Vai trò của Malt Extract và Yeast Extract trong nuôi cấy Đông Trùng Hạ Thảo

Thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến phát trển đông học tế bào Cordyceps militaris trên phương pháp cấy trên agar. Từ khóa: Cordyceps militaris, mycelium growth, môi trường tối ưu hoá, Đông Trùng Hạ Thảo, môi trường rắn, nấm.

Cordyceps militaris là một trong các loại nấm được mô tả và được dùng rộng rãi trong dược liệu bồi bổ truyền thống Trung Quốc trong nhiều thế kỷ. Nó được nuôi trồng tự nhiên hay nuôi cấy ngập chìm sử dụng các loại môi trường khác nhau. Tơ nấm có chứa adenosine, cordycepin, và polysaccharides, là những chất chịu trách nhiệm cho hoạt tính sinh học. Cordycepin được biết đến rộng rãi và có nhiều công dụng-các chất được chuyển hóa có khả năng chống ung thư, chống khối u và hoạt tính miễn dịch. Loài nấm này có đặc trưng bởi tỉ lệ tăng trưởng thấp khi tăng trưởng trên môi trường rắn để chuẩn bị cấy trong tiến trình nuôi trồng. Vì vậy, điều quan trọng để tăng tỉ lệ tăng trưởng của loại nấm này trên môi trường rắn để giảm thời gian cho giai đoạn chuẩn bị. Trong nghiên cứu này, tối ưu môi trường nuôi cấy agar trong tăng trưởng nhanh tế bào với môi trường nuôi cấy agar khoai tây dextrose cải tiến (PDA) bổ sung với một phần đặc biệt dịch malt (đại mạch) (ME – malt extract) cùng với dịch nấm men (YE – yeast extract) được nghiên cứu. Đường kính tăng trưởng tơ nấm được theo dõi trong 21 ngày nuôi cấy với 2 lượt thí nghiệm môi trường khác nhau bổ sung: 2, 4, 6 và 8g của ME và 6g của ME với 0, 2, 4 và 6g của YE trên môi trường PDA. Kết quả quan sát được chứng minh rõ ràng đường kính tăng trưởng tơ nấm khoảng 7.5 cm được quan sát trên môi trường PDA bổ sung 6g/L ME và 4g/L YE.

Giới thiệu:

Cordyceps là một trong các loài nấm dược liệu nổi tiếng từ họ Clavicipitaceae và một số Hypocreales khác [1-4]. Đến hôm nay, hơn 350 loài Cordyceps được khám phá trên toàn thế giới, trong số đó khoảng 120 loài có nguồn gốc ở Trung Quốc [1,5]. Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. là chi được biết đến nhiều nhất trong Cordyceps, và tìm thấy như nấm ký sinh trên ấu trùng Lepidoptera. Nhờ nhiễm vào sâu bướm và ăn vật chủ vào cuối thu, quả thể như cỏ nhô ra từ đầu của vật chủ đã chết trong đầu hè. Trong hàng ngàn năm, các loài Cordyceps được dùng rộng rãi ở Trung Quốc và Nhật Bản vì giá trị các hoạt tính trị liệu trong chế biến thuốc bổ nói chung và aphrodisiac. Tuy nhiên, mức tăng trưởng chậm và điều kiện độ cao đặc biệt của loài nấm dược liệu này là sự quan tâm chính vì cung ứng không đủ cho nhu cầu thị trường. Gần đây, kỹ thuật lên men tơ nấm và hình thành quả thể cũng thay thế cho sự hình thành steroid được dùng trong muôi cấy nhân tạo các loài Cordyceps. Tuy nhiên, cơ chế chính của độc tính nấm không được làm rõ [2]. Thêm vào đó, một số nghiên cứu đã tìm thấy nuôi cấy nhân tạo Cordyceps sinensis chứng minh hoạt tính tương tự như loài hoang dại hay từ nhiên [6]. Hơn nữa, có một báo cáo nói rằng cordyceps và anamorph của nó chứa các thành phần hoạt tính đa dạng [7], như adenosine, cordycepin, polysaccharides, và ergosterol với hoạt tính trị liệu rộng [8, 9]. 3-deoxyadenosine hay cordycepin như cấu trúc tương tự của nucleoside adenosine cấu thành từ đơn vị ribose trong khi oxy trong vị trí 3’ là một trong các thành phần hoạt tính đáng kể từ các loại nấm. Thông thường, cordycepin được tìm thấy với lượng thấptrong Cordyceps sinensis. Ngược lại, lượng cordycepin được tìm thấy cao hơn ở C. militaris. Như báo cáo đã xuất bản, cho thấy cordycepin là (được gọi là) thành phần có nghĩa trong TMC cho nhiều bệnh như viêm mãn tính hay ung thư [10]. Hơn nữa, cũng có một số báo cáo cho thấy cordycepin được chuyển đổi bên trong tế bào cho 5’ mono của nó, di và triphosphate và chúng ngăn cản sự biến đổi của ribosephosphate pyrophosphokinase và 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate amidotransferase trong de novo purines biosynthesis (sinh tổng hợp các de novo purine) và/hay tổng hợp nucleic acids dẫn đến các kết quả chống lại di căn, kháng ung thư và kháng khuẩn [11-17]. Thêm vào đó, tính kháng hoạt động bạch cầu của cordycepin tham gia cùng với chất ức chế adenosine deaminase và tác dụng ức chế tương tự 2′, 5′- oligoadenylate được hiển thị trong nhiễm virus suy giảm miễn dịch ở người (human immunodeficiency virus-HIV) [18, 19].

Nuôi cấy nấm quy mô lớn thông qua môi trường nhân tạo mới được thiết lập như nguồn cordycepin thay thế vì số lượng hạn chế từ nguồn thiên nhiên. Liên quan đến nuôi cấy ngập chìm, kiểm soát oxy hòa tan hai giai đoạn trong môi trường hay bổ sung dinh dưỡng amoni vào môi trường tại các thời điểm chính xác được thực hiện để cải thiện sản phẩm cordycepin [20, 21]. Khi cordycepin có thể sản xuất hóa học, sản lượng không cao cũng như những khó khăn trong quy trình phức tạp, lượng lớn dung môi hữu cơ là chất phá hủy môi trường khi áp dụng quy trình này [22]. Liên quan đến nuôi cấy nhân tạo C. militaris, thử thách chính là mức tăng trưởng của tế bào nấm chuẩn bị trong quy mô công nghiệp khi rút ngắn thời gian nuôi cấy cùng với tăng mật độ tế bào. Nghiên cứu khác tương tự được quản lý để tăng nuôi cấy tơ nấm Helvella Crispa (Scop.) Fr. trên môi trường agar rắn [23]. Vì vậy, để tăng mức tăng trưởng nấm, hiệu quả của dịch chiết malt (ME) như phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy cơ bản PDA (potato dextrose agar – PDA) và dịch chiết nấm men (YE) trong tăng trưởng và thời gian nuôi cấy tế bào tơ nấm C. militaris được nghiên cứu.

Vật liệu và phương pháp:

Cordyceps militaris DSMZ 23612 được dùng trong nghiên cứu này. Chủng này lấy từ bộ sưu tập nuôi cấy tế bào và vi sinh Đức (Braunschweig, Germany). Trước tiên, chủng được hoạt hóa trong potato dextrose agar (PDA) để đảm bảo khả năng sống của tế bào. Các đĩa agar được ủ ở 26 ± 1°C trong 21 ngày sau đó giữa lạnh 4°C. Cấy chuyền được thực hiện từ nuôi cấy tế bào chủ trên đĩa petri chứa môi trường PDA để sản xuất nuôi cấy tế bào rồi ủ ở 26 ± 1°C. Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA), Malt Extract (ME) và Yeast Extract (YE) được mua từ Himedia hoặc Sigma Aldrich.

Các thí nghiệm sơ bộ được tiến hành trên môi trường PDA như môi trường chuẩn (hình 1). Thêm vào đó, sự tăng trưởng của tơ nấm C.militaris được theo dõi trong 2 loại môi trường nuôi cấy, gồm PDA bổ sung ME hay ME và YE ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được thu nhận mỗi ngày bằng phép đo đường kính tế bào tơ nấm tăng trưởng trên đĩa petri trong 21 ngày. Tất cả các số liệu được thể hiện trung bình với độ lệch chuẩn lấy từ 3 thí nhiệm.

Hình 1. Đường kính tăng trưởng của tơ nấm Cordyceps militaris trên môi trường agar khoai tây dextrose (PGA)

 

Kết quả và thảo luận:

Các kết quả của đường kính tơ nấm tăng trưởng trên môi trường PDA, môi trường PDA bổ sung các nồng độ khác nhau của ME được thể hiện trong hình 2. Như trình bày, khi tăng nồng độ ME hơn 6g/L không làm tăng đường kính tăng trưởng. Trong môi trường PDA ban đầu, đường kính tăng trưởng tăng dần và đạt 4.8 cm sau 21 ngày (hình 1). Trong nuôi cấy sổ sung ME 6g/L, đường kính tăng trưởng cao nhất khoảng 6.8 g/L sau 17 ngày. Điều này cho thấy ME không chỉ làm tăng đường kính tăng trưởng của nấm mà còn rút ngắn thời gian nuôi cấy.

Hình 2. Đường kính tăng trưởng của tơ nấm Cordyceps militaris trên môi trường agar khoai tây dextrose (PGA) bổ sung 2, 4, 6 và 8g dịch chiết malt (ME)


Cho sự tối ưu hóa trong tăng trưởng tơ nấm, dịch chiết nấm men được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau giữa 0-6 g/L từ môi trường tốt nhất được chọn trong thí nghiệm trước (môi trường PDA bổ sung 6g/L ME). Như trình bày trong hình 3, đường kính tăng trưởng cao nhất ghi nhận được là 7.7 cm từ 4g:6g (YE:ME) khi bổ sung vào nuôi cấy. Khi tăng nồng độ YE không cho thấy sự tăng trưởng của tơ nấm.

Hình 3. Đường kính tăng trưởng của tơ nấm Cordyceps militaris trên môi trường agar khoai tây dextrose (PGA) bổ sung 6g dịch chiết malt (ME) và 2, 4, và 6g dịch chiết nấm men (YE)


Môi trường PDA thường được xem như môi trường tốt nhất trong nuôi trồng nấm và vì vậy được dùng rộng rãi như môi trường chuẩn trong quá trình chuẩn bị nuôi cấy tế bào nấm cấp 1[24]. Tuy nhiên, dựa vào mức tăng trưởng thấp trong nuôi cấy in vitro, sự tăng trưởng trong hầu hết các trường hợp mất 14-20 ngày trên đĩa agar trước khi thích hợp cho bước tiếp theo là chuyển ra nuôi trồng (vegetative culture). Trong nghiên cứu này, ME cho thấy ảnh hưởng tích cực trong sự tăng trưởng tế bào. Điều này do ME có nguồn carbonhydrate cao đáp ứng yêu cầu trong tăng trưởng của tế bào như maltose, sucrose và các dạng đường dễ đồng hóa. Hơn nữa, YE không chỉ được cân nhắc như nguồn nitrogen mà còn mà nguồn amino acid, vitamins và các nhân tố tăng trưởng khác như nhân tố A và B tuyệt vời [25], vốn cần trong tăng trưởng nấm. Điều này cũng được báo cáo từ các tác giả khác, sự bổ sung YE vào môi trường lên men có giá trị tối ưu và hỗ trợ mạnh cho sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp [26, 27].

Kết luận:

Các kết quả thu được trong nghiên cứu này rõ ràng chứng minh tác dụng kích thích của ME và YE trong tăng trưởng động học tế bào (kinetics of cell growth) trên môi trường agar. Vì vậy, bổ sung cả hai thành phần sẽ cho kết quả chuẩn bị chủng tốt hơn trong thời gian ngắn và có thể rút ngắn thời gian tổng thể của tiến trình sản xuất hợp chất thứ cấp sinh học cordyceps trong hệ thống lên men. Thêm vào đó, công thức môi trường mới này có thể áp dụng trong nuôi cấy các loài nấm khác để rút ngắn thời gian cần thiết trong khi chuẩn bị giống (inoculum preparation) và tăng trưởng trong nuôi trồng (vegetative culture growth).

Lời cảm ơn

Các tác giả chân thành gửi lời cảm ơn đến MOHE và trường ĐH Teknologi Malaysia (UTM) cho GUP cấp số Q.J130000.2509.06H98 đã hỗ trợ cho nghiên cứu này.

 

Tài liệu tham khảo:

Mohammad Soltani1 , Mohanad Al-Ali1 , Nor Zalina Othman1 , Roslinda Malik1 , Nagib Elmarzugi1,2, Ramlan Aziz1 , Hesham A. El-Enshasy 1, 3 *
1 Institute of Bioproduct Development (IBD), Universiti Teknologi Malaysia (UTM), 81310 Skudai, Johor, Malaysia
2 Faculty of Pharmacy, Tripoli University, and Biotechnology Research Centre, Tripoli, Libya
3Genetic Engineering and Biotechnology Research Institute, City for Scientific Research and Technology Applications (CSAT), New Burg Al Arab, Alexandria, Egypt.

[1]. Y Jiang, and YJ Yao, Current understanding of molecular systematics of Cordyceps. Journal of Fungal Research, 2, 2004, 58-67.
[2]. H El Enshasy, and R Hatti-Kaul, Mushroom Immunomodulators: unique molecules with unlimited applications. Trends in
Biotechnology, 31, 2013, 668-677.
[3]. GH Sung, NL Hywel-Jones, JM Sung, JJ Luangsa-ard, B Shrestha, JW Spatafora, Phylogenetic classification of Cordyceps and the
Clavicipitaceous fungi. Studies in Mycology, 57, 2007, 5-59.
[4]. MS Torres, and JF White, Clavicipitaceae: Free-Living and Saprotrophs to Plant Endophytes, in M. Schechter (ed.), Encyclopedia
of Microbiology, Vol. 1, 3
rd.
Ed. (Oxford, Academic Press, 2009) 422-430.
[5]. JM Sung, HK Lee, and KJ Yang, Classification of Cordyceps spp. by morphological characteristics and protein banding pattern .
Korean Journal of Mycology, 23, 1995, 92-104.
[6]. J Yang, W Zhang, P Shi, J Chen, and X Han, Effects of exopolysaccharide fraction (EPSF) from a cultivated Cordyceps sinensis
fungus on c-Myc, c-Fos, and VEGF expression in B16 melanoma-bearing mice. Pathology Research and Practice, 201, 2005, 745-750.
[7]. H Guo, H Hu, S Liu, X Liu, Y Zhou, Y Che, Bioactive p-terphenyl derivatives from a Cordyceps-colonizing isolate of Gliocladium
sp. Journal of Natural Product,70, 2007, 1519-1521.
[8]. H. El Enshasy, Immunomodulators, in M. Hoffrichter (Ed.), The Mycota: Industrial Applications 2
nd. Ed.(New Yor: SpringerVerlag, 2010) 165-194.
[9]. M. Soltani, H Kamyab, and HA El Enshasy, Molecular weight (Mw) and Monosaccharide composition (MC): Two major factors
affecting the therapeutic action of polysaccharides extracted from Cordyceps sinensis. Journal of Pure and Applied Microbiology, 7  (3), 2013, 1601-1613.
[10]. H-J Cho, JY Cho, MH Rhee, and H-J Park, Cordycepin (3′-deoxyadenosine) inhibits human platelet aggregation in a cyclic AMPand cyclic GMP-dependent manner. European Journal of Pharmacology, 558 (1–3), 2007, 43-51.
[11]. K Overgaard-Hansen, The inhibition of 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate formation by cordycepin triphosphate in extracts of
Ehrlich ascites tumor cells. Biochimica Biophysica Acta, 80 (3), 1964, 504-507.
[12]. F Rottman, and AJ Guarino, The inhibition of phosphoribosyl-pyrophosphate amidotransferase activity by cordycepin mono
phosphate. Biochimica Biophysica Acta, 89 (3), 1964, 465-472.
[13]. JG Cory, RJ Suhadolnik, B Resnick, and MA Rich, Incorporation of cordycepin (3′-deoxyadenosine) into ribonucleic acid and
deoxyribonucleic acid of human tumor cells. Biochimca Biophysica Acta, 103 (4), 1965, 646-653.
[14]. MA Rich, P Meyers, G Weinbaum, JG Cory, and RJ Suhadolnik, Inhibition of human tumor cells by cordycepin. Biochim Biophys  Acta, 95 (2), 1965, 194-204.
[15]. Y Ahn, S Park, S Lee, S Shin, and D Choi, Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps  militaris against Clostridium spp. Journal of Agriculture Food Chemistry, 48 (7), 2000, 2744-2748.
[16]. N Yoshikawa, K Nakamura, Y Yamaguchi, S Kagota, K Shinozuka, and M Kunitomo, Antitumour activity of cordycepin in mice.
Clinical Experimental Pharmacology and Physiology, 31 (2), 2004, S51-S53.
[17]. K Nakamura, K Konoha, N Yoshikawa, Y Yamaguchi, S Kagota, and K Shinozuka, Effect of cordycepin (3′-deoxyadenosine) on
hematogenic lung metastatic model mice. In Vivo, 19 (1), 2005, 137-142.
[18]. WE Muller, BE Weiler, R Charubala, W Pfleiderer, L Leserman, and RW Sobol, Cordycepin analogues of 2′,5′-oligoadenylate
inhibit human immunodeficiency virus infection via inhibition of reverse transcriptase. Biochemistry, 30 (8), 1991, 2027-2033.
[19]. EN Kodama, RP McCaffrey, K Yusa, and H Mitsuya, Antileukemic activity and mechanism of action of cordycepin against
terminal deoxynucleotidyl transferase-positive (TdT+) leukemic cells. Biochemical Pharmacology, 59 (3), 2000, 273-281.
[20]. Mao, X.-B. and Zhong, J.-J. (2004). Hyperproduction of cordycepin by two -stage dissolved oxygen control in submerged
cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris in bioreactors. Biotechnol Prog. 20 (5): 1408-1413.
[21]. X-B Mao, and JJ Zhong, Significant effect of NH4+ on cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom  Cordyceps militaris. Enzyme Microbial Technology, 38 (3-4), 2006, 343-350.
[22]. S Aman, DJ Anderson, TJ Connolly, AJ Crittall, and GJ Ji, From adenosine to 3′-deoxyadenosine: development and scale up.
Organic Process Research & Development, 4 (6), 2000, 601-605.
[23]. E Eren, Güler P, and G Yıldız, Mycelium Development of Helvella Crispa (Scop.) Fr. on Different Agar Media. International
Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, 4 (1), 2013, 280-284.
[24]. P Maftoun, R Malek, M Abbas, R Aziz, H El Enshasy, Bioprocess for semi-industrial production of immunomodulatory
polysaccharide pleuran by Pleurotus ostreatus in submerged culture. Journal of Scientific and Industrial Research, 72, 2013, 655-662.
[25]. M Azuma, K Nishi, S Horinouchi, and T Beppu, Ribonuclease catalyze the synthesis of B-factor (3´-butyl phosphoryl AMP) an
inducer of rifamycin production in a Nocardia sp. Journal of Antibiotic, 43, 1990, 321-323.
[26]. HA El Enshasy, UI Beshay, AI El Diwany, HM Omar, AE El-Kholy, and R El-Najar, Improvement of rifamycins production by
Amycolatopsis mediterranei in batch and fed-batch cultures. Acta Microbiologica Polonica, 51, 2003, 301-313.
[27]. Li X, Li Z, Zheng J, Shi Z, Li L, Yeast extract promotes phase shift of bio-butanol fermentation by Clostridium acetobutylicum
ATCC824 using cassava as substrate. Bioresources Technology, 125, 2012, 43-51.

Tham khảo giá:

  1. Yeast Extract Powder
  2. Potato Dextrose Agar

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *