2006). Hiệu quả của BAP trong việc khởi phát cấu trúc rosette cũng được quan sát trong nghiên cứu này. Khi chỉ có BAP, điều kiện tốt nhất cho khởi phát cấu trúc rosette là môi trường chứa 33,44 µM BAP. Mặc dù vài chồi (3,0 ± 0,57) có dài ra thêm trong môi trường chứa 18,16 µM TDZ hoặc 33,44 µM BAP, nhưng con số này vẫn thấp đáng kể. Số lượng chồi nhân lên nhiều chỉ sau khi chuyển sang môi trường có 5,7 µM IAA. Khi Put kết hợp với BAP hoặc TDZ trong môi trường, sẽ nhân nhiều chồi. Xử lý Put trong vài thí nghiệm cho thấy đã thúc đẩy chồi nhân lên (Chi và Pua, 1989). Khi kết hợp TDZ hoặc BAP với Put sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự khởi phát chồi. Sự hiện diện của polyamine trong môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự nhân chồi ở cây bông vải, theo Ganesan và Jayabalan (2006). Tác dụng tăng cường của polyamine lên sự khởi phát nụ chồi là do chúng kích thích lên sự phân chia tế bào và hoặc ức chế sự sản sinh ethylene, theo Bais và cộng sự, (2000). Mặc dù chồi có nhân lên (5,8 ±0,44) trong môi trường chứa 4,54 µM TDZ và 5,6 µM Put, nhưng số lượng chồi vẫn thấp đáng kể, khi chuyền những chồi này sang môi trường chứa 5,7 µM IAA vẫn không phát triển thêm nụ chồi mới.

Capsaicinoid được tổng hợp trong tế bào biểu bì của quả loài Capsicum được tích tụ trong các vết phồng trên biểu bì (Suzuki và cộng sự, 1980), Khi quả chín, hàm lượng capsaicinoid đạt đến mức cao nhất. Độ cay phụ thuộc vào nhiều yếu tố chẳng hạn như giai đoạn phát triển của quả và điều kiện môi trường sinh trưởng (Lindsey và Bosland, 1995; Estrada và cộng sự, 1998; Zewdie và Bosland, 2000). Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhạn thấy hàm lượng capsaicinoid của quả C. chinense chín của cây in vivo cao hơn cây in vitro; tuy nhiên, sự khác biệt này rất nhỏ. Nói chung, sự tích tụ các chất chuyển hóa thứ cấp của cây in vitro được biết là thấp hơn so với cây in vivo.

Nghiên cứu này cho thấy trong hai kiểu biểu hiện, BLS có tần suất tạo cấu trúc rosette cao hơn và cho kết quả tối ưu trong hình thành chồi hơn là GLS. Môi trường có Put, có ảnh hưởng trực tiếp đến sự khởi phát chồi hơn là tạo ra các cấu trúc rosette; tuy nhiên mức độ tạo chồi thấp hơn. Cây tái sinh sống tốt trong nhà kính. Xác định độ cay bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC cho thấy quả ớt nhân giống in vitro có vị cay như ớt in vivo. Điều này có nghĩa là nhân giống in vivo hiệu quả hơn nhân giống truyền thống mà vẫn giữ được chất lượng của quả. Vì vậy, việc thiết lập một quy trình đầy hứa hiện cho tái sinh hiệu các mảnh lá mầm của loài C. chinense là rất hữu ích để tạo ra các biến thể dòng soma, nhân giống quy mô lớn các kiểu gen riêng biệt, bảo tồn và thực hiện các thao tác di truyền đối với loài này.

Lời cảm ơn

Mechuselie Kehie gửi lời cảm ơn đến Ủy ban tài trợ đại học Grant Commission (UGC) đã tặng học bổng cho ông Rajiv Gandhi. Ông cũng cảm ơn Tiến sĩ Dr. G.A. Ravishankar, ông H.B, Gururaj và cô P.M. Naveenchandra của Viên nghiên cứu trung tâm công nghệ thực phẩm Mysore (CFTRI), vì đã giúp đỡ để hoàn thành thành công nghiên cứu này,

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Agrawal, S., Chandra, N., Kothari, S.L., 1989. Plant regeneration in tissue cultures of pepper (Capsicum annum L. cv Mathania). Plant Cell Tiss. Organ Cult. 16, 47–55. Aguado-Santacruz, G.A., Martínez-Castillo, A., Moreno-Gómez, B., Pen˜a- Mosqueda, D., 2004. Cultivo de tejidos vegetales. In: Aguado-Santacruz, G.A. (Ed.), XVI Jornada de ingeniería bioquímica. INIFAP, Unidad de Biotecnología-Instituto
Tecnológico de Celaya, Celaya, Gto. Mex, p. 55.
Ahmad, N., Siddique, I., Anis, M., 2006. Improved plant regeneration in Capsicum annum L. from nodal segments. Biol. Plant. 50, 701–704.
Arroyo, R., Revilla, M.A., 1991. In vitro plant regeneration from cotyledon and hypocotyls segments in two bell pepper cultivar. Plant Cell Rep. 10, 414–416.
Bais, H.P., Sudha, G.S., Ravishankar, G.A., 2000. Putrescine and silver nitrate influences shoot multiplication, in vitro flowering and endogenous titers of polyamines in Chichorium intybus L. cv. Lucknow Local. J. Plant Growth Regul. 19, 238–248.
Bhagowati, R.R., Changkija, S., 2001. Genetic variability and traditional practices in Naga King Chili landraces of Nagaland. Asian Agri.-Hist. 13, 171–180.
Chi, C.L., Pua, E.C., 1989. Ethylene inhibitor enhanced de novo shoot regeneration from cotyledons of B. campestris spp chinesis (Chinese cabbage) in vitro. Plant Sci. 64, 243–250.
Christopher, T., Rajam, M.V., 1996. Effect of genotype, explant and medium on in vitro regeneration of red pepper. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 46, 245–250.
Dolendro, S.N., Sahoo, L., Bhalla, S.N., Jaiwal, P.K., 2003. The effect of TDZ on organo- genesis and somatic embryogenesis in pigeon pea (Cajanus cajan L Mill sp). Plant Sci. 164, 341–347.
Estrada, B., Pomar, F., Dıjaz, J., Merino, F., Bernal, M.A., 1998. Effects of mineral fertil-
izer supplementation on fruits development and pungency in “Padrojn” peppers.
J. Hortic. Sci. Biotechnol. 73, 493–497.
Evans, P.T., Malmberg, R.L., 1989. Do polyamines have a role in plant development?
Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 40, 235–269.
Ezura, H., 1997. Micropropagation of Capsicum species (pepper). In: Bajaj, Y.P.S. (Ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry High-tech and Micropropagation, vol.
39. Springer, Heidelberg, pp. 48–59.
Fierer, R.P., Mignon, G., Litvay, J.D., 1984. Arginine decarboxylase and polyamine required for embryogenesis in wild carrot. Sci. 223, 1433–1435.
Fiola, J.A., Hassan, M.A., Swartz, H.J., Bors, R.H., Mcnicol, R., 1990. Effect of thidi- azuron, light fluency rates and kanamycin on in vitro shoot organogenesis from excised rubus cotyledons and leaves. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 20, 223–228.
Ganesan, M., Jayabalan, N., 2006. Influence of cytokinins, auxins and polyamines on in vitro mass multiplication of cotton (Gossypium hirsutum L. cv. SVPR2). Indian J. Exp. Biol. 44, 506–513.
Gerats, A.G.M., Keye, C., Collins, C., Malmberg, R.L., 1988. Polyamine level in Petunia genotypes with normal and abnormal floral morphologies. Plant Physiol. 86, 390–393.
Golegaonkar, P.G., Kantharajah, A.S., 2006. High-frequency adventitious shoot bud induction and shoot elongation of chili pepper (Capsicum annuum L.). In Vitro Dev. Biol. Plant 42, 341–344.
Guinness Book of World Records, 2006. Hottest Spice. www. guinnessworldrecords.com
Husain, S., Jain, A., Kothari, S., 1999. Phenylacetic acid improves bud elongation and in vitro plant regeneration efficiency in Capsicum annum L. Plant Cell Rep. 19, 64–68.
Hutchinson, M.J., Murch, S.J., Saxena, P.K., 1996. Morphoregulatory role of thidazuron: evidence of the involvement of endogenous auxin in thidiazuron- induced somatic embryogenesis of geranium (Perlargonium hortorum Baile).
J. Plant Physiol. 149, 573–579.
Kehie, M., Kumaria, S., Tandon, P., 2012. In vitro plantlet regeneration from nodal segments and shoot tips of Capsicum chinense Jacq. cv. Naga King Chili. 3 Biotech. 2, 31–35.
Khan, H., Siddique, I., Anis, M., 2006. Thidiazuron induced somatic embryogenesis and plant regeneration in Capsicum annum. Biol. Plant. 50, 789–792.
Kothari, S.L., Joshi, A., Kachhwaha, S., Ochoa-Alejo, N., 2010. A review on tissue culture and trangenesis. Biotechnol. Adv. 28, 35–48.
Kumar, V., Gururaj, H.B., Narasimha, Prasad, B.C., Giridhar, P., Ravishankar, G.A., 2005. Direct shoot organogenesis on shoot apex from seedling explants of Capsicum annuum L. Sci. Hortic.-Amsterdam 106, 237–246.
Lindsey, K., Bosland, P.W., 1995. A field study of environmental interaction on pun- gency. Capsicum Eggplant Newsl. 14, 36–38.
Liu, W., Parrott, W.A., Hildebrand, D.F., Cillins, G.B., Williams, E.G., 1990. Agrobac- terium induced gall formation in bell pepper (Capsicum annum L.) and formation of shoot like structure expressing introduced genes. Plant Cell Rep. 9, 360–364.
Manoharan, M., Sree Vidya, C.S., Lakshmi Sita, G., 1998. Agrobacterium-mediated genetic transformation in hot chili (Capsicum annuum L. var Pusa jwala). Plant Sci. 131, 77–83.
Mathew, D., 2002. In vitro shoot and root morphogenesis from cotyledon and hypocotyl explants of hot pepper cultivars Byadagi Dabbi and Arka Lohit. Cap- sicum Eggplant Newsl. 21, 69–72.
Meghvansia, M.K., Siddiquib, S., Haneef khana, M.D., Gupta, V.K., Vairalea, M.G., Gogoia, H.K., Singh, L., 2010. Naga chilli: a potential source of capsaicinoids with broad-spectrum ethnopharmacological applications. J. Ethnopharm. 132, 1–14. Mezghani, N., Jemmali, A., Elloumi, N., Gargouri-Bouzid, R., Kintzios, S., 2007. Mor- phohistological study on shoot bud regeneration in cotyledon cultures of pepper
(Capsicum annuum). Biol. Bratislava 62, 704–710.
Murashige, T., Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473–497.
Nuez, F., Gil-Ortega, R., Costa, J., 1996. El cultivo de pimientos, chiles y ajies. Mundi- Prensa, Mexico D.F., pp. p607.

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *