Vi nhân giống in Vitro loài cây ăn thịt Drosera rotundifolia

Tóm tắt
Mục đích của nghiên cứu là xác định thành phần tối ưu của môi trường tăng trưởng cho nuôi cấy in vitro Drosera rotundifolia.

Các chồi bất định (Adventitious shoots) có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro của Drosera rotundifolia được đưa lên môi trường Murashige và Skoog (MS) (1962) hoàn chỉnh, môi trường MS có hàm lượng dinh dưỡng giảm xuống ¾ MS, ½ MS, ¼ MS, 1/6 MS và môi trường MS với ½ hàm lượng các nguyên tố đại lượng chọn lọc (KNO3, KNO3+NH4NO3, KH2PO4 hoặc CaCl2). Môi trường chứa ¼ MS tiêu chuẩn được tìm thấy là hiệu quả nhất, vì cây trong biến thể này có trọng lượng lớn nhất và phát triển số lượng chồi bất định lớn nhất (37.1).

Nó cũng có lợi cho sự tăng trưởng và phát triển của rễ. Sự ra hoa chỉ được quan sát thấy trên MS chuẩn, ¾ MS và môi trường MS giảm các đại lượng được chọn lọc( KNO3 hoặc KNO3+NH4NO3). Giảm hàm lượng khoáng chất xuống ¼ MS hoặc nhiều hơn dẫn đến các tua có màu đỏ.

GIỚI THIỆU

Gọng vó (sundew) là một chi lớn bao gồm 194 loài ăn thịt được tìm thấy gần như khắp nơi trên thế giới. Quần thể lớn nhất của nó phát triển ở Châu Đại Dương, và có hơn 40 giống ở Tây Nam Úc. Nó rất phổ biến ở Bắc và Nam Mỹ, và các đầm lầy than bùn châu Âu, đặc biệt là ở taiga và lãnh nguyên. Nó cũng phát triển ở Châu Phi. Gọng vó là cây thân thảo lâu năm (hiếm khi hàng năm), vòng đời của nó có thể thậm chí dài 50 năm. Tùy thuộc vào loài, cây tạo thành thẳng đứng, cao 1cm đến 1m, thành cụm (rosettes).

Một số loài thậm chí là dây leo với chồi dài tới 2m.
Gọng vó thu nhận chất dinh dưỡng từ con mồi hiệu quả đến nỗi nó không tạo ra nitrate reductase, một loại enzyme phổ biến thường được các loài thực vật khác sử dụng để hấp thụ các chất dinh dưỡng từ đất (Karlsson và Pate, 1992). Vì gọng vó có nhu cầu đất thấp, nó chủ yếu phát triển ở những khu vực nghèo dinh dưỡng, chẳng hạn như đầm lầy, rừng đầm lầy, vùng đất nóng ẩm ướt và bờ hồ dystrophic. Tuy nhiên, nó cũng đã được tìm thấy tại các thảm thực vật chung (Lloyd, 1942).

Khi gọng vó phát triển trong môi trường thiếu nitơ, việc đó được bù đắp bằng cách ăn thịt. Nó thu hút con mồi bằng những giọt chất lỏng ngọt ngào lấp lánh ở cuối các xúc tu (tua) bao quanh phiến lá. Anthocyanin làm cho lá cây có màu đỏ, do đó cải thiện sự hấp dẫn của chúng đối với côn trùng. Khi con mồi đậu trên một chiếc lá, câu chuyện về sự giết chóc chậm chạp và chính xác của nó bắt đầu. Đầu tiên, chất lỏng phủ trên bề mặt lá làm dính chân côn trùng.

Trong khi côn trùng di chuyển, các rung động kích thích các thụ thể cảm giác trong các xúc tu. Các xúc tu sau đó bắt đầu kéo dài và uốn cong về phía con mồi. Phần của chiếc lá mà côn trùng đã bất động bắt đầu gập lại và từ từ quấn lấy con mồi.

Sau khi đảm bảo con mồi trên bề mặt lá, axit formic được giải phóng khỏi các đầu xúc tu và nó hòa tan cơ thể côn trùng. Các phân tử protein được giải phóng khỏi cơ thể của nó một lần nữa kích thích các thụ thể xúc tu.

Sự xuất hiện của protein kích hoạt sự tiết ra các enzyme phân giải protein biến côn trùng thành một loại nước ép giàu dinh dưỡng (chủ yếu là các hợp chất nitơ). Một khi các chất dinh dưỡng được hấp thụ, các xúc tu mở ra và tàn dư khó tiêu được thổi bởi gió. Các xúc tu tuyến cực kỳ nhạy cảm khi chạm vào. Con mồi càng chứa nhiều protein, phản ứng của cây càng đột ngột (Stichmann-Marny, 1997).

Tính chất đặc biệt của gọng vó đã được biết đến từ lâu trong y học như thảo dược. Chiết xuất của nó có chứa glycoside, choline và hợp chất cyanogen là một loại thuốc giảm đau hiệu quả. Cồn thuốc từ lá gọng vó (Sundew leaf tincture) từng là một phương thuốc rất phổ biến trong y học dân gian và được sử dụng để làm giảm các triệu chứng của bệnh ở phụ nữ (women’s diseases).

Đau răng đã được chữa khỏi bằng nước rửa mặt từ gọng vó và nước thảo dược (herbal infusions) giúp giảm đau mắt và đau đầu và các bệnh về dạ dày và tim. Hoa gọng vó thường được sấy khô và hút thay thế thuốc lá (Banasiuk et al. 2012). Ngoài các enzyme phân giải protein, thảo mộc có chứa naphthoquinones (plumbagin, ramentaceon, ramenton, hydroplumbagin glucoside và 7-methylhydrojuglone) và flavonoid.

Plumbagin cho thấy khả năng cầm máu yếu (weak haemostatic) và diệt khuẩn mạnh đối với staphylococci và streptococci, và mycobacteria và Diplococci những loài gây ra các bệnh về đường hô hấp. Chiết xuất nước của cây gọng vó có tính kháng khuẩn, chống ho, chống co thắt (spasmolyticum) và thuốc an thần. Thảo dược gọng vó được khuyến cáo để điều trị cúm, ho gà, viêm amidan, lao, ban đỏ, viêm amidan, viêm thanh quản, viêm phế quản, viêm họng và viêm phổi, hen suyễn và viêm xoang. Chiết xuất gọng vó cũng có đặc tính chống ung thư và antianginal. Trong các bài báo từ thế kỷ 19, sundew được mô tả là một loại thuốc chống động kinh. Hoạt tính gây độc tế bào và chống ung thư của nó cũng đã được xác nhận (Kawiak et al. 2012 a, Kawiak et al. 2012 b). Có ba loài sundew ở Ba Lan, sundew lá tròn, sundew lớn (great sundew) và sundew thìa (spatulate-leaved sundew) là sự pha trộn của hai loại đầu tiên.

Do tính chất dược liệu của sundew được liệt kê ở trên, những nỗ lực tăng quần thể của nó bằng các phương pháp thay thế có sẵn gần đây đã được tăng lên.

Quần thể Drosera đã suy giảm đáng kể trong vài thập kỷ qua do sự suy thoái của môi trường sống tự nhiên của nó, khả năng thu thập các chất chiết xuất từ thực vật bị hạn chế (Krenn và Karting, 2005). Nghiên cứu cho thấy thực vật được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro vô trùng có hàm lượng hoạt chất cao gấp sáu lần so với những cây được trồng trong tự nhiên (Wawrosch, 2005).

Tuy nhiên, việc nhân giống hiệu quả sundew in vitro đòi hỏi phải xác định chính xác các điều kiện nuôi cấy và đặc biệt là thành phần khoáng chất của môi trường. Do đó, mục đích của nghiên cứu là tìm ra thành phần tối ưu của môi trường nuôi cấy in vitro của Drosera rotundifolia L.

Nguyên liêu-Phương pháp

Thí nghiệm được thực hiện vào năm 2014, tại Khoa Di truyền Thực vật, Nhân giống và Công nghệ Sinh học, Đại học Công nghệ West Pomeranian ở Szczecin. Trong bước đầu tiên, mẫu nguyên liệu đã được nhân lên để sử dụng trong nghiên cứu tiếp theo.

Chồi Drosera rotundifolia L. bất định được đặt trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) mà không có bất kỳ chất điều hòa sinh trưởng thực vật nào. Khi các chồi bất định đạt đường kính 0,5 đến 1 cm, chúng được đặt trên môi trường MS với hàm lượng vi lượng và đại lượng khác nhau. Biến thể đối chứng là môi trường MS hoàn chỉnh và các biến thể thử nghiệm lần lượt là, hàm lượng vi lượng và đại lượng giảm xuống còn ¾ MS, ½ MS, ¼ MS, 1/6 MS và 1/8 MS (Bảng 1). Các chồi cũng được đặt trên môi trường MS trong đó mức độ các chất dinh dưỡng đại lượng được chọn giảm đi một nửa, tức là ½ KNO3, ½ KNO3 + ½ NH4NO3, ½ KH2PO4 hoặc ½ CaCl2.

Môi trường cũng chứa 8 g/dm3 agar, 30 g/dm3 sucrose và 100 mg/dm3 inositol. pH được điều chỉnh thành 5,7 với NaOH 0,1M và HCl. Sau đó, dung dịch 30 ml được đổ vào bình 300 ml và được hấp khử trùng trong 20 phút ở 121 ° C. Các cây phát triển trong một phytotron dưới 16 giờ chu kì sáng (16 giờ sáng/8 giờ tối) ở 24 ± 1°C. Các kệ phytotron được chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang ánh sáng mát 36W tạo ra ánh sáng với cường độ 35 umol/m2s. Mỗi bình chứa năm cây và mỗi biến thể được thiết lập trong 10 lần lặp lại.

Sau tám tuần, các thông số sau đây đã được đánh giá: chiều rộng của leaf rosette (cụm lá), chiều dài rễ [cm], số lượng rễ, trọng lượng cây [g], số lượng cây bất định, phần trăm cây ra hoa [%] và màu thực vật. Các kết quả đo được phân tích thống kê. Mỗi thí nghiệm được thiết kế một nhân tố ngẫu nhiên hoàn toàn. Ý nghĩa của phương sai được xác định bằng phân tích phương sai và Kiểm tra đa phạm vi của Duncan (Duncan’s Multiple Range) với P = 0,05.

KÊT QUẢ & THẢO LUẬN

Sundews giàu hợp chất cyanogen, glycoside và choline, là thực vật quý và độc đáo. Các chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc từ chúng được sử dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm. Nghiên cứu cho thấy mức độ chuyển hóa trong cây trồng in vitro thậm chí có thể cao hơn một vài lần so với những cây phát triển trong điều kiện tự nhiên. Do đó, việc nhân giống in vitro của sundew đã trở nên rất phổ biến gần đây. Nuôi cấy in vitro cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp có chất lượng cao, không cần thuốc trừ sâu và không phụ thuộc vào điều kiện khí quyển (Burbidge, 1994).

Kiểm soát in vitro của Drosera L. đã được xem xét trong nhiều nghiên cứu nhằm xác định các điều kiện thuận lợi nhất cho sự phát triển của nó (Kukulczanka và Czastka 1991; Bobák et al. 1995; Kawiak et al., 2003). Tuy nhiên, những phát hiện được báo cáo là rất tương phản, đặc biệt là liên quan đến hàm lượng của các thành phần khoáng sản trong môi trường tăng trưởng. Một nghiên cứu của Kawiak et al. (2003) đã xác định môi trường MS có hàm lượng khoáng chất giảm một nửa là đáp ứng hiệu quả nhất các yêu cầu về sundew. Tuy nhiên, dường như không có môi trường phổ quát cho tất cả các loài Droseraceae, Królicka và cộng sự. (2008) tuyên bố rằng chất nền tốt nhất để nhân giống Drosera binata là môi trường Vacin và Went không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Một nghiên cứu về tác động của các mức độ khác nhau của các chất dinh dưỡng đa lượng trong môi trường MS đối với sự phát triển của spatulate-leaved sundew (Drosera trung gian L.) cho thấy sự tăng trưởng mạnh nhất của cây ở môi trường 1/3 MS (Jang, 2003). Grevenstuk và cộng sự. (2010), người đã nghiên cứu cùng một loài, báo cáo là môi trường MS hiệu quả nhất với hàm lượng khoáng chất giảm 75% và không được bổ sung với bất kỳ chất điều hòa sinh trưởng thực vật nào.

Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng môi trường thuận lợi nhất cho sự phát triển của round-leaved sundew là ¼ MS (Bảng 2). Những cây được trồng trên môi trường này có trọng lượng lớn nhất (0,725 g) và tạo ra số lượng lớn nhất của cây con (37,1). Số lượng cây con được sản xuất bởi sundews được nuôi cấy trên các môi trường khác thấp hơn đáng kể và nằm trong khoảng từ 12,9 cho 1/8 MS đến 20,1 cho ½ MS. Tác động đáng kể của việc giảm hàm lượng khoáng chất đối với chiều rộng của leaf rosette chỉ được quan sát thấy ở các biến thể MS 1/6 và 1/8, so với môi trường MS hoàn chỉnh.


Nghiên cứu cho thấy mối tương quan rõ ràng giữa hàm lượng khoáng chất giảm và số lượng rễ tăng. Số lượng lớn nhất của rễ khá dài đã được phát triển trên môi trường ¼ MS. Nhiều rễ cây cũng được tạo ra bởi các cây sundew mọc trên môi trường với hàm lượng các hợp chất nitơ giảm một nửa, tức là ½ KNO3. Theo Rejthar et al. (2014), phát triển hệ thống rễ trong quá trình nhân giống rất có lợi từ góc độ kinh tế, vì nó cho phép bỏ qua giai đoạn ra rễ hình thành nên một bước chuẩn hóa (standard step) của vi nhân giống.

Báo cáo nghiên cứu cho thấy sự ra hoa là một quá trình phức tạp được kiểm soát bởi các yếu tố di truyền và tác nhân môi trường, hiếm khi xảy trong ống nghiệm. Vásquez-Collantes và cộng sự (2014) đã xem xét sự ra hoa của cây dương xỉ in vitro và thử nghiệm môi trường MS tiêu chuẩn, môi trường MS với hàm lượng khoáng chất thấp hơn mười và năm lần, môi trường được làm giàu với axit gibberellic 0,1 mg/l, IAA và BAP 0,1 mg/l, và chu kì sáng khác nhau. Việc bổ sung 0,1 và 1 mg/L GA3 gây ra sự ra hoa ở 50% số cây tiếp xúc với 20 giờ chu kì sáng nhưng sự hiện diện của BAP hoàn toàn không kích thích ra hoa. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sundews chỉ phát triển chồi hoa khi được trồng trên môi trường có nồng độ vi lượng và đại lượng cao nhất (Bảng 2). Sự ra hoa chỉ được quan sát thấy trên toàn bộ MS, ¾ MS và media ½ MS và MS giảm hàm lượng KNO3 hoặc KNO3+NH4NO3. Tỷ lệ ra hoa trên thân (plants producing inflorescence stems) giảm cùng với việc giảm hàm lượng khoáng chất trong môi trường. Chúng được phát triển ở 96% thực vật được trồng trên môi trường MS hoàn chỉnh và 90% và 62% thực vật được trồng trên ¾ MS và ½ MS, tương ứng.

Một đáp ứng thú vị của thực vật đối với việc giảm hàm lượng khoáng chất trong môi trường là tổng hợp anthocyanin màu đỏ tươi (Foot et al. 2014). Hiện tượng này được điều tra bởi Ichiishi et al. (1999), người đã nghiên cứu ảnh hưởng của các mức độ khác nhau của các chất dinh dưỡng vi lượng và đại lượng và sucrose trong môi trường MS. Các tác giả kết luận rằng nồng độ NH4NO3 giảm đã gây ra sự thay đổi màu sắc của xúc tu nhưng không phải lá cây. Hơn nữa, loại bỏ NH4NO3 và KNO3 khỏi môi trường dẫn đến những thay đổi khác trong màu thực vật. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự thay đổi màu sắc từ đậm sang xanh nhạt được quan sát thấy khi hàm lượng khoáng trung bình giảm một nửa (½ MS). Khi hàm lượng khoáng chất tiếp tục giảm, các tuyến xúc tu (glandular tentacles) trên mép phiến lá chuyển sang màu đỏ sẫm. Sự thay đổi màu sắc này cũng được nhận thấy ở những cây sundews nhân lên trên môi trường MS với mức giảm KNO3 và NH4NO3 (MS – ½ KNO3 – ½ NH4NO3). Việc giảm hàm lượng của KNO3 một mình chỉ làm cho các xúc tu màu xanh đậm có màu xanh nhạt (Bảng 2).

Tổng kết

Một môi trường được khuyến nghị cho vi nhân giống Drosera rotundifolia L. là MS với hàm lượng khoáng chất giảm 75% (¼ MS). Cây Sundew phát triển trên môi trường này có trọng lượng lớn nhất.
Môi trường MS có chứa ¼ các chất dinh dưỡng vi lượng và đại lượng là hiệu quả nhất để tạo rễ cho cây round-leaved sundew. Những cây mọc trên môi trường này tạo ra số lượng lớn rễ dài.
Việc giảm hàm lượng khoáng chất xuống ¼ MS hoặc nhiều hơn dẫn đến màu đỏ của các xúc tu trên lá và cây được nhân lên trên các môi trường này không tạo ra hoa (inflorescences).

Nguồn tham khảo 

References [1] R. Banasiuk, A. Kawiak, A. Krölicka. In vitro cultures of carnivorous plants from the Drosera and Dionaea genus for the production of biologically active secondary metabolites. Biotechnologia 93(2) (2012) 87-96.
[2] M. Bobák, A. Blehová, J. Krißtin, M. Oveçka, J. Samaj. Direct plant regeneration from leaf explants of Drosera rotundifolia cultured in vitr. Plant Cell Tiss. Org Cult. 43 (1995) 39-49.

[3] Burbidge. Secondary plant metabolites from tissue culture. w: In vitro cultivation of plant cells. Ed. Hunter C. F. Butterworth Heinemann, London, (2004) 131-151.

[4] G. Foot, S.P. Rice, J. Millett. Red trap colour of the carnivorous plant does not serve a prey attraction or camouflage function. Biology Letters 10(4) (2014) 20131024

[5] T. Grevenstuk, N. Coelho, S. Gonçalves & A. Romano. In vitro propagation of Drosera intermedia in a single step. Biologia plantarum, 54(2) (2010) 391-394.

[6] S. Ichiishi, T. Nagamitsu, Y. Kondo, T. Iwashina, K. Kondo, N. Tagashira. Effects of Macro-components and Sucrose in the Medium on in vitro Red-color Pigmentation in Dionea muscipula Ellis and Drosera spathulata Labill. W: Plant Biotechnology, Hiroshima (1999) 235-238.

[7] P. Karlsson, J. Pate. Contrasting effects of supplementary feeding of insects or mineral nutrients on the growth and nitrogen and phosphorus economy of pygmy species of Drosera. Oecologia (1994) 14.

[8] Kawiak, A. Królicka, E. Lojkowska. Direct regeneration of Drosera from leaf explants and shoot tips. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75(2) (2003) 175-178.

[9] A Kawiak, J. Zawacka-Pankau, E. Lojkowska. Plumbagin induces apoptosis in Her2-overexpressing breast cancer cells through the mitochondrial-mediated pathway. Journal of Natural Products 75(4) (2012) 747-751.

[10] Kawiak, J. Zawacka-Pankau, A. Wasilewska, J. Bigda, E. Lojkowska. Induction of apoptosis in HL-60 cells through the ROS-mediated mitochondrial pathway by ramentaceone from Drosera aliciae. Journal of Natural Products 75(1) (2012) 9-14.

[11] L. Krenn, T. Kartnig, Phytotherapie, Frankfurt (1987) 197-202.

[12] Krolicka, A. Szpitter, M. Maciag, E. Biskup, E. Gilgenast, G. Romanik, E. Lojkowska. Antibacterial and antioxidant activity of the secondary metabolites from in vitro cultures of the Alice sundew (Drosera aliciae). Biotechnology and applied biochemistry 53(3) (2009) 175-184.

[13] K. Kukulczanka & B. Czastka. Vegetative propagation of were successfully transferred to peat. selected species of Droseraceae taxa and in vitro gene bank establishment. Prac. Ogr. Bot. PAN 1 (1991) 55-61.

[14] F. E. Lloyd. The Carnivorous plants, Chronica Botanica Company of Waltham, Mass., U.S.A (1942).

[15] T. Murashige, F. Skoog. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum (1962) 473-497 [16] J. Rejthar, I. Viehmannova, P. H. Cepkova, E. Fernández & L. Milella. In vitro propagation of Drosera intermedia as influenced by cytokinins, pH, sucrose, and nutrient concentration. Emirates Journal of Food and Agriculture 26(6) (2014) 558.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *