Tái sinh in vitro loài Drosera burmannii : một loài thực vật ăn thịt ở đông bắc Ấn Độ

Tóm tắt
Một phương pháp tái sinh protocol in vitro hiệu quả được phát triển từ các bộ phận rất nhỏ của đỉnh chồi (shoot-tip) loài Drosera burmannii, một loài cây ăn thịt ở phía đông bắc Ấn Độ.

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau đã được sử dụng để nghiên cứu hiệu quả của chúng trong việc tạo ra nhiều chồi và rễ. Trong số các phương pháp thử nghiệm khác nhau, số lượng chồi tối đa (28,8 ± 1,5) và rễ (9,7 ± 0,6) đã được quan sát trong điều kiện liều lượng ¼ môi trường tiêu chuẩn (one-fourth strength standard medium) (MS với axit citric 50 mg/l và axit ascorbic 10 mg/l) bổ sung thêm 4 mg/l 6 benzylaminopurine (BAP) và 4 mg/l a-naphthalene acetic acid (NAA) và 26,8 ± 1,4 chồi trong ¼ SM được tăng cường với 4 mg/l kinetin (KN) và 4 mg/l NAA.

Những cây con (plantlets) có chồi và rễ phát triển tốt được trồng trong những chiếc cốc nhựa nhỏ chứa đầy hỗn hợp cát và phân chuồng (farmyard manure) (3:1); những cây con (plantlets) này khi được chuyển đến nhà kính để thích nghi cho thấy tỷ lệ sống sót là 90%.

Giới thiệu

Charles Darwin đã mô tả các loài cây ăn thịt như là “những cây tuyệt vời nhất trên thế giới”. Cây ăn thịt cho thấy một cách thích nghi mới lạ để tồn tại trong môi trường thiếu dinh dưỡng. Cho dù chúng đi theo những cách thích nghi khác nhau với nhiều mức độ phức tạp khác nhau, nhưng sau cùng chúng vẫn có cùng một mục đích. Chi Drosera thuộc họ Droseraceae thường được gọi cây gọng vó (sundew). Gọng vó được coi là bậc thầy của giấy dính/bắt ruồi do sự hiện diện của những tua dài trên lá, những chiếc tua hoạt động như một loài ăn thịt để bắt con mồi. Từ Drosera có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp là Drosero có nghĩa là ‘lấp lánh trong ánh mặt trời hoặc sương mù (phủ đầy sương)”. Có hơn 200 loài được biết đến thuộc chi này (McPherson 2010). Drosera burmannii Thường được tìm thấy trong đất cát có tính axit, còn gọi là gọng vó nhiệt đới (tropical sundew) hay gọng vó Miến Điện (urmese sundew), là một loài thực vật ăn thịt hàng năm (annual carnivorous plant). Nó là một loại thân thảo đứng (erect herb) với thân ngắn và rosette leaves (lá mọc thành cụm). Mỗi lá dài 8-10 mm và rộng 5-6 mm. Những bông hoa có màu trắng, phát sinh trên một vảy không có lá (leafless scape) dài khoảng 5-20 cm.

Cây phát triển đến chiều cao khoảng 5 cm. Vì bản chất ăn thịt và vẻ đẹp của những cái bẫy lấp lánh của chúng, Gọng vó đã trở thành cây cảnh yêu thích. D.burmannii phân bố ở Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Tây Phi và Úc (Nordbakken et al. 2004). Các hợp chất chính được tìm thấy trong D.burmannii là naphthoquinones, plumbagin, ramanteeon, glucoside rossoliside, những flavonoid như quercetin và hyperoside (Wagner et al. 1984; Wang et al. 1998). Cây này cũng thể hiện hoạt tính chống co giật (anticonvulsant activity) (Hema et al. 2009) và tính rubefacient.

Người dân địa phương Khasi và Jaintia Hills ở Meghalaya, Ấn Độ, đã báo cáo việc sử dụng những chiếc lá này trộn với muối để loại bỏ hoặc chữa lành vết phồng rộp (Joseph và Joseph 1986). Loài cây này cũng là một phần quan trọng trong chế phẩm Ayurveda có tên “Swarnabhasma” (Golden ash/tro vàng) (Ravikumar et al. 2000). Ở nhiều nước châu Âu và Trung Quốc, D.burmannii được nhập khẩu cho các ngành công nghiệp dược phẩm, nơi đây các cây khô được giới thiệu như là “Herba Droserae” (Didry et al. 1998). Ngoài việc thu được chất dinh dưỡng từ động vật, cây ăn thịt đôi khi cho thấy sự tương tác phức tạp của chúng (Jennings et al. 2010; Moon et al. 2010).

Cây ăn thịt tiêu thụ các loài gây hại như muỗi, ruồi nhuế (midges), ruồi hươu (deer flies), ruồi trâu (horseflies) và dipterans, những loài truyền bệnh cho người (Ellison và Gotelli 2009). Do đó, việc bảo tồn các loài cây ăn thịt có thể mang lại lợi ích cho nhiều loài (taxa) khác bao gồm cả con người. Nó cũng giúp ngăn chặn sự tuyệt chủng thứ cấp (secondary extinction) của các loài chuyên biệt khác phụ thuộc vào chúng.

Khi sự hội tụ/ biến mất của thực vật tăng lên (collection of the plants), cuối cùng dẫn đến sự suy giảm trong quần thể hoang dã. D.burmannii đã được gắn thẻ là dễ bị tổn thương ở Ấn Độ (Reddy et al. 2001), và ở bang Andhra Pradesh, cây này là một trong những cây chứa chất diệt côn trùng (medicinal insectivorous plant) được liệt kê trong danh sách đỏ (Jayaram và Prasad 2006). Nhân giống và bảo tồn thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tạo trở thành một trong những phương pháp chính để bảo vệ loài.

Những nỗ lực bảo tồn sẽ giúp duy trì và cung cấp ổn định nguồn nguyên liệu quý giá này nhằm đáp ứng nhu cầu lớn của các ngành công nghiệp dược phẩm. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đặt mục tiêu thiết lập một phương pháp vi nhân (micropropagation) giống protocol hiệu quả cho D.burmannii, sử dụng nhiều chiến nuôi cấy khác nhau để giúp bảo tồn và nhân giống các loài thực vật này.

Hình. 1 Sự hình thành nhiều chồi và tạo rễ từ các shoot tip của D.burmannii.
a. giai đoạn ban đầu nuôi cấy shoot tips (Bar 1 cm).
b. Tạo nhiều rễ trong ¼ SM+BAP+ NAA (4 mg/l) sau 30 ngày (Bar 1 cm).
c. Nhân giống chồi trong ¼ SM+ BAP+NAA (4 mg/l) (Bar 1 cm).
d. Tạo rễ rễ trong ¼ MS + BAP+NAA (4 mg/l) sau 30 ngày (Bar 1 cm). Rễ phát triển tốt (Bar 1 cm). Cây tái sinh thích nghi

Vật liệu – phương pháp

Drosera burmannii được thu thập từ Jarain, Meghalaya và được duy trì trong một nhà kính tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Thực vật học, Đại học North East Hill, Shillong. Shoot tips được thu hoạch từ các cây trồng trong nhà kính và được sử dụng làm mẫu vật (Explants). Các Explants được rửa kỹ trong nước máy và sau đó được xử lý bằng natri hypoclorit 10% (clo hoạt tính 4%) (4% active chlorine content) trong 10 phút và cuối cùng rửa sáu lần bằng nước cất. Các shoot tips có kích thước khoảng 1cm2 được cấy (inoculated) trên ¼ môi trường tiêu chuẩn (MS với axit citric 50 mg/l và axit ascorbic 10 mg/l), chứa 3% (w/v) sucrose và 0,8% (w/v) ) agar (Himedia) và độ pH được điều chỉnh thành 5,8. Tất cả các môi trường đã được hấp khử trùng ở áp suất 121oC và áp lực 1,05 kg/cm2 trong 15 phút. Mẫu cấy được ủ trong phòng tăng trưởng ở nhiệt độ 25 ± 2 C, chu kì sáng 14/10 giờ với độ chiếu xạ 60 umol/m2s bởi các ống đèn huỳnh quang trắng mát.

Cảm ứng rễ và chồi

Để tạo ra chồi và rễ, shoot tip explants được tách ra từ các chồi in vitro (in vitro raised microshoots) và được cấy (subcultured) trong các biến thể khác nhau của SM được bổ sung với các nồng độ khác nhau (1-8 mg/l) 6-benzylaminopurine (BAP), (Z) và kinetin (KN) kết hợp với axit axetic anaphthalene (NAA) (Hình 1; Bảng 1, 2, 3). Dữ liệu về đáp ứng tạo cơ quan (organogenetic response) và nhân giống (multiplication) chồi được ghi lại sau 30 ngày nuôi cấy. Số lượng rễ hình thành được ghi nhận sau 30 ngày chuyển microshoot (microshoot transfer). Tất cả các thí nghiệm được lặp lại ba lần với sáu bản mô phỏng của mỗi thí nghiệm và dữ liệu được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) trong phiên bản JMP 7.0.1 (Học viện SAS, Cary, NC). Sự khác biệt đáng kể giữa các ý nghĩa được đánh giá bằng Tukey’s test ở mức xác suất 5% (độ tin cậy).

Thích nghi-cấy ghép

Các cây con tạo rễ trong ống nghiệm (in vitro rooted plantlets) được rửa kỹ và trồng trong các ly nhựa nhỏ chứa đầy hỗn hợp cát và phân trại (3:1) và tưới nước hàng ngày trong nhà kính. Các cây con (plantlets) được duy trì trong điều kiện nhà kính ở nhiệt độ 25 ± 2 C, độ ẩm tương đối 80%, thông lượng photon 100 mol/m2s và độ dài ngày là 12 giờ. Tỷ lệ sống trung bình được tính sau 4 tuần thích nghi

Kết quả-thảo luận

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) có tác động mạnh mẽ đến sự tăng trưởng cây giống (seedling) của nhiều loại cây (Su et al. 2011). Các cytokinin PGR tăng cường tái sinh chồi và auxin tạo ra rễ phát triển trong chồi để làm cho nó trở thành một cây hoàn chỉnh. Trong nghiên cứu hiện tại, dưới nỗ lực tạo ra sự tái sinh nhiều chồi của D.burmannii từ các shoot tips, chúng được nuôi cấy trên các phiên bản SM khác nhau được bổ sung nồng độ PGR khác nhau (cytokinin và auxin). Cảm ứng chồi được quan sát trên tất cả các nồng độ và cả các sự kết hợp PGR cho thầy các đáp ứng rất đa dạng. Số lượng chồi cao nhất (28,8 ± 1,5) được quan sát thấy ở SM cường độ 1/4 được bổ sung 4 mg/l BAP và 4 mg/l NAA (Hình 1; Bảng 1), theo sau là 26,8 ± 1,4 chồi trong cường độ ¼ SM được thêm 4 mg/l KN và 4 mg/l NAA (Bảng 2). Tỷ lệ cảm ứng chồi lớn hơn trong các mẫu nuôi cấy được bổ sung BAP và NAA có thể được giải thích là do việc tăng tỷ lệ phân chia tế bào bởi ảnh hưởng của cytokinin (BAP) gây ra ở đỉnh chồi (terminal) và vùng mô phân sinh ở nách lá của mô mẫu (Niranjan et al. 2010). Hiệu quả của BAP và KN đối với việc nhân giống chồi cũng đã được báo cáo trước đó (Jayaram và Prasad 2007). Số lượng chồi nhiều đáng kể (25,3 ± 1,2) cũng được ghi nhận ở ¼ SM được bổ sung 1 mg/l Z và 8 mg/l NAA (Bảng 3). Hầu hết các shoot tip explants được nuôi cấy trên các nồng độ MS khác nhau được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng tăng kích thước và chồi mới bắt đầu “sinh sôi nảy nở” (proliferate) sau khi ủ 10-15 ngày.

Sự hình thành rễ cũng được quan sát thấy trên các cường độ SM khác nhau với sự kết hợp của cytokinin và auxin. Mặc sự tạo rễ không được quan sát trên tất cả các nồng độ đã sử dụng và cả PGR kết hợp (combinations of PGR), số lượng rễ tối đa (9,7 ± 0,6) đã được quan sát trên ¼ SM được bổ sung 4 mg/l BAP và 4 mg/l NAA. ¼ SM bổ sung BAP+NAA được tìm thấy là vượt trội so với KN+NAA và Z+NAA trong việc tạo rễ. Sự vượt trội của BAP+NAA so với PGR khác trong nhân giống in vitro cũng đã được báo cáo ở các loài thực vật khác (Seyyedyousefi et al. 2013). Dữ liệu của chúng tôi tiết lộ rằng có sự khác biệt về tác dụng của nồng độ khác nhau của BAP+NAA, KN+NAA và Z+NAA trong tạo rễ.

One-way ANOVA của thí nghiệm cho thấy rằng có sự khác biệt đáng kể giữa nồng độ khác nhau của cytokinin và auxin và liều lượng SM (SM strength) được sử dụng trong nghiên cứu. Trong số các phương pháp thử nghiệm khác nhau, liều lượng ¼ SM với sự kết hợp của BAP và NAA đã tạo ra số lượng chồi tối đa và tạo rễ tối đa.

Trên cơ sở kết quả của chúng tôi, đánh giá hiệu quả của các nồng độ BAP, KN và Z khác nhau kết hợp với NAA; người ta thấy rằng sự kết hợp của BAP với NAA đã được chứng minh là phù hợp hơn cho phép nhân giống chồi cũng như tạo rễ so với KN+NAA và Z+NAA. Sự thay đổi trong hoạt động của cytokinin và auxin có thể được giải thích bằng sự khác biệt về tốc độ hấp thu tương ứng (Nikam và Savant 2007). Phương pháp vi nhân giống được báo cáo ở đây đặc trưng với sự tăng sinh nhanh chóng của chồi và rễ của D.burmannii. Phương pháp này sẽ rất thuận lợi cho sản xuất quy mô lớn, như một nguồn thực vật thống nhất cho mục đích thương mại, cho sử dụng dược phẩm, để bảo tồn và một loạt các ứng dụng công nghệ sinh học hơn nữa.

Drosera burmannii nhân giống chủ yếu qua hạt; tuy nhiên, nhiều báo cáo hạn chế về sự nảy mầm của hạt giống và vi nhân giống. Công trình hiện tại đã chứng minh rằng có thể thu được thành công nhiều chồi D. burmannii từ nuôi cấy shoot tip với tạo rễ protocol trong ống nghiệm hiệu quả. Việc thiết lập các protocol để nhân giống in vitro của D.burmannii thông qua nhân giống chồi cung cấp một hệ thống tiềm năng để cải thiện, bảo tồn và nhân giống đại trà của loài cây ăn thịt tuyệt vời và quan trọng này.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Call Now Button