BIOSPACE-A Part of SBC Scientific

Science knows no country, because knowledge belongs to humanity, and is the torch which illuminates the world. *Louis Pasteur*

BIOSPACE MAGAZINE

Sửa chữa và bảo vệ DNA

Trên phân tử DNA có thể xuất hiện nhiều biến đổi do sai hỏng trong quá trình trao đổi chất, do các tác nhân gây đột biến vật lý và hóa học của môi trường. Tuy nhiên, genome luôn có độ ổn định cao nhờ các cơ chế sửa chữa và bảo vệ DNA. DNA là phân tử duy nhất, mà khi biến đổi hay bị phá hỏng vẫn có khả năng được sửa chữa nhờ tế bào. Các cơ chế sửa sai rất đa dạng và có hiệu quả cao. Ba quá trình bao gồm sửa sai, tái bản và tái tổ hợp DNA liên quan chặt chẽ với nhau. Đây cũng là một minh chứng về sự phối hợp chặt chẽ giữa nhiều cơ chế di truyền.

(more…)

 

Dịch mã

Dịch mã là quá trình các thông tin di truyền chứa trong các trình tự nucleotide của mRNA được sử dụng để tạo ra các chuỗi amino acid trong protein. Sự tổng hợp một protein riêng lẻ đòi hỏi sự tham gia của hơn 100 protein và RNA. Bộ máy dịch mã bao gồm bốn thành phần quan trọng là mRNA, tRNA, aminoacyl tRNA synthetase và ribosome. Các mRNA là khuôn mẫu cho quá trình dịch mã. Dịch mã là một trong những quá trình có tính bảo thủ cao và chiếm nhiều năng lượng của tế bào. Tuy nhiên, do cấu trúc khác nhau giữa mRNA của prokaryote và eukaryote nên quá trình dịch mã của chúng cũng có những điểm khác biệt quan trọng.

(more…)

 

Phiên mã

Phiên mã là quá trình tổng hợp RNA từ khuôn mẫu DNA. Quá trình này về phương diện hóa học và enzyme rất giống với quá trình tái bản DNA. Cả hai đều liên quan đến các enzyme tổng hợp một chuỗi nucleic acid mới bổ sung với khuôn mẫu DNA. Tất nhiên, hai quá trình này có những khác biệt quan trọng, mà đáng chú ý nhất là chuỗi mới trong quá trình phiên mã được tạo thành từ các ribonucleotide thay vì các deoxyribonucleotide. Các nguyên tắc cơ bản của quá trình phiên mã được thiết lập dựa vào nghiên cứu trên prokaryote (E. coli) nhưng dường như các nguyên tắc này cũng có tính phổ biến cho cả eukaryote. Tuy nhiên, do sự khác biệt về cấu trúc genome và hệ thống enzyme nên sự phiên mã ở prokaryote và eukaryote cũng có những đặc trưng nhất định.

I. Các đặc điểm cơ bản của quá trình phiên mã

1. Sự phiên mã tạo ra RNA bổ sung với một sợi DNA

Các ribonucleotide nối tiếp của RNA được xác định dựa trên nguyên tắc bổ sung với các nucleotide trên DNA khuôn mẫu. Khi sự bắt cặp chính xác xảy ra, ribonucleotide tiếp theo được liên kết đồng hóa trị với chuỗi RNA đang hình thành nhờ phản ứng có enzyme xúc tác. Như vậy, sản phẩm phiên mã được kéo dài từng ribonucleotide một và bổ sung chính xác với sợi DNA được dùng làm khuôn mẫu.

Quá trình phiên mã dù có tính chính xác cao nhưng vẫn kém hơn nhiều so với quá trình tái bản DNA (tỷ lệ mắc lỗi là 1/10.000 nucleotide so với 1/10.000.000 trong tái bản). Đó là do sự thiếu một cơ chế sửa sai hữu hiệu, mặc dù trong quá trình tổng hợp RNA cũng có hai dạng sửa sai tồn tại. Tuy nhiên, vì các RNA được phiên mã không bao giờ được sao chép lại nên các sai sót xảy ra không ảnh hưởng đến việc truyền đạt thông tin cho thế hệ sau.

2. Sự phiên mã là một phản ứng enzyme

Những enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình phiên mã ở cả tế bào prokaryote và eukaryote đều được gọi là RNA polymerase phụ thuộc DNA (DNA-dependent RNA polymerase), gọi tắt là RNA polymerase.

RNA polymerase xúc tác hình thành các cầu nối phospho-diester để nối các ribonucleotide thành một chuỗi thẳng. Enzyme dịch chuyển từng bước dọc theo DNA khuôn mẫu và kéo dài chuỗi RNA theo hướng từ 5’3’, nghĩa là các ribonucleotide được thêm vào đầu 3’ của chuỗi RNA đang hình thành. Các cơ chất được sử dụng để tổng hợp RNA là ATP, GTP, CTP và UTP. Cũng giống như trong sự tái bản DNA, năng lượng cho phản ứng được cung cấp từ sự thủy phân các cầu nối giàu năng lượng của các cơ chất nói trên.

3. Sự phiên mã chỉ sao chép chọn lọc một số phần của genome và tạo ra nhiều bản sao

Sự lựa chọn vùng nào để phiên mã không phải xảy ra ngẫu nhiên. Mỗi vùng phiên mã điển hình bao gồm một hoặc nhiều gen, có những trình tự DNA đặc hiệu hướng dẫn khởi đầu và kết thúc phiên mã.

Đối với một vùng được chọn phiên mã, có thể có một đến hàng trăm thậm chí cả nghìn bản sao RNA được tạo ra. Sự tổng hợp phân tử RNA sau được bắt đầu trước khi phân tử RNA trước hoàn thành. Từ một gen đơn độc, trong vòng một giờ có thể tổng hợp được hơn một nghìn phân tử RNA (đối với eukaryote).

Sự lựa chọn vùng nào để phiên mã và mức độ phiên mã đều được điều hòa. Vì vậy, trong những tế bào khác nhau hoặc trong cùng một tế bào nhưng ở những thời điểm khác nhau sẽ có những nhóm gen khác nhau được phiên mã.

4. Chỉ một trong hai sợi đơn của phân tử DNA được dùng làm khuôn mẫu

Việc gắn của RNA polymerase vào promoter của gen sẽ quyết định việc lựa chọn sợi nào trong hai sợi đơn của DNA làm khuôn mẫu. Promoter, ngoài việc mang vị trí gắn RNA polymerase còn chứa đựng thông tin xác định sợi nào trong hai sợi đơn của DNA được phiên mã và xác định vị trí bắt đầu phiên mã.

5. Sự phiên mã được khởi phát không cần mồi

RNA polymerase có thể khởi đầu sự tổng hợp RNA trên khuôn mẫu DNA mà không cần mồi như DNA polymerase. Điều này đòi hỏi ribonucleotide đầu tiên được mang đến vị trí bắt đầu phiên mã phải được giữ ổn định trên DNA khuôn mẫu trong khi ribonucleotide thứ hai đang được đưa đến để xảy ra phản ứng trùng hợp.

II. Các giai đoạn của quá trình phiên mã

RNA polymerase tiến hành quá trình phiên mã một gen thông qua nhiều bước và được chia thành ba giai đoạn: khởi đầu, kéo dài, và kết thúc.

1. Giai đoạn khởi đầu

Đầu tiên, RNA polymerase gắn với promoter của gen (cùng với các yếu tố khởi đầu) để tạo thành phức hợp promoter-polymerase. Một khi được hình thành, phức hợp này sẽ có sự thay đổi cấu trúc cần thiết cho việc tiến hành giai đoạn khởi đầu.

Giai đoạn khởi đầu này bao gồm ba bước như sau:

1.1. Phức hợp đóng (closed complex)

Khi RNA polymerase vừa mới gắn với promoter thì phức hợp tạo thành ở trạng thái đóng. Ở trạng thái này, DNA vẫn là chuỗi kép và enzyme gắn vào một phía của vòng xoắn.

1.2. Phức hợp mở (open complex)

Lúc này DNA xung quanh điểm bắt đầu phiên mã được mở xoắn và liên kết giữa các cặp base bổ sung bị phá vỡ. Hai sợi DNA với độ dài khoảng 14 bp xung quanh vị trí bắt đầu phiên mã tách rời nhau ra và tạo nên vòng phiên mã. Việc mở DNA đã giải phóng sợi khuôn mẫu. Hai nucleotide đầu tiên được mang đến vị trí bắt đầu đã được hoạt hóa, chúng xếp hàng trên khuôn mẫu và được nối với nhau. RNA polymerase bắt đầu chuyển dịch dọc theo sợi khuôn mẫu, mở xoắn phía trước vị trí trùng hợp và tái gắn hai sợi DNA phía sau. Bằng cách này, các ribonucleotide tiếp theo được gắn vào chuỗi RNA đang phát triển. Đoạn RNA ban đầu với số lượng ribonucleotide ít hơn 10 sẽ bị loại bỏ và enzyme bắt đầu tổng hợp lại.

1.3. Phức hợp tam nguyên bền (stable ternary complex)

Một khi enzyme đi được khoảng hơn 10 bp, nó được xem là “thoát” khỏi promoter.Lúc này một phức hợp gồm ba thành phần là enzyme, DNA và RNA được hình thành và quá trình phiên mã chuyển sang giai đoạn kéo dài.

2. Giai đoạn kéo dài

Một khi RNA polymerase tổng hợp được một đoạn RNA khoảng 10 base, nó chuyển sang giai đoạn kéo dài. Sự chuyển giai đoạn này đòi hỏi những biến đổi hơn nữa về cấu hình của RNA polymerase làm cho nó càng giữ chặt khuôn mẫu hơn nữa. Trong quá trình kéo dài, enzyme này thực hiện một loạt nhiều nhiệm vụ rất quan trọng ngoài việc tổng hợp RNA. Nó mở xoắn DNA trước mặt và tái gắn DNA phía sau, nó tách dần chuỗi RNA đang hình thành ra khỏi khuôn mẫu khi đang di chuyển dọc theo gen, và nó còn thực hiện chức năng đọc sửa sai (ở quá trình tái bản DNA, các chức năng này do nhiều enzyme khác nhau thực hiện).

3. Giai đoạn kết thúc

Khi RNA polymerase phiên mã hết chiều dài của gen (hoặc các gen), nó dừng lại và giải phóng sản phẩm RNA. Trong một số tế bào, có những trình tự đặc hiệu thúc đẩy giai đoạn kết thúc. Trong một số tế bào khác, người ta vẫn chưa rõ yếu tố nào điều khiển enzyme ngừng phiên mã và giải phóng RNA khỏi khuôn mẫu.

III. Phiên mã ở prokaryote

1. Enzyme RNA polymerase ở prokaryote

Tế bào prokaryote chỉ chứa một loại RNA polymerase. Enzyme này được cấu tạo bởi năm tiểu đơn vị, gồm hai tiểu đơn vị α và các tiểu đơn vị β, β’, ω. Các tiểu đơn vị này liên kết với nhau để tạo thành enzyme lõi.

Người ta làm thí nghiệm tinh sạch enzyme lõi từ tế bào vi khuẩn rồi cho vào dung dịch chứa DNA vi khuẩn và ribonucleotide thì enzyme sẽ gắn với DNA và tổng hợp RNA. Tuy nhiên, RNA thu được trong thí nghiệm này không giống với RNA trong tế bào vì enzyme đã gắn vào các vị trí không thích hợp trên DNA. Nếu cho thêm một loại polypeptide tinh sạch được gọi là yếu tố σ trước khi enzyme gắn với DNA thì sự phiên mã sẽ bắt đầu tại những vị trí chính xác như trong tế bào.
Việc gắn yếu tố σ vào enzyme lõi làm tăng ái lực của enzyme với vị trí khởi động trên DNA, đồng thời làm giảm ái lực đối với các vùng khác. Khi enzyme lõi được gắn thêm yếu tố σ sẽ trở thành dạng holoenzyme.

2. Promoter của gen ở prokaryote

Promoter của gen vi khuẩn nằm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã. Bằng cách phân tích các trình tự DNA này của một số lượng lớn các gen vi khuẩn người ta nhận thấy có hai đoạn ngắn tương đối giống nhau giữa gen này và gen khác, mỗi đoạn gồm sáu nucleotide. Đoạn thứ nhất nằm cách vị trí khởi đầu khoảng 35 bp, là sự biến đổi của trình tự TTGACA. Đoạn thứ hai nằm cách vị trí khởi đầu khoảng 10 bp, là sự biến đổi của trình tự TATAAT. Chúng lần lượt được gọi là vùng 35 và vùng 10 (hộp Pribnow).

Đối với các promoter mạnh (ví dụ ở gen mã hóa rRNA), người ta còn tìm thấy yếu tố UP làm tăng sự gắn của RNA polymerase vào DNA. Có một số promoter thiếu vùng 35 và được thay bằng yếu tố 10 mở rộng, bao gồm vùng 10 chuẩn và thêm một đoạn ngắn ở đầu 5’ của nó (ví dụ ở gen gal của E. coli).

Yếu tố σ nhận dạng các vùng 35 và 10 hoặc yếu tố 10 mở rộng nhờ các cấu trúc đặc biệt của chúng. Riêng yếu tố UP không được nhận dạng bởi σ mà được nhận dạng bởi một vùng ở đầu C tận cùng của tiểu đơn vị α, gọi là α CTD (carboxyl terminal domain).

3. Vai trò của enzyme RNA polymerase và promoter trong quá trình phiên mã

Khi khởi đầu sự phiên mã, RNA polymerase gắn với DNA ở vùng 35 một cách lỏng lẻo tạo thành phức hợp đóng. Sau đó, enzyme gắn vào promoter chặt hơn và phức hợp chuyển sang trạng thái mở. Một vùng DNA được mở xoắn nằm giữa hai vị trí -11 và +3, nghĩa là bao gồm cả vị trí bắt đầu phiên mã +1. Sợi đơn DNA làm khuôn mẫu được bộc lộ để sinh tổng hợp RNA.

Một khi RNA polymerase tổng hợp được 10 nucleotide (sau lần khởi đầu) thì yếu tố σ rời khỏi enzyme và có thể đến gắn vào promoter khác để khởi đầu một quá trình phiên mã mới. Sự tách rời yếu tố σ cho phép hình thành một kênh thoát mà thông qua đó phần RNA đã được tổng hợp chui ra khỏi enzyme và được kéo dài (Hình 5.1).

Hình 5.1. Các giai đoạn phiên mã ở prokaryote

4. Tín hiệu kết thúc

Tín hiệu kết thúc là những trình tự trên DNA có vai trò thúc đẩy sự tách RNA polymerase ra khỏi DNA và giải phóng chuỗi RNA mới được tổng hợp. Ở vi khuẩn, có hai loại tín hiệu kết thúc là tín hiệu kết thúc không phụ thuộc Rho và tín hiệu kết thúc phụ thuộc Rho.

4.1. Tín hiệu kết thúc không phụ thuộc Rho

Đó là một cấu trúc đặc biệt bao gồm hai trình tự đối xứng bổ sung nhau giàu GC, tiếp theo sau là một loạt 8 adenine (chúng sẽ được phiên mã thành 8 uracil). Những trình tự này không ảnh hưởng đến RNA polymerase cho đến sau khi chúng được phiên mã. Khi đó các trình tự đối xứng bổ sung trên RNA sẽ bắt cặp với nhau và tạo nên cấu trúc hình chiếc kẹp tóc (Hình 5.2). Cấu trúc kẹp tóc này đã phá vỡ phức hợp kéo dài hoặc bằng cách thúc đẩy mở kênh thoát cho RNA trên RNA polymerase hoặc bằng cách phá vỡ mối tương tác RNA-khuôn mẫu DNA

Cấu trúc kẹp tóc này chỉ hoạt động hiệu quả khi nó được theo sau bởi một loạt U. Tại thời điểm cấu trúc kẹp tóc được hình thành, chuỗi RNA đang phát triển vẫn được giữ trên khuôn mẫu chỉ bằng các liên kết giữa A-U. Vì liên kết A-U yếu hơn G-C nên chúng dễ dàng bị phá vỡ bởi hiệu quả của cấu trúc kẹp tóc, và vì thế RNA dễ dàng được giải phóng.

4.2. Tín hiệu kết thúc phụ thuộc Rho

Tín hiệu này là những thành phần RNA mà muốn hoạt động, đòi hỏi phải có yếu tố Rho. Yếu tố Rho là một protein hình nhẫn (ở E. coli có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa) gồm sáu tiểu đơn vị giống hệt nhau. Yếu tố này có hoạt tính ATPase: khi gắn vào sản phẩm phiên mã, nó sẽ sử dụng năng lượng từ sự thủy phân ATP để kéo RNA ra khỏi khuôn mẫu và polymerase.

Yếu tố Rho điều khiển phân tử RNA đặc biệt nhờ tính đặc hiệu. Thứ nhất là tính đặc hiệu tại những vị trí nó gắn, đó là những đoạn khoảng 40 nucleotide mà không gấp lại thành cấu trúc bậc hai, chúng thường giàu C. Tính đặc hiệu thứ hai là yếu tố Rho giảm gắn với bất kỳ sản phẩm phiên mã nào đang được dịch mã (nghĩa là những sản phẩm đang gắn ribosome). Ở vi khuẩn, phiên mã và dịch mã được song hành chặt chẽ: dịch mã khởi phát ngay trên RNA đang được tổng hợp kể từ khi RNA bắt đầu chui ra khỏi RNA polymerase. Vì vậy Rho chỉ kết thúc những sản phẩm vẫn đang được phiên mã ở quá đầu tận cùng của gen hoặc operon.

IV. Quá trình phiên mã ở eukaryote

1. Cấu trúc gen ở eukaryote

Cấu trúc một gen mã hóa cho protein của eukaryote bao gồm các vùng sau:

1.1. Vùng 5’ kiểm soát biểu hiện gen

Vùng này bao gồm các trình tự nucleotide điều hòa biểu hiện gen và hoạt hóa sự phiên mã, bao gồm:

– Promoter. Là những trình tự định vị ở đầu 5’ không dịch mã của gen có chức năng xác định vị trí bắt đầu phiên mã, kiểm soát số lượng mRNA và đôi khi cả tính đặc hiệu mô (tissue-specific). Promoter có thể dài đến vài nghìn bp. Vùng này thường chứa một trình tự bảo thủ gọi là hộp TATA nằm cách vị trí phiên mã khoảng 25-30 bp. Hộp này giúp xác định chính xác vị trí bắt đầu phiên mã. Ngoài ra, còn có hộp CCAAT nằm cách vị trí bắt đầu phiên mã khoảng 75-80 bp. Hộp này ít phổ biến hơn hộp TATA, nó có chức năng tăng hiệu quả phiên mã. Một số gen “quản gia” mã hóa cho các enzyme hiện diện ở tất cả các tế bào thường thiếu cả hai hộp này và promoter rất giàu GC. Ngoài ra, còn có các thành phần đặc hiệu khác.

– Vị trí gắn vùng đặc hiệu mô. Là trình tự DNA tương tác với protein đặc hiệu mô để chỉ huy gen cấu trúc sản xuất ra từng protein đặc hiệu của từng mô.

– Vị trí gắn với vùng tăng cường phiên mã (enhancer). Còn gọi là gen tăng cường, là những trình tự DNA được gắn với các tác nhân hoạt hóa để kích thích phiên mã của các gen kề bên, chúng có thể tác động qua một khoảng cách xa và có thể tác động theo hai phía (từ 5’ hoặc 3’ tới).

1.2. Vùng được phiên mã

Bao gồm các exon và intron nằm xen kẽ. Đây là một đặc điểm để phân biệt với gen của prokaryote. Các exon và intron đều được phiên mã nhưng chỉ có các exon là được dịch mã. Các intron được bắt đầu bằng GT và kết thúc bằng AG. Các intron chiếm phần lớn trong mỗi gen và chúng sẽ được loại bỏ khỏi RNA mới được tổng hợp, còn các exon được nối với nhau để tạo nên mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA).

Ở hai đầu của vùng được phiên mã (coding region) còn có vùng 5’ không dịch mã (5’ untranslation region) và vùng 3’ không dịch mã (3’ untranslation region). Vùng 5’ không dịch mã được tính từ vị trí bắt đầu phiên mã cho đến codon khởi đầu ATG. Vùng 3’ không dịch mã bắt đầu từ codon kết thúc đến vị trí gắn đuôi poly(A).

1.3. Vùng 3’ không dịch mã

Chức năng chưa rõ, ở một số gen vùng này mang các trình tự điều hòa chuyên biệt.

2. Enzyme RNA polymerase của eukaryote

Tế bào eukaryote có đến ba loại RNA polymerase là RNA polymerase I (pol I), RNA polymerase II (pol II), và RNA polymerase III (pol III). Trong đó, RNA polymerase II đảm nhận việc phiên mã cho hầu hết các gen, chủ yếu là gen mã hóa cho protein. RNA polymerase I phiên mã các gen tiền thân của rRNA lớn và RNA polymerase III phiên mã các gen tRNA, một số gen RNA kích thước nhỏ của nhân (small nuclear, snRNA) và RNA 5S. Các RNA polymerase của eukaryote cũng bao gồm nhiều tiểu đơn vị, trong đó có những tiểu đơn vị tương ứng với các tiểu đơn vị trong enzyme của vi khuẩn.

Bảng 5.1. Các tiểu đơn vị của RNA polymerase

3. Các yếu tố giúp RNA polymerase khởi đầu phiên mã

Trong khi RNA polymerase của prokaryote chỉ cần thêm một yếu tố khởi đầu là σ để khởi động phiên mã thì RNA polymerase của eukaryote phải cần nhiều yếu tố khởi đầu, các yếu tố này được gọi là các yếu tố phiên mã tổng quát. Mặt khác, sự khởi đầu phiên mã ở eukaryote còn phải đối mặt với hiện tượng các DNA được đóng gói trong nucleosome và các dạng cao hơn của cấu trúc chromatin. Điều này đòi hỏi phải có nhiều yếu tố khác thêm vào để giúp khởi động quá trình phiên mã.

3.1. Vai trò của các yếu tố phiên mã tổng quát

Các yếu tố phiên mã tổng quát giúp RNA polymerase vào đúng vị trí trên promoter, giúp tách hai sợi đơn của DNA ra để phiên mã được bắt đầu, và giải phóng RNA polymerase khỏi promoter một khi phiên mã đã được khởi động xong để đi vào giai đoạn kéo dài.

Các yếu tố này được gọi là “tổng quát” vì chúng gắn trên tất cả các promoter được sử dụng bởi RNA polymerase II. Do đó, chúng được viết tắt là TFII (transcription factor for polymerase II), bao gồm TFIIA, TFIIB..

Như đã mô tả ở trên, nhiều promoter của eukaryote chứa hộp TATA. Hộp này được nhận dạng bởi một tiểu đơn vị của TFIID là TBP (TATA binding protein: protein gắn TATA). Phức hợp TBP-DNA tạo nên một cái nền để thu hút các TFII khác và RNA polymerase đến promoter. In vitro, các yếu tố phiên mã tổng quát khác đến gắn vào promoter theo thứ tự sau: TFIIA, TFIIB, TFIIF cùng RNA polymerase II, TFIIE và TFIIH. Sau đó, vùng promoter được mở xoắn. Khác với vi khuẩn, sự mở xoắn ở đây cần có năng lượng cung cấp từ sự thủy phân ATP nhờ TFIIH (yếu tố này có hoạt tính giống helicase).

Sau đó cũng xảy ra hiện tượng khởi đầu sẩy giống như ở prokaryote cho đến khi có sự biến đổi về cấu hình nhằm giải phóng RNA polymerase II khỏi promoter và đi vào giai đoạn kéo dài. Tuy nhiên, ở đây có một bước mà không tìm thấy ở prokaryote đó là sự gắn thêm các gốc phosphate vào đuôi của RNA polymerase (đuôi này còn được gọi là CTD: carboxyl terminal domain). Sự phosphoryl hóa này cũng được xúc tác bởi TFIIH nhờ hoạt tính protein kinase của nó (Hình 5.3).

3.2. Vai trò của các tác nhân hoạt hóa, phức hợp trung gian và enzyme biến đổi chromatin.

Ngoài các yếu tố phiên mã tổng quát, RNA polymerase II còn cần sự hỗ trợ của các yếu tố khác (Hình 5.4).

Đầu tiên, cần có các tác nhân hoạt hóa phiên mã (transcriptional activator) đến gắn vào các trình tự đặc hiệu trên DNA (các enhancer) để hấp dẫn RNA polymerase II đến vị trí bắt đầu phiên mã. Sự hấp dẫn này cần thiết để RNA polymerase II và các yếu tố phiên mã tổng quát vượt qua trở ngại khi gắn với DNA được đóng gói trong chromatin.

Tiếp đến, sự khởi đầu phiên mã in vivo còn cần sự hiện diện của các protein tạo thành phức hợp trung gian (mediator complex). Phức hợp này cho phép tác nhân hoạt hóa tác động tốt lên RNA polymerase II và các yếu tố phiên mã tổng quát.

Cuối cùng, sự phiên mã còn cần các enzyme biến đổi chromatin, bao gồm phức hợp
tái tạo mô hình chromatin (chromatin remodeling complex) và enzyme histone acetylase. Cả hai có tác dụng giúp cho bộ máy khởi đầu phiên mã có thể gắn vào DNA trong chromatin một cách dễ dàng.

Hình 5.3. Các yếu tố phiên mã tổng quát giúp khởi đầu phiên mã

Như vậy, có rất nhiều protein gắn vào promoter để khởi động sự phiên mã ở eukaryote. Thứ tự gắn của các protein này thay đổi đối với các gen khác nhau. Thực tế, một số có thể gắn với nhau ở xa DNA rồi được mang đến DNA dưới dạng phức hợp. Ví dụ: phức hợp trung gian, RNA polymerase II, và một số yếu tố phiên mã tổng quát có thể gắn với nhau trong nhân tương rồi được mang đến DNA.

Hình 5.4. Các tác nhân hoạt hóa, phức hợp trung gian và các thành phần biến đổi nucleosome trong phiên mã

4. Các yếu tố kích thích RNA polymerase II hoạt động trong giai đoạn kéo dài

Một khi RNA polymerase II bắt đầu chuyển sang giai đoạn kéo dài thì các yếu tố khởi đầu được loại bỏ như yếu tố phiên mã tổng quát và phức hợp trung gian. Thay vào đó, các yếu tố kích thích giai đoạn kéo dài được thu hút đến, bao gồm TFIIS và hSPT5. Ngoài ra, còn có các yếu tố khác được huy động để phục vụ cho quá trình biến đổi RNA mới được tổng hợp.

Giai đoạn kéo dài trong phiên mã được song hành chặt chẽ với các bước biến đổi RNA mới được tổng hợp. Như đã phân tích ở trên, có một bước quan trọng diễn ra khi chuyển từ giai đoạn khởi đầu sang kéo dài là sự phosphoryl hóa đuôi CTD của RNA polymerase II. Sự phosphoryl hóa này không những giúp RNA polymerase II thoát khỏi các protein ở vị trí bắt đầu phiên mã mà còn cho phép các protein khác đến kết hợp với đuôi để giúp quá trình kéo dài phân tử RNA và biến đổi RNA tiền thân

5. Quá trình biến đổi các RNA mới được tổng hợp

Ở eukaryote, sự phiên mã chỉ là bước đầu tiên trong một loạt các phản ứng bao gồm cả sự biến đổi hai đầu của mRNA tiền thân và loại bỏ các intron để tạo thành mRNA hoàn chỉnh.

5.1 Sự gắn mũ vào đầu 5’

Ngay khi RNA polymerase II vừa mới tạo ra khoảng 25 ribonucleotide của RNA, đầu 5’ của phân tử RNA này được biến đổi bằng cách gắn thêm một cái mũ là guanine có biến đổi hóa học. Phản ứng gắn mũ được thực hiện bởi ba loại enzyme là:

Phosphatase có tác dụng loại một gốc phosphate khỏi đầu 5’ của RNA mới sinh.

Guanylyl transferase gắn GMP bằng liên kết đảo ngược (5’ với 5’ thay vì 5’ với 3’) vào đầu 5’ của RNA đang được tổng hợp.

Methyl transferase gắn nhóm methyl vào guanosine (Hình 5.5).

Trong nhân, mũ gắn với một phức hợp protein được gọi là CBC (CAP-binding complex: phức hợp gắn mũ) giúp RNA được xử lý tốt và được chuyển ra ngoài. Mũ 5’ còn có vai trò quan trọng trong quá trình dịch mã mRNA trong bào tương.

5.2 Sự gắn đuôi poly(A) vào đầu 3’ và kết thúc phiên mã

Sự gắn đuôi poly(A) vào đầu 3’ được liên kết với sự kết thúc phiên mã. Các enzyme cần thiết cho các quá trình này được tập trung trên đuôi CTD của RNA polymerase II, bao gồm CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor: yếu tố đặc hiệu tách RNA và gắn đuôi polyA) và CstF (cleavage stimulation factor: yếu tố kích thích tách RNA).

Khi RNA polymerase di chuyển đến cuối gen, nó gặp những trình tự đặc hiệu

(được gọi là tín hiệu polyA). Trình tự này được phiên mã thành RNA, thúc đẩy chuyển CPSF và CstF đến gắn vào đoạn RNA này. Sau đó các protein khác sẽ được tập trung đến để khởi đầu sự tách rời RNA và gắn đuôi poly(A).

Sự gắn đuôi được thực hiện bởi enzyme poly(A) polymerase (PAP). Enzyme này thêm khoảng từ vài chục đến 200-250 adenine vào đầu 3’ của RNA đã được tách ra. Enzyme PAP sử dụng ATP làm cơ chất và hoạt động giống RNA polymerase, tuy nhiên không có khuôn mẫu. Người ta vẫn chưa rõ yếu tố nào quyết định chiều dài của đuôi nhưng quá trình này có liên quan đến các protein gắn đặc hiệu với đuôi poly(A).

Sau khi RNA được tách ra và gắn đuôi poly(A), RNA polymerase vẫn chưa kết thúc phiên mã ngay. Nó còn tiếp tục di chuyển dọc theo khuôn mẫu và tạo ra một phân tử RNA thứ hai có thể dài hàng trăm nucleotide trước khi kết thúc. Sau đó, RNA polymerase được tách ra khỏi khuôn mẫu, giải phóng RNA mới và RNA này sẽ bị giáng hóa.

Hình 5.5. Phản ứng gắn mũ vào đầu 5’ của RNA

5.3. Quá trình cắt nối gen (splicing)

Đây là quá trình loại bỏ các intron và nối các exon lại với nhau. Quá trình này được thực hiện phần lớn bởi các RNA thay vì protein.

Các phân tử RNA này tương đối ngắn (dưới 200 nucleotide) được gọi là snRNA. Có năm loại liên quan đến dạng cắt nối chính là U1, U2, U4, U5 và U6. Mỗi snRNA được kết hợp với nhiều protein để hình thành snRNP.

Có ba trình tự nằm trên intron đóng vai trò quan trọng trong quá trình cắt nối là: vị trí cắt nối đầu 5’, vị trí phân nhánh là một trình tự giàu các pyrimidine bao quanh một nucleotide adenine ở gần đầu 3’, và vị trí cắt nối đầu 3’.

Đầu tiên, vị trí cắt nối đầu 5’ được nhận dạng bởi U1 snRNP bằng sự bắt cặp các base bổ sung. Vị trí phân nhánh cũng được nhận dạng bởi BBP (branch-point binding protein: protein gắn vị trí phân nhánh) và U2AF. U2 snRNP đến thay thế BBP (nhờ U2AF giúp đỡ). Sự bắt cặp base giữa U2 snRNA và vị trí phân nhánh làm thừa ra một gốc A không bắt cặp và sẵn sàng phản ứng với vị trí 5’. Sau đó U4 và U6 snRNP cùng U5 snRNP đến gắn với phức hợp trên.

Dạng U1 rời khỏi phức hợp và U6 thế chỗ U1 tại vị trí cắt nối đầu 5’. U4 được giải phóng để U6 tương tác với U2. Điều này làm cho vị trí cắt nối đầu 5’ và vị trí phân nhánh được đặt kề nhau và tạo điều kiện cho phản ứng cắt nối xảy ra. Nucleotide adenine đặc hiệu ở vị trí phân nhánh tấn công và cắt intron ở vị trí đầu 5’. Đồng thời có một liên kết đồng hóa trị xảy ra giữa A ở vị trí phân nhánh và đầu 5’ của intron tạo nên một cấu trúc hình thòng lọng. Đầu 3’ của exon trước nối với đầu 5’ của exon kế tiếp và thòng lọng intron được giải phóng (Hình 5.6).

V. Phiên mã ngược

Phiên mã ngược là quá trình tổng hợp DNA dựa trên khuôn mẫu RNA. Quá trình này được xúc tác bởi một loại enzyme đặc biệt gọi là enzyme phiên mã ngược (RT: reverse transcriptase). Enzyme này có cả hoạt tính DNA polymerase và hoạt tính RNase H. Cũng giống như DNA polymerase trong quá trình tái bản DNA, enzyme phiên mã ngược đòi hỏi phải có primer (mồi) đặc biệt để tổng hợp nên DNA mới.

Hình 5.6. Quá trình cắt nối gen

Enzyme phiên mã ngược được phát hiện lần đầu tiên ở retrovirus. Sau khi các retrovirus đi vào tế bào vật chủ, genome của RNA của nó sẽ được phiên mã ngược thành DNA sợi đôi, rồi tích hợp vào DNA của vật chủ. Quá trình phiên mã ngược này khá phức tạp, người ta có thể tóm tắt thành 10 bước như sau:

– Bước 1: Một tRNA của tế bào có tính đặc hiệu với retrovirus đóng vai trò primer để khởi phát quá trình phiên mã ngược. Primer lai với vùng bổ sung trên genome của RNA của retrovirus gọi là vị trí gắn primer (PBS: primer-binding site).

– Bước 2: Một đoạn DNA được kéo dài từ tRNA có trình tự bổ sung với trình tự của genome RNA của retrovirus.

– Bước 3: Trình tự R đầu 5’ và U5 của virus bị loại bỏ bởi RNase H.

– Bước 4: Đổi khuôn mẫu lần thứ nhất (first template exchange) còn được gọi là “nhảy” lần một: DNA đến lai với trình tự R còn lại ở đầu 3′.

– Bước 5: Một sợi DNA được kéo dài từ đầu 3’.

– Bước 6: Hầu hết RNA virus bị loại bỏ bởi RNase H.

– Bước 7: Sợi DNA thứ hai được kéo dài từ RNA còn lại của virus.

– Bước 8: Cả tRNA và phần RNA còn lại của virus bị loại bỏ bởi RNase H.

– Bước 9: Đổi khuôn mẫu lần thứ hai (“nhảy” lần hai): vùng PBS của sợi DNA thứ hai đến lai với vùng PBS của sợi thứ nhất. – Bước 10: Kéo dài cả hai sợi DNA.

R là những trình tự lặp lại trên genome của retrovirus (ở đầu 5’ và 3’), U5 và U3 là những vùng mã hóa cho những tín hiệu tích hợp ở đầu 5’ và 3’ (Hình 5.7).

Ngày nay, người ta cũng phát hiện enzyme phiên mã ngược ở các virus động vật khác như hepadnavirus, và ở các virus thực vật như caulimovirus. Tất cả chúng được gọi là retrovirus. Ngoài ra, người ta còn phát hiện hoạt tính enzyme phiên mã ngược ở một số dòng của myxobacteria và E. coli. Enzyme phiên mã ngược đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong sinh học phân tử. Nó giúp các nghiên cứu viên phiên mã ngược mRNA của tế bào thành cDNA (complementary DNA), rồi sau đó có thể khuếch đại, tạo dòng và biểu hiện bằng các phương pháp đặc biệt. Sự phát hiện enzyme phiên mã ngược ở nhiều loại virus và đặc biệt là ở một số vi khuẩn cũng có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu sự tiến hóa của hệ thống sinh giới.

Hình 5.7. Quá trình phiên mã ngược của retrovirus

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, Hà Nội.
2. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K and Walter P. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Garland Science Publishing, Inc. New York, USA.
3. Flint SJ. 2000. Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington, USA.
4. Gelehrter TD, Collins FS and Ginsburg D. 1998. Principles of Medical Genetics. 2nd ed. Williams & Wilkins Company, Baltimore, USA.
5. Griffiths AJF, Wessler SR, Lewontin RC, Gelbart WM, Suzuki DT and Miller JH.
2005. An Introduction to Genetic Analysis. WH Freeman & Co. New York, USA.
6. Karp G. 2002. Cell and Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. New York, USA.
7. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M and Losick R. 2004. Molecular Biology of the Gene. Pearson Education, Inc./Benjamin Cummings Publishing, San Francisco, USA.

Nguồn: Gióa trình Sinh học phân tử – Nguyễn Hoàng Lộc (chủ biên)

 

Liệu pháp miễn dịch ung thư

Ung thư là vấn đề nhức mối hiện nay bởi vì ung thư gây ra hậu quả nghiêm trọng về kinh tế, sức khỏe và tính mạng con người. Trong các phương pháp điều trị ung thư, phương pháp liệu pháp miễn dịch đang được nghiên cứu một cách kỹ lưỡng về cách thức hoạt động, khả năng phát triển và cơ chất hỗ trợ đi kèm. Một số phương pháp chính của liệu pháp miễn dịch ung thư là: Kháng thể đơn dòng, chất ức chế rào cản miễn dịch, vaccine ung thư, miễn dịch không đặc hiệu.

(more…)

 

Tái bản DNA

I. Chứng minh tái bản DNA theo cơ chế bán bảo thủ tái 

1. Cơ chế tái bản bán bảo thủ

1.1. Cơ chế tái bản ở prokaryote

Đặc điểm cơ bản của sự tái bản đó là tái bản theo phương thức bán bảo thủ (semiconservative replication). Tái bản bán bảo thủ nghĩa là trong hai chuỗi của tất cả các phân tử DNA bao giờ cũng có:

(more…)

 

Cấu trúc và chức năng của gen

I. Định nghĩa gen

Chúng ta có thể điểm qua những mốc chính trong lịch sử nghiên cứu về gen như sau:
Mendel (1865) là người đầu tiên đưa ra khái niệm nhân tố di truyền. Johansen (1909) đã đề xuất thuật ngữ gen (từ genos, nghĩa là sản sinh, nguồn gốc) để chỉ nhân tố di truyền xác định một tính trạng nào đó. Sau đó, Morgan trong những năm 1920 đã cụ thể hóa khái niệm về gen, khẳng định nó nằm trên nhiễm sắc thể và chiếm một locus nhất định, gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng.

(more…)

 

Contributor

  • Không Gian Sinh Học bộ phân học thuật của SBC Scientific, nguồn tài trợ của chúng tôi từ quỹ hoạt động kinh doanh của SBC Scientific. Khonggiansinhhoc.com là một website cung cấp các kiến thức về khoa học phổ thông, chuyên sâu hơn là về các lĩnh vực sinh học, y học, năng lượng sạch…

    Không Gian Sinh Học được thành lập từ đầu năm 2015, bởi các nhân viên của SBC và cộng tác viên có trình độ chuyên môn về công nghệ sinh học, công nghệ hóa học, thực phẩm, y dược, môi trường…

    Chúng tôi luôn nổ lực để đem lại nhiều kiến thức bổ ích đến cho mọi người. Những kiến thức được viết sao cho dễ hiểu và xúc tích nhất.
    BIOSPACE
    Khu Công Nghệ Cao, Xa Lộ Hà Nội, Quận 9, Tp. HCM.
    Email: info@khonggiansinhhoc.com
    Hotline: 0945677929

     
    Contributor