Khử trùng invirto cho Lan

Thiết lập nuôi cấy in vitro vô trùng cho Dendrobium, hoặc cho bất kỳ cây trồng nào trên thực tế, là bước quan trọng nhất để phát triển nuôi cấy mô in vitro hiệu quả trong quy trình nhân giống. Thành công trong nuôi cấy vô trùng ban đầu sẽ góp phần tạo ra thành công trong nuôi cấy in vitro có ành hưởng đến sự khởi đầu và hình thành mô sẹo và/hoặc thể tiền chồi (PLBs).

Sự kích thích, tái tạo hoặc nhân chồi, và sự chuẩn bị và tăng trưởng của cây con thích hợp để thích nghi với khí hậu. Từ khóa: nuôi cấy vô trùng, sự nhiễm bẩn, Dendrobium, chất tẩy, sự khử trùng, nguồn mẫu cấy, quy trình

TỔNG QUAN

Sự khởi đầu của việc nuôi cấy vô trùng liên quan chặt chẽ đến sự lựa chọn nguồn mẫu cấy thích hợp và sự chuẩn bị mẫu cấy, bao gồm cả việc tiền xử lý các mẫu (in vivo) nếu cần thiết và các bước khử trùng sau đó. Sự cẩn trọng trong việc lựa chọn mẫu cấy và việc áp dụng một quy trình khử trùng thích hợp có thể thành công trong việc giảm, hoặc loại bỏ sự nhiễm bẩn trong nuôi cấy in vitro đồng thời giảm tác động tiêu cực lên mô tế bào thực vật và sự tái sinh cây con. Nhiều phương pháp nuôi cấy vô trùng độc đáo cho loài Dendrobium đã được báo cáo trong tài liệu này, được mô tả rất chi tiết đối với các mô hoặc kiểu gen cụ thể, và bài viết này không chỉ làm nổi bật các chi tiết của các quy trình mà còn cung cấp những lời khuyên thiết thực cho những người mới vào nghề và thậm chí cả những nhà nghiên nghiên cứu về lan muốn nghiên cứu Dendrobium in vitro, mặc dù nó được cảnh báo rằng hiện nay không có phương pháp nuôi cấy vô trùng phổ quát có thể được áp dụng cho tất cả các điều kiện, tất cả các mẫu cấy hoặc tất cả các kiểu gene.

EX VITRO ĐẾN IN VITRO: SỰ CẦN THIẾT CỦA VIỆC KHỬ TRÙNG BỀ MẶT MÔ THỰC VẬT ĐỂ THIẾT LẬP QUY TRÌNH NUÔI CẤY MÔ DENDROBIUM IN VITRO

Khía cạnh quan trọng nhất trong việc thiết lập một hệ thống nuôi cấy mô hiệu quả từ các mẫu cấy hoặc các bộ phận của cây lấy từ vật liệu ex vitro, như những cây từ nhà kính hoặc từ đồng ruộng, là quá trình khử trùng (George và Debergh 2008). Mặc dù có nhiều khả năng các cây trồng trên đồng ruộng sẽ chứa nhiều chất gây tạp nhiễm từ đất và không khí hơn các cây trồng trong nhà kính (Niedz và Bausher 2002) và các cây trồng trong đất theo kiểu thông thường sẽ bị nhiễm vi sinh vật cao hơn các cây trồng trong môi trường nước, trong mọi trường hợp, vật liệu thực vật cần được chuẩn bị cho nuôi cấy in vitro, thường là trong ba bước sau khi rửa ban đầu và loại bỏ các chất tạp nhiễm thô (Hall 1999): (A) xử lý bằng dung dịch khử trùng (ví dụ: ethanol 70 %), sau đó rửa bằng nước cất vô trùng (SDW) hoặc không; (B) xử lý bằng dung dịch khử trùng khác (ví dụ: sodium hypochlorite (NaOCl)) và (C) cuối cùng rửa bằng SDW ít nhất ba lần. Có sự khác biệt về loại, trình tự và nồng độ các chất khử trùng được sử dụng, sự kết hợp của chúng và thời gian tiếp xúc (Hall 1999, Onwubiko và cộng sự, 2013). Các khía cạnh như độ tuổi của cây lấy mẫu, nhiệt độ, độ ẩm tương đối (RH), thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng, tưới tiêu và bón phân, cũng như loại và kích thước của mẫu cấy, tính bảo lưu cục bộ, kiểu gen, mùa vụ khi thu thập các mẫu cấy, thời gian quá trình khử trùng và nồng độ chất khử trùng sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình khử trùng, được giải thích chi tiết hơn trong phần tiếp theo của bài tổng quan này (Traore và cộng sự, 2005., George và Debergh 2008, Dobránszki và Teixeira da Silva 2010, Mihaljevic và cộng sự, 2013). Mục tiêu chính của các bước khử trùng là để tìm ra sự cân bằng giữa giảm lây nhiễm và sự sống sót mẫu cấy và tái sinh, bị ảnh hưởng mạnh bởi trạng thái sinh lý của các mẫu cấy và chất khử trùng được sử dụng vì chúng thường độc đối với tế bào thực vật. Sự phát triển nhanh chóng của các mẫu cấy, hoặc sự úa vàng của mẫu cấy, có thể làm cho các mẫu cấy mô trở nên mỏng đi, dẫn tới chất khử trùng xâm nhập vào sâu trong các mô (Traore và cộng sự, 2005, Jan và cộng sự, 2013). Độ sâu mà chất khử trùng có thể xâm nhập vào mô cũng rất quan trọng và có thể quan trọng hơn đối với các mô như các đầu rễ hoặc củ tiếp xúc trực tiếp với vi sinh vật trong đất nhiều hơn các bộ phận khác như bao phấn có thể được bảo vệ bởi các mô xung quanh khác như các cánh hoa (Sugii 2011). Những hiểu biết về các yếu tố này có thể quyết định sự thành công của sự tăng trưởng, tái sinh hoặc nảy mầm vì điều này chắc chắn sẽ liên quan đến mức độ nhiễm bẩn.

Việc sử dụng những nguyên tắc này, bài tổng quan này nhằm tìm ra quy trình khử trùng đã được sử dụng để chuẩn bị vật liệu thực vật có nguồn gốc in vivo để nuôi cấy in vitro cho Dendrobium vì môi trường in vitro đóng vai trò như một công cụ quan trọng cho nhiều tiến bộ công nghệ sinh học, sự nảy mầm cộng sinh và không cộng sinh và tiến bộ về phân tử, bao gồm chuyển đổi gene (Teixeira da Silva và cộng sự, 2015a, 2015b, 2015c, 2016). Dendrobium là một trong những loài lan lớn nhất, với khoảng 1400 loài (Jin và cộng sự 2009), và có tầm quan trọng về trang trí và làm thuốc (Takamiya và cộng sự, 2011) và do đó phục vụ như là một loài thực vật tối ưu để tiến hành nghiên cứu chủ đề này vì hàng chục nghiên cứu về nuôi cấy Dendrobium in vitro đã được tiến hành. Trong sản xuất thương mại, những quy trình tốt được thiết lập đã được phát triển từ thử nghiệm ban đầu và sai sót (Teixeira da Silva và Winarto 2015, 2016), nhưng đối với các nhà nghiên cứu lan mới làm quen hay nhà nghiên cứu thực vật muốn tìm hiểu để thiết lập quá trình nuôi cấy Dendrobium in vitro ban đầu từ nguồn vật liệu in vivo sẽ không có hướng đi dễ dàng từ nguồn tài liệu rộng lớn để hiểu làm thế nào xử lý tốt nhất vật liệu nuôi cấy để thiết lập một quy trình nuôi cấy in vitro ban đầu. Do đó, bài đánh giá này cũng phục vụ một mục đích rất quan trọng: khảo sát và kiểm tra nguồn tài liệu rộng lớn này để phân tích và xác định các điều kiện đối với các mô từ nhiều nguồn khác nhau và các kiểu gen khác nhau trong việc khử trùng để có thể tái sinh sau này. Ba nghiên cứu liên quan đến quy trình khử trùng cho loài Dendrobium vào năm 2015 và cho đến tháng 3 năm 2016.

LỰA CHỌN CÂY MẸ IN VIVO VÀ MẪU CẤY

Hầu hết các tác giả khi làm việc về nuôi cấy Dendrobium in vitro đều lựa chọn cây mẹ phát triển trong những chậu trong vườn ươm (Malabadi và cộng sự, 2005, Sujjaritthurakarn và Kanchanapoom 2011, Kumari và cộng sự, 2013), nhà kính (Asghar và cộng sự, 2011, Paul và cộng sự, 2012) hoặc nhà lưới (Lone và cộng sự 2008, Dohling và cộng sự, 2012, Vijayakumar và cộng sự, 2012.). Quả và hạt giống cũng được thu thập từ các môi trường tự nhiên hoang dã, như D. huoshanense (Luo và cộng sự 2009) và D. densiflorum (Luo và cộng sự, 2008) hoặc từ các vườn thực vật (Pradhan và cộng sự, 2013) (Tab. 1). Tất cả các môi trường tăng trưởng này không tránh được không bị tạp nhiễm do vi khuẩn, và do đó chúng cần phải được xử lý (khử trùng) trước khi có thể được sử dụng trong môi trường in vitro, do đó kích thích sự phát triển của mô thực vật qua sự phát triển của vi sinh vật.

Nguồn, kích cỡ và độ tuổi của các mẫu cấy là một số yếu tố ảnh hưởng đến thành công của việc khử trùng. Kumari và cộng sự (2013) đã sử dụng các chồi của D. Sonia ‘Earsakul’, dài 8-12 cm với 3-5 mắt ngủ được lấy từ các chồi 2-3 tuần tuổi (‘keikies’), làm mẫu cấy để bắt đầu nuôi cấy vô trùng. Trong nghiên cứu của họ, 66.7 đến 100% các mẫu cấy đã sống sót (2.33 chồi/mẫu cấy với BA 4.0 mg/dm3). Ferreira và cộng sự (2006), đã sử dụng các chồi bên dài 8 cm từ các cây D. ‘Second Love’ (loại Nobile) trưởng thành, có khoảng 20% mẫu cấy bị tạp nhiễm và chỉ có 60% chồi nụ phát triển thành các chồi. Asghar và cộng sự (Năm 2011), cũng sử dụng các mẫu chồi dài 8 cm để nuôi cấy D. nobile ‘Emma White’, chỉ có 22.5% mẫu cấy sống sót trong phương pháp xử lý tốt nhất là ngâm và sục liên tục mẫu cấy với 10% NaOCl (chlorine hoạt tính 6-14%) trong 8 phút, tiếp theo là rửa lại 4-5 lần, nhưng mức độ tạp nhiễm cao vẫn được quan sát thấy: nhiễm vi khuẩn 42.5% và nhiễm nấm 30%. Winarto và các cộng sự (2013) đã sử dụng các mẫu chồi đỉnh D. ‘Zahra FR 62’ dài 0.4 cm làm mẫu cấy để bắt đầu sự hình thành các thể tiền chồi (PLB). PLBs được nuôi cấy thứ cấp sau mỗi 15 ngày, với 85% các mẫu cấy thành công trong việc tạo ra mô sẹo xanh trong phân lớn mẫu cấy; ban đầu, mô sẹo có màu xanh lá đến xanh đậm và nhỏ sau đó trở nên rời rạc trong nuôi cấy thứ cấp tiếp theo và sản sinh ra PLB một cách dễ dàng, và chỉ có 15% mẫu cấy bị tạp nhiễm bởi vi khuẩn và/hoặc bị hóa nâu (Winarto và cộng sự, 2013). Trong nuôi cấy lỏng, có sự trầy xước ở bề mặt của mẫu mô sẹo dẫn tới sự hóa nâu của mô sẹo, gây ra bởi các hợp chất phenol (Kaewubon và cộng sự, 2015) và việc sử dụng các chất khử trừng làm thay đổi màu sắc của các mẫu cấy từ xanh lá đến xanh lá nhạt/trắng, như là một tín hiệu về sự tổn thương mô tế bào (Hình 1F-H). Nguồn mẫu cấy, kích cỡ và biện pháp xử lý giống nhau (xem hình 1C-E), nhưng với độ phản ứng cao hơn (87%) được ghi nhận ở D. ‘Gradita 31’ (Winarto và Rachmawati 2013). Sự giao thoa giữa lựa chọn mẫu cấy phù hợp, quy trình khử trùng và loại bỏ sự hóa nâu, điển hình cho nuôi cấy mô sẹo Dendrobium còn non (Kaewubon và cộng sự, 2015) sẽ xác định sự thành công của việc kích thích mô sẹo và chồi. Mặc dù các quy trình được mô tả trong Bảng 1 bởi Winarto và cộng sự có hiệu quả đối với một số cây, nhưng không được thử nghiệm cho tất cả các cây.

Nhiều tài liệu (Bảng 1) đã mô tả các điều kiện môi trường trong đó các cây mẹ được trồng, thu thập và chuẩn bị tốt nhất. Lo và cộng sự (2004) chỉ ra rằng loài D. tosaense thu thập được từ môi trường tự nhiên ở Đài Loan được trồng trong chậu có đường kính 13.5 cm và cao 10.7 cm, chứa chất nền là cây dương xỉ; Cây trồng được duy trì trong nhà kính với độ ẩm 70% RH và nhiệt độ ngày/đêm là 25/20°C. Trong điều kiện này, các quả thể 12 tuần tuổi được hình thành sau khi thụ phấn bằng tay tạo ra số cây con cao nhất trong môi trường ½ MS so với các quả thể ở độ tuổi khác (8, 9, 10, 11, 13, 14 tuần tuổi) và ở các môi trường khác (MS, KC, VW). Loài D. nobile thu thập được từ tự nhiên ở Ấn Độ đã được sử dụng làm cây mẹ, được nuôi cấy trong các chậu và trồng trong điều kiện nhà kính. Các chồi đỉnh dài 0.5-0.8 cm được thu hoạch từ các cây mẹ và được sử dụng làm nguồn mẫu cấy (Malabadi và cộng sự, 2005). Các củ bẹ của D. microbulbon thu thập được từ rừng Nam Gujarat (Ấn Độ) đã được sử dụng làm nguồn mẫu cấy chính (Sharma và cộng sự, 2007). Những quả thể trưởng thành của D. densiflorum thu được từ tỉnh Vân Nam, Trung Quốc được sử dụng làm nguồn mẫu cấy (Luo và cộng sự, 2008). Giống D. transparens được thu thập từ môi trường tự nhiên ở Imphal (Ấn Độ) và được giữ ở chỗ mát với ánh sáng mặt trời giảm 50%. Hoa đã được thụ phấn bằng tay vào ngày thứ hai hoa nở vì hoa chỉ kéo dài được 3-5 ngày và quả thể được thu hoạch sau khi thụ phấn 120 ngày và được sử dụng như là các mẫu cấy mẹ cho sự nảy mầm in vitro (Sunitibala và Kishor 2009). Giống D. nanum, thu thập ở vùng KMTR, Nam Ấn Độ, được duy trì trong nhà kính và các chồi 5 cm được sử dụng làm nguồn mẫu cấy (Maridass và cộng sự, 2010). Ở Shillong, Ấn Độ, những cây D. chrysanthum khỏe mạnh được trồng trong các chậu trong nhà kính, và sau khi hoa được thụ phấn bằng tay, và các quả đậu già (8 tháng tuổi) được sử dụng làm mẫu cấy (Hajong và cộng sự, 2010). Các quả đậu D. chrysanthum trưởng thành 3 tháng tuổi và phát triển tốt đã được sử dụng làm mẫu cấy cho những thí nghiệm nảy mầm (Sujjaritthurakarn và Kanchanapoom 2011). Những quả thể già (15 tháng) của D. aphyllum được thu thập từ môi trường sống hoang dã ở Sarisha, Ấn Độ (Dutta và cộng sự, 2011). D. chrysanthum, D. hookerianum và D. longicornu đã được thu thập từ Meghalaya, Ấn Độ, được trồng trong nhà kính và các mẫu cấy thân (dài 1-2 cm), mỗi cây bao gồm một mắt và chồi nách, được sử dụng làm các mẫu cấy (Dohling và cộng sự. 2012). Paul và cộng sự (2012) đã sử dụng những quả thể màu xanh tía của D. hookerianum thu hoạch được sau 8-9 tháng kể từ thụ phấn. Vijayakumar và cộng sự (2012) đã sử dụng việc thụ phấn tay vào ngày thứ hai sau khi nở hoa để thu được những quả từ cây D.posgattum mà được thu thập từ môi trường tự nhiên sau đó trồng chúng dưới bóng mát (75% bóng mát). Chồi dài 8-12 cm với 3-5 mắt đã được thu hoạch từ các cây non 2-3 tuần tuổi của các cây mẹ trồng trong nhà kính được sử dụng làm mẫu cấy phù hợp (Kumari và cộng sự, 2013).
Đối với D. ‘Zahra FR 62’ và D. ‘Gradita 31’, các cây mẹ được duy trì dưới bóng mát trong nhà kính (75%) trong hỗn hợp thân khô cây thiên tuế (Cycas rumphii) và than củi (1:1, v/v) bằng cách tưới nước mỗi sáng lúc 7:00-8:00 và bón phân 2g/dm3 N:P:K tỷ lệ 20:20:20 và dùng 2 ml/dm3 phân bón lỏng BioSugih hai lần một tuần để kích thích sinh trưởng của cây mẹ và tăng tốc độ phát triển của củ bẹ mới.

Bảng 1: Quy trình khử trùng cho Dendrobium in vitro (ưu tiên đến sau 2002)

 

Loài hoặc giống Bộ phận/ mô khử trùng Mục đích thực nghiệm Quy trình khử trùng bề mặt Môi trường nuôi cấy tối ưu Điều kiện tăng trưởng Sự nhiễm bẩn sau khi khử trùng Mẫu cấy sống sót Tham khảo
D. transparens Hạt giống Môi trường nuôi cấy 1% HgCl2g70% EtOH, thời gian khử trùng NR MS, pH NR 22oC,16-hPP, 40.5 mmol m-2s-1, RH NR NR 78% G Alam và cộng sự 2002
D. aphyllum Hạt giống (quả nang 4-5 tháng tuổi) Môi trường nuôi cấy và hoạt động khác nhau 0.2% HgCl2 10 min → 100% EtOH 10-12 s → 1 × SDW PM lỏng hoặc rắn rắn với 0.8% agar + 2% suc + 1 mgždm-3 NAA + 3 mgždm-3BA + 1.5 mgždm-3Kin. Sự hình thành chồi cao nhất từ mắt ngủ trong MS + 3% suc + 1 mg dm-3 BA + 10% CW. 25 ± 2°C, 14-h PP, PPFD và RH NR NR Sự nảy mầm không xác định số lượng. Tối đa 5.52 chồi/ mắt ngủ. Bhadra và cộng sự 2002
D. crumenatum Chồi  nách Môi trường nuôi cấy RTW + 1 vài giọt Teepol™ → 20% Clorox® + 1-2 giọt Tween®-20, 20 min; 10% Clorox®, 10 min; 5% Clorox®, 5 min → rửa 2-3 × trong SDW VW + 10% CW + 2% suc + 0.02% Gelrite® cho sự hình thành PLB; VW + 0.1 1 mgždm-3 NAA + 1 mgždm-3 BA + 2 gždm-3 peptone + 2 gždm-3 AC + 2% suc + 0.02% Gelrite® cho sự tăng sinh mô sẹo. 25 ± 2°C, 16-h PP, 20 μmol m-2s-1, RH NR NR 215 mg FW của mô sẹo; 11.9 chồi/g PLBs Meesawat và Kanchanapoom 2002
D. tosaense Quả nang 8-14 tháng tuổi Môi trường nuôi cấy và các phức chất 70% EtOH 30s → 1%NaOCl + 2 giọt of Tween®-20/100 ml, đánh siêu âm 10 min → 5 × SDW Hạt nảy mầm trong ½ MS + 3% suc + 0.6% agar; và hình thành cây con trong MS + 1.5% suc + 0.9% agar + 8% BH hoặc CW hoặc PH, pH 5.7 ± 0.1 Trong tối 16 tuần (nảy mầm) + 25/20°C (ngày/đêm), 16-h PP, 40 μmol m-2 s-1, 70% RH NR 67.5 số lượng hạt nảy mầm/mẫu thử nghiệm Lo và cộng sự 2004
D. ‘Sonia’ 1 cm2 lá từ chồi Môi trường nuôi cấy khác nhau Cây con in vitro MS lỏng + 0.1 mgždm-3 BA + 1.0 mgždm-3 NAA 26 ± 2°C, 16-h PP, 50 μmol m-2s-1, RH NR NR NR Puchooa 2004
D. nobile Chồi đỉnh 0.5-0.8 cm g những phần cắt ngang dày 1-5 mm Nồng độ Triacontanol DW → 0.1% streptomycin 20 s → 70% EtOH 50 s → 0.1% HgCl2 2 min → 1 × SDW Mitra và cộng sự. (1976) + 3% suc + 0.7% agar + 0.5 g dm-3 meso-inositol + 1.0 g dm-3 casein hydrolysate + 0.25 g dm-3 peptone + 0.20 g dm-3 p-amino-benzoic acid + 0.1 g dm-3 biotin + 4 μg TRIA, pH 5.8 25 ± 3°C, PPNR, 100 μmol m-2 s-1, RH NR NR 93.5 ± 8.1% mẫu cấy đáp ứng và 16.3 ± 1.8 chồi/mẫu cấy Malabadi và cộng sự 2005
D. fimbriatum Quả nang xanh Nồng độ NAA và CW RTW → 5% Tween®-20 10 min → DW → 0.1% HgCl2 15 min → 3 × SDW VW + 15% CW + 0.1 mgždm-3 NAA + 0.8% agar, pH 5.4 20 ± 1°C, trong tối 30-d + 16-h PP, 26-59 μmol m-2 s-1, RH NR NR 80-90% G Sharma và cộng sự 2005
D. nobile ‘Second Love’ Chồi nách (8cm) g tách chồi nách Nồng độ thuốc tẩy thương mại và TZA. Chất tẩy và RTW → 96% EtOH 2 min → 1% NaOCl 30 min → 3 × SDW → tách chồi nách → NaOCl 1 min → SDW 10 min VW lỏng, FeEDTA và những thành phần vi lượng khác từ MS + 2% suc + 0.4 mgždm-3thiamine + 0.1 gždm-3 myo-inositol + 0.1 mgždm-3 TDZ, pH 5.85 ± 0.1 26 ± 1°C, 16-h PP, 35-45 μmol m-2 s-1, RH NR <20%  không có các tác động nguy hại phát hiện được 6.4 chồi/mẫu cấy Ferreira và cộng sự 2006
D. cochliodes Hạt giống Sự kết hợp PGR và các phức chất 70% (v/v) EtOH 30 s → 0.1% HgCl2 10 min → rửa trong 5 x SDW N6 + 10% CW, pH 5.2-5.4 25 ± 2°C, 12-h PP, 3040 µmol m-2 s-1 NR 95% G Yang và cộng sự 2006
D. strongylanthum Quả nang với hạt trưởng thành (tuổi NR) Môi trường cơ bản và PGRs 70% EtOH 30 s → 3% NaOCl + 2-3 giọt Tween®-80 / 500 ml 20 min → 4-5 × SDW ½ MS + 2% suc + 0.2 mg·dm-3 NAA + 0.7% agar, pH NR 26°C, 10-h PP, 13.527.0 µmol m-2 s-1, RH NR NR Thể tiền chồi xanh với khả năng biệt hóa cao nhất Kong và cộng sự 2007
D. aphyllum Quả nang trưởng thành chưa nứt (tuổi NR) Môi trường nuôi cấy Rửa với extran 1.0% (chất tẩy) → 70% EtOH 30 s → 0.1% HgCl15 min → 2 × SDW Knudson (1946) C + agar (nồng độ NR), pH 5.6-5.8 25 ± 2°C, 16-h PP, 27.0-40.5 µmol m-2 s-1, RH NR NR 76-100% G, 14-d đến bắt đầu nảy mầm Das và cộng sự 2008
D. phalaenopsis Hạt giống trưởng thành (9 tháng sau khi thụ phấn) Chọn lọc kiểu gene in vitro 2.0-2.5% NaOCl 10 min ½ MS + 1 g·dm-3 AC + 0.7% agar, pH 5.8 25°C, 16-h PP,  27 µmol m-2 s-1,  RH NR NR NR Lone và cộng sự 2008
D. densiflorum Quả nang trưởng thành, tuổi NR PGRs và lanthanoids 70% EtOH 30 s → 1% NaOCl 60 min → 3 × SDW MS + 3% suc + 0.7% agar 25 ± 2°C, 16-h PP,  30 µmol m-2 s-1,  80% RH NR NR Luo và cộng sự 2008
D. cvàidum Hạt giống trưởng thành, tuổi NR PGRs NR MS + 0.2 mg·dm-3NAA, pH 5.8 25 ± 2°C, trong tối  40 days, 70-75% RH NR NR Zhao và cộng sự 2008
D. huoshanense Quả nang trưởng thành, tuổi NR CK, CH và nhiệt độ tiền xử lý 70% EtOH 30 s → 1% NaOCl 60 min → 3 × SDW MS + 3% suc + 0.7% agar 25 ± 2°C, 16-h PP,  30 µmol m-2 s-1,  80% RH NR NR Luo và cộng sự 2009
Dendrobium  (species unspecified) Quả nang xanh Môi trường nuôi cấy RTW → 5% Tween 20 20 min → 0.1% HgCl2 15 min → 3 × SDW Knudson C + 0.1 mg·dm-3 NAA + 15% CW + 0.8% agar, pH 5.4 20 ± 1°C; trong tối 30 d sau đó 16-h PP, 33.75 µmol m-2 s-1trong 45 d; RH NR NR 80-90% G Soundararajan 2009
D. transparens Quả nang xanh 120-d sau thụ phấn Sự kết hợp PGR Labolene 10 min → 70% EtOH 30 s → 0.1% HgCl2 15 min → 4-5 × SDW ½ MS + 15 mg·dm-3suc** + ½ B5 vitamins + 0.4% agar, pH 5.8 25 ± 2°C với 16-h PP, PPFD và RH NR NR NR Sunitibala và Kishor 2009
D. nobile Hạt giống trưởng thành (180 DAP) Dung tích bình Lắc với 5% NaOCl → 4 × SDW MS + 0.7% BP + 0.7% agar,  pH 6.0 25°C, 12-h PP, 40 µmol m-2 s-1, RH NR NR Cao 1.11-2.24 cm, 1.47-1.95 lá/hạt nảy mầm de Moraes và cộng sự 2010
D. chrysanthum Hạt giống trưởng thành (8 tháng tuổi) Môi trường nuôi cấy RTW → đốt 3-4 lần với 70% alcohol MS, Nitsch và Nitsch (NN) (Nitsch 1969), B5 (Gamborg và cộng sự. 1968 ) và KC không bổ sung PGR; pH 5.8 25 ± 2°C, 12-h PP,  60 µmol m-2 s-1 sau đó ủ 2 tháng trong tối, RH NR NR 94% nảy mầm trên môi trường MS với 100% tăng trưởng tốt thành cây con sau 90 ngày Hajong và cộng sự 2010
D. tetrachromum  và D. hamaticalcar Quả nang xanh (120 DAP) Môi trường nuôi cấy 70% Clorox® with 2 giọt Tween®-20 → 0.2% (w/v) AncomThiram 80 (thuốc diệt nấm)  10 min → 3 × SDW → 70% EtOH 30 s D. tethracromum: ½ MS + 3% suc (môi trường lỏng, bán rắn và pH NR)
D. hamaticalcar: ½ MS + 3% suc + 1-4% YE or 1-6% PE (môi trường lỏng, bán rắn và pH NR)
25 ± 2°C, 24-h PP, 20-50 µmol m-2 s-1, 70-80% RH NR D. tethrachromumvà D. hamaticalcar(100% G) Ali và cộng sự 2011
D. nobile  ‘Emma White’ Chồi nách (dài 8cm) →kích tích từ nụ nách 1.0-1.5 cm Loại và nồng độ PGR RTW 30 min → 10% NaOCl  8 min → 4-5 × SDW Môi trường sử dụng thực vật (O753)  + BA 2.0 mg dm-3, pH 5.5 25 ± 1°C, 16-h PP,  27 µmol m-2 s-1,  RH NR 72.5 % (42.5 % vi khuẩn và 30% nấm) 22.5% mẫu cấy sống sót sau 3 tuần nuôi cấy Asghar và cộng sự 2011
D. nobile Quả nang trưởng thành, tuổi NR Nồng độ AC 70% EtOH 5 min → NaOCl 1% 30 min → 3× SDW ½ MS + 2% suc + 0.7% agar, pH 5.7 25 ± 2°C, 16-h PP, 75 µmol m-2s-1, RH NR NR Hạt nảy mầm 0.5 cm sau 90-d Júnior và cộng sự 2011
D. parishii Quả nang xanh 8 tháng tuổi Môi trường nuôi cấy Nhúng chìm trong 95% EtOH và đốt trong vài giây Môi trường nuôi cấy VW trong 6 tháng, pH NR 25°C, 12-h PP,  60 µmol m-2 s-1,  RH NR NR NR Kaewduangta và Reamkatog 2011
Dwarf hybrid Dendrobium Quả nang trưởng thành 3 tháng tuôi Nồng độ BA và TDZ 95% EtOH 10 s và đốt MS + 3% suc + 15% CW + 0.82% agar, pH 5.5 25 ± 1°C, 16-h PP, 26.5 µmol m-2 s-1,  RH NR NR NR, sự nảy mầm của hạt bắt đầu sau 2 tuần nuôi cấy Sujjaritthhur- akarn và Kanchanapoom 2011
D. ‘Tong Chai Gold’ × ‘Black Jack’ Hạt trưởng thành, 120-d sau thụ phấn Sự phát triển cây mới NR ½ MS + 2% suc + 0.6% agar, pH 5.7 NR NR NR Cardoso 2012
D. longicornu Mẫu cấy đoạn thân (1-2 cm – mắt ngủ + chồi nách) Sự kết hợp PGR Chà nhẹ và tẩy với thuốc tẩy 10% → RTW 15-20 min → DW → NaOCl 10 min → 0.1% HgCl2  2 min → 5-6 × SDW MS + 3% suc + 0.8% agar + 3.4 mg·dm-3 BA + (2.8 mg·dm-3 NAA), pH NR 25 ± 2°C, 12-h PP,  50 µmol m-2 s-1,  RH NR NR 86.6 ± 3.3 % mẫu cấy phản ứng và 3.28 ± 0.28 chồi/mẫu cấy Dohling  và cộng sự 2012
D. aphyllum Hạt giống trưởng thành Kết hợp PGR và các phức chất 75% (v/v) EtOH 30 s → 0.1% HgCl2 10 min → rửa lại 5 x SDW MS + 2% suc + 2150 g·dm-3 BH + 0.5 g·dm-3 AC + 8% agar + 2.0 mg·dm-3 BA + 0.5 mg·dm-3NAA +  1.0 mg·dm-3GA; pH 5.8 27 ± 2°C, 14-h PP, 2000 Lux, RH NR NR NR Du và cộng sự 2012
D. primulinum Chồi đỉnh (0.3-0.5 mm) của hạt nảy mầm in vitro 20 tuần tuổi Nồng độ PGR NR MS + 1.5 mg·dm-3BA 25 ± 2°C, 16-h PP; PPFD và RH NR NR 4.5 chồi sau 5 tuần Pant và Thapa 2012
D. hookerianum Quả nang xanh tím 8-9 tháng Môi trường nuôi cấy Rửa trong RTW, sau đó SDW → 70% EtOH 10 s → đốt 3-4 × MS, pH 5.8 ± 0.02 25 ± 2°C, 12-h PP, trong tối 2 tuần tiếp theo với 60 µmol m-2s-1, 70-75% RH NR 95.27 ± 0.68% G Paul và cộng sự 2012
D. nobile Hạt giống trưởng thành Tiền xử lý với BA và GA3 0.83% NaOCl 15 min → 1 × 50-ml SDW 3 ml (N – 10%, P2O5 – 10%, K2O – 10%) + 7% tomato + 15% CW + 5% BP + 2.5% suc + 3 g·dm-3AC + 1.7% agar, pH 5.0 23 ± 2°C, 12-h PP,  28 µmol m-2 s-1,  RH NR NR 46.47% G Soares và cộng sự 2012
D. aggregatum (syn. D. lindleyi Steud.) Quả nang xanh, 120 DAP Sự nảy mầm quả đậu xanh Chất tẩy labolene 10 min → Bavistin (thuốc diệt nấm) 0.5 mg/l 20 min → 70% EtOH 30 s → 0.12% HgCl2 10 min → 3-4 × SDW MS + 30 mg·dm-3suc + 1.5 mg·dm-3BA + 15% CW + 0.8% agar, pH 5.8 25 ± 2°C, 14-h PP,  30 µmol m-2 s-1, RH NR NR Bắt đầu nảy mầm sau 2 tuần nuôi cấy, 75 chồi/ bình Vijayakumar  và cộng sự 2012
D. aggregatum Quả nang 3-4 tháng sau thụ phấn Nghiên cứu sự phát triển của thể tiền chồi và hạt nảy mầm Rửa sạch với Teepol™ → RTW → 0.2% HgCl10 min → 70% EtOH 1 min → 2-3 × SDW MS + 2 mg·dm-3 BA + 1 mg·dm-3 NAA (carbohydrate và agar NR) 25 ± 2°C, 14-h PP,  60 µmol m-2 s-1,  60% RH NR NR Hossain 2013
D. aphyllum Quả nang trưởng thành chưa nứt Quá trình nảy mầm ex vitro 0.2% HgCl2 10 min → 100% EtOH 10-12 s → 1 × SDW PM lỏng hoặc bán rắn với 0.8% agar + 2% suc + 1 mg·dm-3NAA + 3 mg·dm-3BA + 1.5 mg·dm-3Kin. Hình thành chồi từ mắt ngủ cao nhất trong MS + 3% suc + 1 mg·dm-3 BA + 10% CW. 25 ± 2°C, 14-h PP,  60 µmol m-2 s-1,  60% RH NR PM (97%), 85% (Mitra và cộng sự 1976), 70% (MS), 65% (KC) Hossain và cộng sự 2013
D. fimbriatum Quả nang trưởng thành (có thể) Muối khoáng và PGRs 0.2% HgCl2 10 min → 3-4 × SDW PM + 0.8% agar, pH 5.8 25 ± 2°C, 12-h PP,  27 µmol m-2 s-1,  98% RH NR 100% Kabir và cộng sự 2013
D. fimbriatum Hạt giống Sự kết hợp PGR 70% (v/v) EtOH 30-45 s → 0.1% HgCl25-8 min → rửa trong SDW 3-5 × MS + 3% suc + 0.5% agar + 1.5 mg·dm-3 BA + 0.1 mg·dm-3 GA; pH 5.8-6.2 26 ± 2°C, 12-h PP, 1500-2000 Lux, RH NR NR 85% G Li và cộng sự 2013
D. densiflorum Quả nang còn non, tuổi NR Nồng độ của BAP và NAA RTW → teepool (chất tẩy) (0.1%) 70% EtOH 1-2 min → 1% NaOCl 5 min → 3 × SDW MS + 0.8% agar, pH 5.8 25 ± 2°C, 16-h PP, 4.7-6.8 µmol m-2 s-1, RH NR NR NR Pradhan và cộng sự 2013
D. kingianum Củ bẹ (dài 2-3 cm) với 2 lá cuối. Kiểm tra mức Zn: gấp 2, 4, 8 và 16 lần (17.2, 34.4, 68.8, 137.6 mg/l) so với hàm lượng chuẩn trong môi trường MS (8.6 mg/l) 0.12% HgCl2 1 min MS + 0.5 mg·dm-3NAA + 1.0 mg·dm-3Kin 22-24°C, 16-h PP, 200 µmol m-2 s-1,  RH NR NR NR Prażak 2013
D. Sonia ‘Earsakul’ Chồi 8-12 cm và 3-5 mắt ngủ PGRs 100% EtOH → Rễ và lá bị loại bỏ → 1-2 cm mắt ngủ đơn → 0.1% labolene (chất hoạt động bề mặt)  30 min → RTW → SDW → 0.1% HgCl25 min → 3-4 × SDW ½ MS + 3% suc + 20% CW + 0.5 dm-3 AC + 6.2% agar + BA 2.0 mg·dm-3 + NAA 0. mg·dm-3, pH 5.8 26 ± 2°C, 15-h PP, 40.5 µmol m-2 s-1,  RH NR 0 100% mẫu cấy sống sót với 4.33 chồi Priya  và cộng sự 2013
D. oushanense Hạt giống Kết hợp PGR và các phức chất 70% (v/v) EtOH 30 s → 0.1% HgCl2 15 min → rửa trong SDW 5 × Môi trường Hyponex N016 +15 g·dm-3suc + 0.1% AC + 0.5% agar + 50 g·dm-3BH, pH 5.4-5.6 25 ± 2°C, 12-h PP, 30-40 µmol m-2 s-1, RH NR NR 80% G Qian  và cộng sự 2013
D. nobile Hạt giống trưởng thành (tuổi NR) Nồng độ CW 0.83% NaOCl 15 min → 1 × SDW (50 ml) 3 ml (N – 10%, P2O5 – 10%, K2O – 10%) + 7% tomato + 15% CW + 5% BP + 2.5% sugar + 3 g·dm-3 AC + 1.7% agar, pH 5.0 23 ± 2°C, 12-h PP, 13.5 µmol m-2 s-1,  RH NR NR 53.4% G Soares  và cộng sự 2013
D. ‘Gradita 31’ và D. ‘Zahra FR 62’  (D. Sonia Deep Pink × D. 1265) Chồi đỉnh và chồi nách từ cây mẹ 1 tuổi rưỡi (D. ‘Gradita 31’), chồi đỉnh (D. ‘Zahra FR 62’) Nồng độ CW và sử dụng phân bón lỏng (môi trường Rosasol) (D. ‘Gradita 31’); sử dụng bioreactor  (D. ‘Zahra FR 62’) RTW 30-60 min → 1% Tween®-20 30 min → DW 5 × (5 min/1 lần) → 0.05% HgCl2 + vài giọt Tween®-20 10 min → 5-6 rửa trong SDW (5 min/1 lần) ½ MS + 2% suc + 0.7% agar + 1 mg·dm-3 TDZ + 0.5 mg·dm-3BA + 15% CW hoặc môi trường Rosasol (Winarto và Teixeira da Silva 2015) hoặc môi trường GM (Winarto và Rachmawati 2013) 24 ± 1°C, 12-h PP, 13.5 µmol m-2 s-1,  RH NR 5-10% (vi khuẩn/ nấm men) 85-87% mẫu cấy sống sót với phần cơ bản của mẫu cấy là mô sẹo sau đ1o hình thành PLBs Winarto và cộng sự 2013, Winarto và Rachma- wati 2013, Winarto và Teixeira da Silva 2016
D. officinale Hạt giống chưa trưởng thành Sự kết hợp PGR 75% (v/v) EtOH 3 min → 0.1% HgCl215 min → rửa trong SDW 4-5 × Modified KC+ 2% suc + 20% CW + 7% carrageenan + 0.1 mg·dm-3 BA; pH 5.8 25 ± 2°C, 10-h PP, 2000-2500 Lux,  RH NR NR Sau 90 ngày nuôi cấy, 98.33% G; 6.74 ± 0.19 PLBs/mẫu cấy Wang  và cộng sự 2013
D. wangliangii Hạt giống sau khi thụ phấn 240 ngày Xây dựng một quy trình vi nhân giống hiệu quả cao và đánh giá tác động của hormone lên sự ra hoa in vitro 75% (v/v) EtOH 45 s → 0.1% HgCl2 15 min → rửa trong SDW ½ MS + 0.2 mg·dm-3PP333 + 0.5 mg·dm-3 NAA + 5.6 g·dm-3agar + 20 g·dm-3sucrose 22 ± 2°C, 16-h PP,  36 μmol m-2 s-1,  RH NR NR Sau 5 tuần nuôi cấy tất cả hạt giống nảy mầm đến giai đoạn xuất hiện tiền mô phân sinh (protomeristem) Zhao D.  và cộng sự 2013
D. officinale Hạt giống Phân tích ESTs; Sự nảy mầm cộng sinh và không cộng sinh Quy trình của Stewart và cộng sự (2003) Môi trường Oatmeal agar (OMA) (Warcup 1981) với Sebacina sp. Được tách  từ hạt giống cộng sinh D. officinale 25 ± 2°C, 16-h PP, 20.3-27.0 µmol m-2 s-1, 75 ± 5% RH NR 98.1% hạt giống nảy mầm sau 2 tuần Zhao M.  và cộng sự 2013
D. chrysotoxum Hạt giống từ quả nang xanh 4 tháng tuổi Sự kết hợp PGR Rửa quả nang trong RTW + 20% Teepol™ 10-15 min → 0.4% HgCl2 7-8 min → rửa trong SDW 4-5 × → 70% EtOH 8-10 min → đốt 2-3 s Mitra và cộng sự (1976) + 2 mg·dm-3BA + 2 mg·dm-3IAA+ 0.4% AC 25 ± 2°C, 12-h PP,  60 µmol m-2 s-1 NR NR Nongdam và Tikendra 2014
D. officinale Chồi đỉnh Kích thích ra hoa in vitro Nhúng chồi đỉnh trong 70% EtOH 20 s → 0.1% HgCl2 2 min→ rửa trong SDW MS + 0.5 mg·dm-3BA + 0.1 mg·dm-3NAA + 0.03% AC 25 ± 2°C, 10-h PP,  42 µmol m-2 s-1 NR   Qian và cộng sự 2014
D. chrysanthum Hạt giống từ quả nang xanh 80 ngày tuổi Môi trường nuôi cấy và kết hợp PGR Quả nang rửa trong RTW → 70% EtOH 30 s → 3% NaOCl 25 min → SDW PGR-free MS 24 ± 2°C, 15-h PP,  50 µmol m-2 s-1,  80% RH NR 98% G Rao và Barman,  2014
D. dixanthum Hạt giống Môi trường nuôi cấy và kết hợp PGR Ngâm hạt trong  75% EtOH 15 min → 0.1% HgCl2 8 min → rửa trong SDW 10 × ½MS + 0.5 mg·dm-3BA + 0.1 mg·dm-3NAA – 10% CW + 1 g·dm-3 AC 25°C, 12-h PP,  2000 lux NR NR Su và Wang 2014
D. officinale Hạt giống từ quả nang trưởng thành Nảy mầm cộng sinh với Tulasnella sp. Quả nang rửa trong 70% EtOH  1 min → 2.5% NaOCl 15 min → SDW 3 × Môi trường N6 (Chu và cộng sự 1975)  60 ngày → ½ MS 2 tháng 25°C, 12-h PP,  1500 lux NR 98.5% G Tan và cộng sự 2014
D. nobile hybrids (Lucky Girl, Second Love ‘Kirameki’, Hamana Lake ‘Kumi’) Hạt giống từ quả nang xanh 2-5 tháng tuổi Nồng độ sucrose và độ trưởng thành của hạt giống Quả nang rửa trong 70% EtOH 3 min → 0.6% NaOCl + 1 giọt Tween®-20 10 min → SDW  3 × → 95% EtOH 15 s → đốt 2-3 s MS + 1/2% sucrose + 0.2% AC + 50 g·dm-3 dịch chiết khoai tây + 25 g·dm-3 bột chuối 25 ± 2°C, 12-h PP,  40 ± 10 µmol m-2 s-1 NR 80%, 83.4% và 90.1% G (tương ứng với Second Love ‘Kirameki’, Hamana Lake ‘Kumi’, Lucky Girl) Udomdee  và cộng sự 2014
D. warkianum Hạt giống sau 120 ngày thụ phấn Kết hợp PGR và các phức chất Quả nang rửa trong chất tẩy 10 min → RTW 120 min → 75% EtOH 30 min → 3 × SDW → 0.1% HgCl2 15 min → rửa trong SDW 5 × 5 min ½MS + 1.0 mg·dm-3IBA + 2.0 mg·dm-3BA + 2.0 mg·dm-3NAA – 50 g·dm-3chuối xay 23 ± 2°C, 12-h PP, 20.3-40.0 µmol m-2 s-1 NR Sau 60 ngày nuôi cấy, 91.29% G. Zhou và cộng sự 2014
D. chrysotoxum Hạt giống từ quả nang trưởng thành chưa nứt Kết hợp PGR và các phức chất Quả nang được chùi rửa bằng vải bông trong 75% EtOH 75% EtOH → 0.1% HgCl2 8 min → 3 × SDW → 10% NaOCl 10 min → 5× SDW 1/4 MS + 0.5 mg·dm-3 KT + 1.0 g·dm-3 peptone + 150 g·dm-3 CW + 15 g·dm-3 sur + 1.0 g·dm-3 AC. pH 6.0 26°C (ngày), 24°C (đêm), 12-h PP,  2000 lux NR NR Cui và cộng sự 2015
D. falconeri Hạt giống từ quả nang trưởng thành chưa nứt Kết hợp PGR và các phức chất Quả nang rửa trong chất tẩy 10 min → RTW 120 min → 75% EtOH 30 min → 3 × SDW → 0.1% HgCl2 15 min → 5 × SDW mỗi 5 min 3/4 MS + 20 g·dm-3KT. pH 5.8 23-27°C, 12-h PP, 1500-3000 lux NR 98% hạt nảy mầm Yao và cộng sự 2015
D. cvàidum Mảnh thân (0.5-0.8 cm với mắt ngủ) Phương pháp khử trung và môi trường RTW → 60 min 70% EtOH 30 s → 0.1% HgCl2 10 min → 4-5 × SDW ½MS + 3.0 mg·dm-3BA + 0.5 mg·dm-3NAA + 100 g·dm-3chuối xay. pH 5.8 25 ± 2°C, 2000 lux. PP và RH NR 57% mẫu cấy sống sót 97% mẫu cấy sống sót Ju và cộng sự 2016

2,4-D, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid; AC, than hoạt tính; BA, 6-benzyladenin; BH, dịch chuối; BP, bột chuối; CH, carbohydrate; CK, cytokinin; CW, nước dừa; DAP, ngày sau khi thụ phấn; DW, nước cất; EtOH, cồn (ethanol); EST, khai thác dữ liệu; FW, trọng lượng tươi; G, nảy mầm; GA, axit gibberellic; Môi trường GM, môi trường Growmore (1,6 g dm-3 của 32N: 10P: 10K + 10% CW); HgCl2, thủy ngân clorua; IAA, axit indolo-3-axetic; Kin, kinetin; KC = môi trường nuôi cấy Knudson C, Knudson (1946); MS, môi trường nuôi cấy Murashige và Skoog (1962) (½MS = một nửa lượng nguyên tố đa lượng và vi lượng, trừ khi có chỉ định khác); NAA, axit α-naphthaleneacetic; NR, không báo cáo; NaOCl, natri hypochlorit; PE, chiết xuất khoai tây; PGR, điều chỉnh tăng trưởng thực vật; PH, dịch khoai tây; PM, PhytamaxTM; PP, photoperiod; PP333, paclobutrazol; PPFD, mật độ thông lượng photon quang hợp; RH, độ ẩm tương đối (trong phòng tăng trưởng); môi trường Rosasol, phân bón lỏng; 1,5 g L-1 18N: 18P: 18K + 1,5 g L-1 25N: 10P: 10K + EDTA chellate + 15% CW; RTW, rửa dưới vòi nước máy; SDW, nước cất tiệt trùng (bằng cách hấp); Suc, sucrose; TDZ, thidiazuron; VW, môi trường nuôi cấy Vacin và Went (1949); YE, chiết xuất từ ​​nấm men.
* Trong nhiều nghiên cứu, các tác giả báo cáo đã làm việc với những môi trường khác nhau, nhưng chỉ có ở những môi trường hiệu quả nhất được báo cáo ở đây. ** Có thể là 15 g·dm-3 suc.

Hình 1. Một số điều kiện ảnh hưởng và/hoặc xảy ra trong nuôi cấy mô Dendrobium. Thứ nhất, tầm quan trọng của độ tuổi và tình trạng của cây mẹ là nguồn cung cấp mẫu cấy cho các thí nghiệm khử trùng và sự thành công tiếp theo của nuôi cấy in vitro. (A) Các cây mẹ tối ưu 2 năm tuổi được duy trì trong nhà kính trong điều kiện tăng trưởng cẩn thận sẽ tạo ra các mẫu cấy chồi đỉnh có tỷ lệ tái sinh cao trong nuôi cấy in vitro (hình ảnh/dữ liệu không được hiển thị); (B), ngược lại với (A), các cây mẹ 5 năm tuổi được duy trì trong nhà kính với sự chăm sóc tối thiểu chỉ cung cấp cho các mẫu cấy có khả năng tái sinh thấp hoặc trung bình trong nuôi cấy in vitro (hình ảnh/dữ liệu không được hiển thị). Thứ hai, các quy trình khử trùng có thể có một ảnh hưởng sâu sắc đến chất lượng của các mẫu cấy, như minh họa bằng chồi đỉnh của Dendrobium ‘Gradita 31’. (C) Mẫu cấy được khủ trùng bằng cách rửa dưới vòi nước máy (RTW) trong 1,5 giờ, dung dịch xà phòng lỏng 1% trong 30 phút, thuốc trừ sâu 1% trong 30 phút, sau đó 0,05% trong 10 phút, và cuối cùng là rửa lại với nước cất vô trùng (SDW) 6 lần kết quả mẫy cấy sạch hoặc không có mô tổn thương, tỷ lệ nhiễm bẩn thấp (<15%) và làm giảm nâu hóa mẫu cấy (<10% mẫu cấy). (D) Khử trùng mẫu cấy bằng RTW trong 1.5 giờ, dung dịch xà phòng lỏng 1% trong 30 phút, thuốc trừ sâu 1% trong 30 phút, Clorox® 10% trong 5 phút, Clorox® 5% trong 10 phút và cuối cùng là rửa lại với SDW 6 lần, kết quả tổn thương mô nhiều hơn, tỉ lệ nhiễm bẩn cao hơn (khoảng 75%) với tỷ lệ mẫu cấy hóa nâu 20-35%. (E) Khử trùng mẫu cấy bằng RTW trong 1.5 giờ, dung dịch xà phòng lỏng 1% trong 30 phút, thuốc trừ sâu 1% trong 30 phút, Clorox® 20% trong 5 phút, sau đó Clorox® 10% trong 10 phút và cuối cùng là rửa lại với SDW 6 lần với kết quả là tổn thương mô đáng kể, nhiễm bẩn thấp (<20%), nhưng hóa nâu lan rộng (75-80%) dẫn tới tất cả mẫu cấy bị chết. Thứ ba, nuôi cấy Dendrobium trong môi trường lỏng 1.5 tháng sau khi bắt đầu nuôi cấy có thể dễ dàng bị nhiễm bẩn nếu khử trùng mẫu cấy chồi đỉnh không hoàn hảo. (F) Các mẫu chồi đỉnh Dendrobium ‘Zahra FR 62’ bị nhiễm vi khuẩn. (G) PLBs được tăng sinh của D. ‘Gradita 31’ bị nhiễm vi khuẩn. (H) PLBs được tăng sinh của D. ‘Jayakarta’ bị nhiễm vi khuẩn trong môi trường ½ MS lỏng chứa 0.3 mg·dm-3 TDZ và 0.1 mg·dm-3 NAA. Đối với tất cả các cây, các chồi nhỏ (dài ± 0.3 cm) như là nguồn cung cấp mẫu cấy đã được ủ trong điều kiện được mô tả trong Tab. 1 cho đến khi PLB bắt đầu được quan sát rõ ràng. Đối với tất cả các cây, các mẫu cấy được nuôi cấy thứ cấp sau mỗi 15 ngày và sau khi PLB bắt đầu hình thành sau đó chuyển sang ½ MS lỏng được bổ sung 0.3 mg·dm-3 TDZ và 0.1 mg·dm-3 NAA. Trong môi trường nuôi cấy này, chu kỳ nuôi cấy thứ cấp (4-5 lần, mỗi giai đoạn nuôi cấy cthu71 cấp là 15 ngày) được thực hiện trong cùng môi trường để tăng sinh PLBs. Để biết thêm chi tiết, xem Teixeira da Silva và cộng sự (2015a) và Teixeira da Silva và Winarto (2016). Thứ tư, nhiễm vi khuẩn (IO) và nấm (PU) của Dendrobium ‘Zahra FR 62’ (I, J, L, M, O, R), D. Gradita 31 ‘(K, N, P, S) và D. ‘Jayakarta’ (Q, T) nuôi cấy trong môi trường rắn và bắn rắn của chồi đỉnh (I-K) hoặc PLBs (L-T) có thể xảy ra trong 2 tháng (I-Q)hoặc 1.5 tháng (R-T) sau khi bắt đầu nuôi cấy trên môi trường ½ MS chứa 0.3 mg·dm-3 TDZ và 0.1 mg·dm-3 NAA. Đặc điểm chính xác của chủng vi khuẩn và nấm không được báo cáo. Tất cả ảnh chưa được xuất bản (B. Winarto)

Quy trình này đã đem lại sự phát triển của những mẫu cấy khỏe mạnh và có khả năng tái sinh cao với mức độ nhiễm bẩn thấp trong nuôi cấy vô trùng in vitro của cây dương xỉ (Winarto và Teixeira da Silva 2012) và giống lai Dendrobium (Winarto và cộng sự, 2013, Winarto và Rachmawati 2013) mà không có bất kỳ biện pháp khử trùng nào. Sử dụng các cây mẹ này, sự nảy mầm hạt giống in vitro đã diễn ra và PLBs hoặc thể tiền chồi (protocorms) được hình thành. Điều kiện sinh trưởng của cây mẹ rất có thể là nguy cơ đầu tiên và quan trọng nhất của sự tạp nhiễm. Việc khử trùng cần phải mạnh và phức tạp khi mô của cây mẹ đã già. Trong khi việc khử trùng nhẹ hơn theo lý thuyết có thể dẫn đến sự tái sinh cao hơn do các mô ít bị hư hỏng, việc khử trùng mạnh hơn có thể dẫn đến sự tái sinh thấp hơn do các mẫu cấy bị tổn hại lớn hơn bởi sự ăn mòn hóa học và vật lý ở các mẫu cấy (Mng’omba và cộng sự, 2012), mặc dù không có nghiên cứu nào xem xét các vấn đề này liên quan đến Dendrobium. Cũng không có các nghiên cứu định lượng để kiểm tra mối quan hệ giữa tuổi của mẫu mô nuôi cấy, hoặc độ tuổi của cây mẹ, và mức độ nhiễm bẩn. Một cách riêng biệt, sự tương quan giữa tuổi của cây mẹ và hiệu quả tái tạo đã được báo cáo ở các loài khác, trong đó mô của cây còn non thường cho kết quả tái tạo tốt hơn so với các mô của cây mẹ trưởng thành hoặc sự tái tạo dễ dàng hơn (Lưu và Pijut 2008, Cardoso và Habermann 2014, Lema-Rumińska và Kulus 2014). Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng trong hầu hết các nghiên cứu nhân giống Dendrobium sử dụng các mẫu cấy tế bào somatic, các chồi non (dài 0.5-12 cm) là những mẫu cấy chính được sử dụng hơn là các chồi trưởng thành với lá hoặc củ bẹ (Bảng 1).

Nói chung, sự nhiễm bẩn của các mẫu cấy từ các hạt giống, được thu thập từ quả nang còn non hoặc trưởng thành rất thấp (0-10%), có thể do kích thước hạt giống còn nhỏ (Kauth và cộng sự, 2008). Điều này kết hợp với điều kiện vệ sinh cao bên trong quả (do thiếu nội nhũ) dẫn đến chỉ có một lượng nhỏ các vi sinh vật, cho phép việc khử trùng đơn giản và hiệu quả đối với các mẫu cấy phát sinh từ các mô như vậy (điều này trái ngược với lá trưởng thành). Đối với hạt giống, Jean Carlos Cardoso đã khử trùng với 10% NaOCl (= 0.20-0.25% chlorine hoạt tính) trong 10 phút, sau đó rửa lại trong nước cất vô trùng ở các vị trí cắt khác nhau đối với các loài Dendrobium khác nhau mà không gặp vấn đề nhiễm bẩn. Tuy nhiên, các mẫu cấy từ các mô tế bào somatic như các chồi đỉnh thường có nhiều khả năng bị nhiễm bẩn cao hơn, bởi vi khuẩn, nấm men, hoặc nấm có bản chất là dung dịch giống sữa (Hình 1I-U). Có thể việc sử dụng các chồi dài (5-8 cm) đã được tưới tiêu trên cây (rắc hoặc tương tự) dẫn đến sự tích tụ nước tự do trong phần giữa lớp vỏ và các mô thân, mà các chồi đỉnh và chồi nách được thu thập (Hình 1C-E), dẫn đến sự phát triển của vi khuẩn và do đó dễ gây nhiễm bẩn các mô. Ví dụ, một cây trồng được tưới từ trên đỉnh, do đó làm ướt lá, có thể sẽ bị nhiễm bẩn nhiều hơn là một cây được tưới bằng phương pháp nhỏ giọt (Jean Carlos Cardoso, các quan sát cá nhân).

LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG BỀ MẶT
Hầu hết các tài liệu đã sử dụng hạt giống từ các quả nang trưởng thành hoặc còn non và các chồi nách còn non để bắt đầu nuôi cấy Dendrobium in vitro (Bảng 1). Đối với nhiều loài thực vật khác, các sản phẩm phổ biến nhất để khử trùng dựa trên các dung dịch thương mại có gốc chlorine, chẳng hạn như NaOCl hoặc mercury (II) chloride (HgCl2) (Tab 1).

Phân tích meta (Tab.2) cho thấy hầu hết (94.3%) những thí nghiệm về Dendrobium mô tả một quy trình để khử trùng bề mặt, nhưng 92,5% các nghiên cứu không báo cáo tỷ lệ nhiễm bẩn, trong khi đó chỉ có 50,9% các nghiên cứu cho biết tỷ lệ nảy mầm hoặc tái sinh của mẫu cấy (Tab 1). Một giải thích có thể là do hầu hết các nghiên cứu (ước tính từ Tab 1 vượt quá 90%) chỉ sử dụng giai đoạn thiết lập để thu được các mẫu cấy in vitro cho bước tiếp theo và thực hiện thí nghiệm thực tế mà không báo cáo vai trò nhiễm bẩn và/hoặc hiệu quả tái sinh của (các) kỹ thuật vô trùng đã sử dụng. Một giả thuyết khác là sự nhiễm bẩn không phải là vấn đề đối với các loài Dendrobium, đặc biệt là khi hạt giống được sử dụng để bắt đầu nuôi cấy in vitro. Để hỗ trợ cho giả thuyết này, trong 18.9% các nghiên cứu, các tác giả đã khử trùng các quả chưa trưởng thành (hoặc xanh) (Bảng 1), trước khi các quả bị nứt tự nhiên, trong trường hợp hạt giống được “khử trùng” tự nhiên (hoặc đúng hơn, chúng không bị nhiễm bẩn tự nhiên) bên trong quả, làm giảm nguy cơ nhiễm bẩn trong quá trình nuôi cấy in vitro. Việc sử dụng quả xanh để nuôi cấy cũng ngăn cản sự tiếp xúc trực tiếp của hạt với các chất khử trùng hoá học, có khả năng gây độc đối với các mô (Yeoman và Macleod 1977, George 1993), do đó cải thiện cơ hội (và số lượng hạt giống) có thể nẩy mầm. Soares và cộng sự (2012) đã khử trùng quả trước khi cấy vào trong ống nghiệm, và quan sát tỷ lệ nảy mầm cao hơn (80-100%) so với khi hạt bị cắt ra khỏi quả và sau đó khử trùng, chỉ có 46.47% nảy mầm (Tab.1).

Bảng 2. Phân tích các quy trình khử trùng (số nghiên cứu) được sử dụng để thiết lập nuôi cấy Dendrobium in vitro (các phân tích dựa trên các nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 1).

Sterilization products Seeds Capsules Stem explants Total
Mature Green/Young Shoots Pseudobulbs 2-3 cm long Axillary buds Shoot tips
NaOCl 4a     1 (72.5% Co; 22.5% ExS)       5
EtOH + NaOCl   6c 2 1 (< 20% Co)       9
NaOCl + HgCl2       1 (86.6 ± 3.3% ExR)       1
HgCl2   1 2 1 (5-10% Co; 85-87% ExS) 1 3   8
EtOH + HgCl2 or vice versa 10b 3d 1 1 (0% Co; 100% ExS)   1 1 17
HgCl2 + EtOH + flaming     1         1
EtOH + NaOCl + EtOH + flaming     1         1
Fungicide + EtOH + HgCl2     1         1
Antibiotic + HgCl2 + EtOH             1 (93.5 ± 8.1% ExR 1
Clorox®           1   1
Clorox® + Fungicide + EtOH     1         1
EtOH + flaming   1 2         3
Non reported 2           1 3
Total 16 11 11 5 1 4 3

Co: sự nhiễm bẩn, ExS: mẫu cấy sóng sót, ExR: mẫu cấy tái sinh
a: (0.83-5.0% NaOCl, 10 min)
b: (70-100% EtOH 10 s – 3 min + 0.1-1.0% HgCl2 5-15 min)
c: (70% EtOH 30 s – 5 min + NaOCl 1-3%; 10-60 min)
d: (70-100% EtOH 30 s – 1 min + 0.1-0.2% HgCl2 10-15 min)

Quan sát vấn đề khử trùng từ một góc độ khác, các mô somatic có khuynh hướng dễ bị nhiễm bẩn hơn hạt và các tác dụng độc hại của chất khử trùng hoá học (Yeoman và Macleod 1977, George 1993, Traore 2005, George và Debergh 2008, Jan và cộng sự năm 2013). Việc sử dụng NaOCl một lần dường như ít hiệu quả nhất đối với việc khử trùng các chồi Dendrobium, nhưng sự kết hợp các chất khử trùng khác nhau (EtOH, NaOCl, HgCl2) làm tăng hiệu quả của quá trình khử trùng (Bảng 2). Ở mức độ nhiễn bẩn của chồi đỉnh từ 0% đến 100 %, thì việc sử dụng Clorox® và Teepol ™ (thời gian phơi nhiễm và nồng độ không được báo cáo của các tác giả) phụ thuộc vào các loài: D. laxiflorum (0%), D. pseudoconantum (0%), D. canaliculatum (100%), D. strebloceras (40-50%), D. sp. Maluku (100%) D. lineale (50%), D. veratrifolium (0-50%) hoặc D. racianum (0%) (Soetopo và Purnamaningsih 2012). Trong một nghiên cứu khác với D. nobile var. ‘Emma trắng’, Asghar và cộng sự (2011) đã thử nghiệm 3 thời gian khử trùng bề mặt mẫu cấy khác nhau (6, 8 và 10 phút) với 10% NaOCl sau đó rửa lại 4-5 lần trong nước cất vô trùng (SDW) và quan sát thấy sự hoại tử tăng từ 0 đến 12.5% và sự nhiễm bẩn tăng từ 67.5% (vi khuẩn 35% và nấm 32.5%) đến 87.5% (vi khuẩn 47.5% và nấm 40%) và tỷ lệ sống sót từ 12.5% (6 phút) đến 22.5% (8 phút). Ở điều kiện cuối cùng, tức là 8 phút, là thời gian khử trùng tối ưu với tỷ lệ sống sót cao nhất (22.5%) và giảm tỷ lệ nhiễm bẩn (từ 87.5% xuống 72.5%) và hoại tử không đáng kể (5%), từ đó cho thấy tầm quan trọng của việc tìm ra sự cân bằng giữa việc khử trùng và tỷ lệ sống sót của mẫu cấy trong quá trình khử trùng.

Dựa trên kinh nghiệm của Jean Carlos Cardoso, làm việc với 10 giống lai Dendrobium (loại Denphal), cụ thể là D. ‘Brazilian Fire 101’ (màu vàng với các vệt màu đỏ), D. ‘Wooleng’ (màu trắng viền tím), D. ‘Tongchai Gold ‘(màu vàng viền đỏ), D. Red Prince (đỏ), D.’ Visa Peach ‘(trắng và hồng đỏ), D.’ Sonia ‘(trắng và hồng), trong số khác, ở phòng thí nghiệm thương mại (Công ty Uniplant, Brazil), ít nhất 15-20% chồi nách và chồi đỉnh đã bị nhiễm bẩn bởi vi khuẩn và/hoặc nấm men nếu các quy trình sau đây (chưa được công bố) được sử dụng để khử trùng bề mặt: cồn 70% trong 1 phút, sau đó NaOCl (0.5-0.6% chlorine hoạt tính) với 4-5 giọt Tween® 20/100 ml trong 20 phút, tiếp theo là rửa lại trong nước cất vô trùng 3 lần. Sử dụng phương pháp đó, 15-20% các mẫu cấy bị nhiễm bẩn sẽ dẫn tới phản ứng gây chết, ví dụ như mẫu cấy chết (do 100% những mẫu cấy nhiễm bẩn đó), trong khi những mẫu còn lại không bị nhiễm bẩn (80-85%) có thể tái sinh, mặc dù khả năng tái sinh có liên quan đến mức độ hóa nâu của mẫu cấy, một hiện tượng mà cũng được quan sát thấy đối với D. crumenatum (Kaewubon và cộng sự, 2015). Trong quy trình trên, việc rửa trung gian bằng nước cất vô trùng không thực hiện được, và trên thực tế chỉ có 8 nghiên cứu được liệt kê trong bảng 1 cung cấp một chất rửa trung gian cho mỗi chất khử trùng trước khi sử dụng một chất khử trùng tiếp theo mặc dù không có yêu cầu phải rửa lại giữa mỗi lần sử dụng các chất khử trùng khác nhau, chỉ trừ ở bước cuối cùng. Sự cần thiết đối với việc phải rửa độc lập của mỗi chất tiệt trùng là một chủ đề chưa được khám phá trong khoa học thực vật và có thể được yêu cầu đối với các loài hoặc kiểu gen khác nhau. Hiệu quả của một quy trình khử trùng đã được thử nghiệm bởi Ferreira và cộng sự (2006) là sử dụng ethanol 96% trong 2 phút tiếp theo là sử dụng các nồng độ NaOCl khác nhau (20, 40 và 60%, v/v) trong 30 phút đối với khử trùng bề mặt các chồi bên 8cm của D. ‘Second Love’ (loài Nobile). Họ quan sát thấy rằng chất tẩy trắng thương mại 40% (chlorine hoạt tính 2.5%) tiếp theo là rửa 3 lần trong SDW có kết quả tỷ lệ mẫu nguyên liệu được khử nhiễm cao (80%) và không có tác dụng gây hại. Điều này được xem xét, về mặt thương mại, là một kết quả tốt và có thể được sử dụng cho các loài hoặc kiểu gen khác để kiểm tra tính hiệu quả của quy trình. Khi HgCl2 được sử dụng như là một chất thay thế, hoặc thêm vào cùng với NaOCl để khử trùng bề mặt các chồi, cho kết quả tốt khi tái sinh, như ở D. nobile (93.5 ± 8.1% các mẫu cấy phản ứng) (Malabadi và cộng sự, 2005 ), D. longicornu (86.6 ± 3.3% các mẫu cấy phản ứng) (Dohling và cộng sự, 2012) và D. Sonia ‘Earsakul’ (100% mẫu cấy sống sót) (Kumari và cộng sự, 2013). HgCl2 cũng là tác nhân được lựa chọn để khủ trùng các hạt giống D. dixanthum (Su và Wang 2014), D. warkianum (Zhou và cộng sự, 2014) và D. chrysotoxum (Ju và cộng sự, 2016).

Các loại mẫu cấy khác nhau đòi hỏi các loại hợp chất, nồng độ và thời gian tiếp xúc khác nhau để tối ưu hoá quy trình khử trùng. Đối với quả nang, phương pháp khử trùng bề mặt được sử dụng phổ biến nhất là sử dụng ethanol 70% từ 30 giây đến 5 phút, tiếp theo là NaOCl 1-3% trong 20-60 phút (15,1% tài liệu) hoặc 0.1-1.0% HgCl2 (thay thế NaOCl) 5-15 phút (7.5% tài liệu) và có khả năng nảy mầm trên 80%, nhưng trong tất cả các trường hợp, đều không mô tả tỷ lệ nhiễm bẩn (Bảng 1). Các phương pháp xử lý tương tự được sử dụng cho các hạt giống và các chồi bên (Bảng 1). Tuy nhiên, một số tác giả (16.7%) nhúng các quả nang chưa nứt ra trong ethanol 70% hoặc 95% và tiến hành đốt các quả nang để khử trùng bề mặt (Sujjaritthurakarn và Kanchanapoom 2011, Paul và cộng sự, 2012). Paul và cộng sự (2012) đã sử dụng kỹ thuật này cho quả nang D. hookerianum và quan sát được có 95.27 ± 0.68% hạt nảy mầm. Hầu hết các tác giả không mô tả hiệu quả của quy trình khử trùng vì đó không phải là mục tiêu chính của thí nghiệm của họ.

KẾT LUẬN, GIỚI HẠN VÀ TRIỂN VỌNG TRONG TƯƠNG LAI

Việc sử dụng sự nảy mầm cộng sinh in vitro là một cách khác để cải tiến việc nhân giống Dendrobium (Teixeira da Silva và cộng sự, 2015c) nhưng việc giới thiệu các kiểu vật cộng sinh đặt ra một thách thức đáng kể cho việc nuôi cấy in vitro bởi vì sự cân bằng giữa sự cần thiết của vật cộng sinh và việc duy trì quá trình nuôi cấy vô trùng, tức là nếu không có vật cộng sinh phát triển quá mức và giết chết các mô thực vật do tiếp xúc với môi trường giàu chất dinh dưỡng là một thách thức to lớn trong công nghệ sinh học phong lan. Ví dụ, Zhao và cộng sự (2013) quan sát cải tiến sự nảy mầm hạt giống (gần 100%) bằng cách nuôi cấy đồng thời một loại nấm Sebacina sp. với hạt giống D. officinale trong 5 tuần, không có sự nảy mầm hạt giống khi nuôi cấy trong môi trường tương tự (thạch bột yến mạch) nhưng không có nấm.

Thời gian tối ưu để thu hoạch các mẫu cấy và độ tuổi và trạng thái sinh lý của các cây mẹ là những khía cạnh quan trọng có thể làm tăng hiệu quả của việc khử trùng bề mặt của các mẫu cấy và sự thành công của nuôi cấy in vitro (Hình 1A) (Hall 1999), bao gồm nảy mầm hạt, sự hình thành mô sẹo và/hoặc PLB. Vật liệu thực vật có nguồn gốc từ các cây trồng trong điều kiện chưa tối ưu, ví dụ như độ tuổi vật liệu hoặc ở trạng thái sinh lý thấp, thì nhạy cảm hơn với các chất khử trùng so với những mẫu cấy từ những cây phát triển trong điều kiện in vivo tối ưu, trong khi kích thước của mẫu cấy (ví dụ các lớp mỏng tế bào; Teuxeira da Silva 2013, Teixeira da Silva và Dobránszki 2013) có thể làm cho các mẫu cấy nhạy hơn với các chất khử trùng do kích thước nhỏ của chúng, trong khi thời gian thu hoạch hoặc mùa vụ chưa tối ưu cũng góp phần làm nhiễm bẩn cao (Traore và cộng sự, 2005, George Và Debergh 2008, Dobránszki và Teixeira da Silva 2010, Mihaljevic và cộng sự, 2013) Ví dụ, D. tetrachromum và D. hamaticalcar 100% nảy mầm được quan sát thấy khi quả nang xanh 120 ngày sau khi thụ phấn được sử dụng (Ali và cộng sự, 2011). Trong hầu hết các nghiên cứu được báo cáo trong tài liệu này, mức độ nhiễm bẩn của mẫu cấy đã ít được báo cáo trong quá trình thiết lập nuôi cấy vô trùng. Phương pháp khử trùng mẫu cấy có thể ảnh hưởng đến chất lượng và sức sống của mẫu cấy (Hình 1C-E) và do đó thành công và kết quả của phương pháp in vitro trong môi trường chất lỏng (hình 1F-H), bán rắn hoặc rắn (Hình. 1I-U). Sự thiếu hụt các chi tiết như vậy trong hầu hết các nghiên cứu (> 90% các tài liệu không báo cáo mức độ nhiễm bẩn hoặc sự sống sót của mẫu cấy; Tab 2) được báo cáo trong tài liệu (Tab. 1) là vấn đề vì thông tin như vậy có thể hỗ trợ các nhà nghiên cứu trong tương lai để loại bỏ các quy trình không có kết quả trong việc khử trùng mẫu cấy tối ưu. Các khía cạnh quan trọng khác cần được đề cập ở các thí nghiệm trong tương lai (và các tài liệu nghiên cứu) để khử trùng vật liệu thực vật ex vitro là: 1) các loại chất gây nhiễm bẩn được tìm thấy, ví dụ: nấm men, vi khuẩn và nấm; (2) quá trình tiền xử lý các cây mẹ trong đồng ruộng hoặc nhà kính, bao gồm phân bón, tưới nước, bảo dưỡng thực vật, kiểm soát sâu bệnh và cỏ dại, có thể kích thích hoặc tạo ra các nguồn mẫu cấy tái sinh cao bằng cách cải thiện trạng thái sinh lý, giảm mức độ nhiễm bẩn bề mặt hoặc cả hai ; (3) các chất khử trùng mới như các chất tiệt trùng tế bào nuôi cấy như chlorine dioxide (ClO2) (Cardoso và Teixeira da Silva 2012), iodine và/hoặc potassium iodide (Deein và cộng sự, 2013) hoặc axit peracetic (Unemoto và cộng sự), tất cả chúng có thể được sử dụng trong nuôi cấy tế bào thực vật (ví dụ, sử dụng cho hoa cúc, Teixeira da Silva và Kulus 2014). Ít nhất là một nghiên cứu giải quyết các vấn đề như vậy, bao gồm việc giải quyết các thiếu sót và thất bại trong tài liệu cho đến nay, cho phạm vi là các kiểu gene Dendrobium, là bắt buộc. Những thông tin như vậy chắc chắn sẽ tiếp tục được cải thiện thành công ở các bước tiếp theo trong nuôi cấy in vitro.

Quy trình khử trùng được thiết lập tốt sẽ giúp cho việc thu thập các mẫu cấy phù hợp cho các nghiên cứu về sự tái sinh và nảy mầm (ví dụ, Hình 2). Tuy nhiên, một số vi khuẩn nội sinh hoặc nấm men có thể là một vấn đề đối với nhân giống hoa lan và các sản phẩm hóa học thông thường được sử dụng để khử trùng bề mặt tế bào không phải lúc nào cũng đưa đến kết quả là các mẫu cấy không có vi sinh vật. Thông thường, chúng ta quan sát thấy một số chủng nấm men và/hoặc vi khuẩn gây nhiễm bẩn các mẫu cấy lan nuôi cấy in vitro, đặc biệt là các tế bào somatic. Ở các loài hoa lan khác, các vi sinh vật tương tự đã được quan sát thấy, ví dụ như Habenaria radiata, trong đó 33% các mẫu cấy từ chồi đỉnh bị nhiễm vi khuẩn (Mitsukuri và cộng sự, 2009). Brown và cộng sự (1982) đã thử nghiệm các chất diệt nấm và kháng sinh khác nhau để phòng ngừa sự nhiễm bẩn ở một số loài lan, quan sát thấy rằng chỉ có một bình chứa dung dịch hỗn hợp (Benomyl, quintozene, penicillin G, amphotericin B và omadine natri) cho kết quả là các hạt giống và phôi hợp tử của Dendrobium specisum var. hillii. không bị nhiễm bẩn. Nhiễm virut là một vấn đề khác của cây lan (Khentry và cộng sự, 2006b) và việc loại bỏ các virut quan trọng như Cymbidium mosaic virus (CymMV) và Odontoglossum ringspot virus (ORPAT) là có thể do sự phát triển của cây con (Khentry và cộng sự, 2006b), nuôi cấy các phần nhỏ (Lim và cộng sự, 1993) và nuôi cấy PLB (Chanprame và cộng sự 2011) kết hợp hay không với hóa trị liệu bằng cách sử dụng ribavirin. Ví dụ, Khentry và cộng sự (2006a) đã quan sát thấy sự xuất hiện của CymMV (nhưng không có ORSV) trong sáu giống lan, bao gồm cả các cây trồng nhân giống in vitro của một số giống Dendrobium (‘Chanel’, D. ‘Chao Praya’, D. ‘Pravit White’, D. ‘ Sakura ‘và D.’ Shawin White ‘), có tỷ lệ nhiễm trùng cao. Khentry và cộng sự. (2006a) đã quan sát thấy, trong 14 bông Dendrobium được nhân giống bằng giâm hom, tỷ lệ nhiễm CymMV dao động từ 25-100% với 65.8% số mẫu bị nhiễm, và ở 29 giống được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, khoảng 0-100% cây con bị nhiễm, tùy thuộc vào giống, với trung bình 18.6% số mẫu nhiễm bệnh. CymMV cũng được phát hiện trong PLB của Dendrobium ‘Sonia’ thu được từ các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô ở Thái Lan sử dụng RT-PCR (78% mẫu) và ELISA (22% mẫu), cho thấy RT-PCR nhạy hơn khi phát hiện virus hệ thống trong cây lan (Khentry và cộng sự, 2007). RTPCR đa thành phần có thể được sử dụng để phát hiện đồng thời các virus CymMV, ORSV và Orchid fleck virus (OFV) ở Dendrobium và những giống lan khác (Ali và cộng sự 2014, Kim và Choi 2015). Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh (0.1-1 mm) của Mokara Char Kuan ‘Pink’, Lim và cộng sự (1993) quan sát thấy rằng các cây con tái tạo từ nuôi cấy mô phân sinh lớn hơn vẫn bị nhiễm CymMV và ORSV trong khi TLCs của các cây và PLBs bị nhiễm, khi điều trị với ribavirin, không có các virut này. Điều thú vị là ít bài báo mô tả hoặc cho thấy những tiến bộ trong các nghiên cứu về các vi sinh vật, mặc dù các vấn đề nhiễm bẩn vẫn tiếp tục được quan sát thấy ở các phòng thí nghiệm thương mại và các vườn ươm hoa lan thương mại (Khentry và cộng sự, 2006a, 2006b, 2007; Hình 1A, B, I-U).

KINH PHÍ

Các tác giả không nhận được bất cứ tài trợ nào cho nghiên cứu này.

ĐÓNG GÓP TÁC GIẢ

Tất cả các tác giả đã đóng góp cho tất cả các khía cạnh của bản thảo này, bao gồm phát triển ý tưởng, ghi chép, chỉnh sửa và trách nhiệm chung cho nội dung.

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH
Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Jaime A. Teixeira da Silva1*, Budi Winarto2**, Judit Dobránszki3***, Jean Carlos Cardoso4****, Songjun Zeng5*****
1 P. O. Box 7, Miki-cho post office, Ikenobe 3011-2, Kagawa-ken, 761-0799, Japan
2 Indonesian Ornamental Crops Research Institute (IOCRI) Jln. Raya Ciherang, Pacet-Cianjur 43253, West Java, Indonesia
3 Research Institute of Nyíregyháza, University of Debrecen Nyíregyháza, P.O. Box 12, H-4400, Hungary
4 Department of Rural Development, Centro de Ciências Agrárias, UFSCar Via Anhanguera, km 174, CP 153, CEP 13.600-970, Araras City, Brazil
5 Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis và Gene Improvement South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, 510650, China
Alam M.K., Rashid M.H., Hossain M.S., Salam M.A., Rouf M.A., 2002. In vitro seed propagation of dendrobium (Dendrobium transparens) orchids as influenced by different media. Biotechnology 1(2-4): 111-115.
Ali M.J., Murdad R., Latip M.A., 2011. In vitro seed germination of Bornean endemic orchids Dendrobium tetrachromum và Dendrobium hamaticalcar. In: Empower. Sci. Tech. Innov: Towards Better Tomorrow, UMTAS: 770-778.
Ali R.N., Dann A.L., Cross P.A., Wilson C.R., 2014. Multiplex RT-PCR detection of three common viruses infecting orchids. Arch. Virol. 159: 3095- 3099.
AsgharS., Ahmad T., Hafiz I.A., Yaseen M., 2011. In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var. Emma White. Afr. J. Biotechnol. 10 (16): 3097-3103.
BhadraS.K., BaruaA.K., Bhattacharjee B., Hossain M.M., 2002. In vitro micropropagation of Dendrobium aphyllum (Roxb.) G. E. C. Fisher. Bangladesh J. Genet. Biotechnol. 3: 47-50.
Brown D.M., Groom C.L., CvitanikM., Brown M., CooperJ.L., Arditti J., 1982. Effects of fungicides và bactericides on orchid seed germination và shoot tip cultures in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1: 165-180.
Cardoso J.C., 2012. Dendrobium ‘Brazilian Fire 101’ – New option of color of flowers for the ochid market. Hortic. Bras. 30: 561-564.
Cardoso J.C., Habermann G., 2014. Adventitious shoot induction from leaf segments in Anthurium vàraeanum is affected by age of explants, leaf orientation và plant growth regulator. Hortic. Env. Biotech. 55: 56-62.
Cardoso J.C., TeixeiradaSilvaJ.A., 2012. Micropropagation of gerbera using chlorine dioxide (ClO2) to sterilize the culture medium. In Vitro Cell. Dev. Biol. ‒ Plant 48: 362-368.
Chanprame S., Hongprayoon R., Limsanguan P., 2011. Elimination of Cymbidium mosaic virus from Dendrobium orchid PLB by chemotherapy. J. Int. Soc. Southeast Asian Agric. Sci. 17: 1636-1648.
Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Yin K.C., Chu C.Y., Bi F.Y., 1975. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Sci. Sin. 18: 659-668.
Cui B., Kang Y.Y., Wang J.Q., Jiang S.H., Liang F., Liu J., 2015. Research on the tissue culture và rapid propagation technology of Dendrobium chrysotoxum Lindl. Chin. Agri. Sci. Bull. 31(19): 111-121 (in Chinese with English abstract).
Das A.K., Das J., Gogoi H.K., SrivastavaR.B., 2008. Mass propagation of orchids through in vitro seed culture technology. J. Cell Tiss. Res. 8(2): 1585-1588.
De Moraes L.M., Cavalcante L.C.D., FariaR.T., 2002. Substratos para aclimatização de plântulas de Dendrobium nobile Lindl. (Orchidaceae) propagadas in vitro. Acta Scient. 24: 1397-1400 (in Portuguese with English abstract).
Deein W., ThepsitharC., Thongpukdee A., Tippornwong S., 2013. Growth of chrysanthemum explants on MS medium sterilized by disinfectants và essential oils. Int. J. Biosc. Biochem. Bioinform. 3(6): 609-613.
Dobránszki J., TeixeiradaSilvaJ.A., 2010. Micropropagation of apple – a review. Biotech. Adv. 28: 462-488.
Dohling S., KumariaS., Tvàon P., 2012. Multiple shoot induction from axillary bud cultures of the medicinal orchid, Dendrobium longicornu. AoB Plants 2012: pls032.
Du G., Lai T.C., Yang H.Y., 2012. Study on the tissue culture of Dendrobium aphyllum (Roxb) C. E. C. Fisch. North Hortic. 8: 140-141.
DuttaS., ChowdhuryA., Bhattacharjee B., Nath P.K., DuttaB.K., 2011. In vitro multiplication và protocorm development of Dendrobium aphyllum (Roxb.) CEC Fisher. Assam Univ. J. Sci. Technol: Biol. Env. Sci. 7(1): 57-62.
FerreiraW.M., KerbauyG.B., CostaA.P.P., 2006. Micropropagation và genetic stability of và bactericides on orchid seed germination và shoot tip cultures in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1: 165-180.
Cardoso J.C., 2012. Dendrobium ‘Brazilian Fire 101’ – New option of color of flowers for the ochid market. Hortic. Bras. 30: 561-564.
Cardoso J.C., Habermann G., 2014. Adventitious shoot induction from leaf segments in Anthurium vàraeanum is affected by age of explants, leaf orientation và plant growth regulator. Hortic. Env. Biotech. 55: 56-62.
Cardoso J.C., TeixeiradaSilvaJ.A., 2012. Micropropagation of gerbera using chlorine dioxide (ClO2) to sterilize the culture medium. In Vitro Cell. Dev. Biol. ‒ Plant 48: 362-368.
Chanprame S., Hongprayoon R., Limsanguan P., 2011. Elimination of Cymbidium mosaic virus from Dendrobium orchid PLB by chemotherapy. J. Int. Soc. Southeast Asian Agric. Sci. 17: 1636-1648.
Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Yin K.C., Chu C.Y., Bi F.Y., 1975. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Sci. Sin. 18: 659-668.
Cui B., Kang Y.Y., Wang J.Q., Jiang S.H., Liang F., Liu J., 2015. Research on the tissue culture và rapid propagation technology of Dendrobium chrysotoxum Lindl. Chin. Agri. Sci. Bull. 31(19): 111-121 (in Chinese with English abstract).
Das A.K., Das J., Gogoi H.K., SrivastavaR.B., 2008. Mass propagation of orchids through in vitro seed culture technology. J. Cell Tiss. Res. 8(2): 1585-1588.
De Moraes L.M., Cavalcante L.C.D., FariaR.T., 2002. Substratos para aclimatização de plântulas de Dendrobium nobile Lindl. (Orchidaceae) propagadas in vitro. Acta Scient. 24: 1397-1400 (in Portuguese with English abstract).
Deein W., ThepsitharC., Thongpukdee A., Tippornwong S., 2013. Growth of chrysanthemum explants on MS medium sterilized by disinfectants và essential oils. Int. J. Biosc. Biochem. Bioinform. 3(6): 609-613.
Dobránszki J., TeixeiradaSilvaJ.A., 2010. Micropropagation of apple – a review. Biotech. Adv. 28: 462-488.
Dohling S., KumariaS., Tvàon P., 2012. Multiple shoot induction from axillary bud cultures of the medicinal orchid, Dendrobium longicornu. AoB Plants 2012: pls032.
Du G., Lai T.C., Yang H.Y., 2012. Study on the tissue culture of Dendrobium aphyllum (Roxb) C. E. C. Fisch. North Hortic. 8: 140-141.
DuttaS., ChowdhuryA., Bhattacharjee B., Nath P.K., DuttaB.K., 2011. In vitro multiplication và protocorm development of Dendrobium aphyllum (Roxb.) CEC Fisher. Assam Univ. J. Sci. Technol: Biol. Env. Sci. 7(1): 57-62.
FerreiraW.M., KerbauyG.B., CostaA.P.P., 2006. Micropropagation và genetic stability of và bactericides on orchid seed germination và shoot tip cultures in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1: 165-180.
Cardoso J.C., 2012. Dendrobium ‘Brazilian Fire 101’ – New option of color of flowers for the ochid market. Hortic. Bras. 30: 561-564.
Cardoso J.C., Habermann G., 2014. Adventitious shoot induction from leaf segments in Anthurium vàraeanum is affected by age of explants, leaf orientation và plant growth regulator. Hortic. Env. Biotech. 55: 56-62.
Cardoso J.C., TeixeiradaSilvaJ.A., 2012. Micropropagation of gerbera using chlorine dioxide (ClO2) to sterilize the culture medium. In Vitro Cell. Dev. Biol. ‒ Plant 48: 362-368.
Chanprame S., Hongprayoon R., Limsanguan P., 2011. Elimination of Cymbidium mosaic virus from Dendrobium orchid PLB by chemotherapy. J. Int. Soc. Southeast Asian Agric. Sci. 17: 1636-1648.
Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Yin K.C., Chu C.Y., Bi F.Y., 1975. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Sci. Sin. 18: 659-668.
Cui B., Kang Y.Y., Wang J.Q., Jiang S.H., Liang F., Liu J., 2015. Research on the tissue culture và rapid propagation technology of Dendrobium chrysotoxum Lindl. Chin. Agri. Sci. Bull. 31(19): 111-121 (in Chinese with English abstract).
Das A.K., Das J., Gogoi H.K., SrivastavaR.B., 2008. Mass propagation of orchids through in vitro seed culture technology. J. Cell Tiss. Res. 8(2): 1585-1588.
De Moraes L.M., Cavalcante L.C.D., FariaR.T., 2002. Substratos para aclimatização de plântulas de Dendrobium nobile Lindl. (Orchidaceae) propagadas in vitro. Acta Scient. 24: 1397-1400 (in Portuguese with English abstract).
Deein W., ThepsitharC., Thongpukdee A., Tippornwong S., 2013. Growth of chrysanthemum explants on MS medium sterilized by disinfectants và essential oils. Int. J. Biosc. Biochem. Bioinform. 3(6): 609-613.
Dobránszki J., TeixeiradaSilvaJ.A., 2010. Micropropagation of apple – a review. Biotech. Adv. 28: 462-488.
Dohling S., KumariaS., Tvàon P., 2012. Multiple shoot induction from axillary bud cultures of the medicinal orchid, Dendrobium longicornu. AoB Plants 2012: pls032.
Du G., Lai T.C., Yang H.Y., 2012. Study on the tissue culture of Dendrobium aphyllum (Roxb) C. E. C. Fisch. North Hortic. 8: 140-141.
DuttaS., ChowdhuryA., Bhattacharjee B., Nath P.K., DuttaB.K., 2011. In vitro multiplication và protocorm development of Dendrobium aphyllum (Roxb.) CEC Fisher. Assam Univ. J. Sci. Technol: Biol. Env. Sci. 7(1): 57-62.
FerreiraW.M., KerbauyG.B., CostaA.P.P., 2006. Micropropagation và genetic stability of a Dendrobium hybrid (Orchidaceae). In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant 42: 568-571.
Gamborg O.L., MillerR.A., OjimaK., 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158.
George E.F., 1993. Plant Propagation by Tissue Culture. Part 1, Technology, Exegetics Ltd., Englvà: 121-145.
George E.F., Debergh P.C., 2008. Micropropagation: Uses và Methods. In: Plant Propagation by Tissue Culture, The Background. Vol.1. E.F. George, M.A. Hall và G-J. De Klerk (eds), Springer, Dordrecht, The Netherlvàs: 29-64.
Hajong S., KumariaS., Tvàon P., 2010. In vitro propagation of the medicinal orchid Dendrobium chrysanthum. Proc. Indian Natl. Sci. Acad. 76(1): 1-6.
Hall R.D., 1999. An introduction to plant-cell culture. In: Plant Cell Culture Protocols. R.D. Hall. (ed.), Humana Press Inc., Totowa, New Jersey: 1-18.
Hossain M.M., 2013. In vitro embryo morphogenesis và micropropagation of Dendrobium aggregatum Roxb. Plant Tissue Cult. Biotech. 23(2): 241-249.
Hossain M.M., SharmaM., PathakP., 2013. In vitro propagation of Dendrobium aphyllum (Orchidaceae) ‒ seed germination to flowering. J. Plant Biochem. Biotechnol. 22: 157-167.
Jan A., Bhat K.M., Bhat S.J.A., MirM.A., Bhat M.A., Wani I.A., RatherJ.A., 2013. Surface sterilization method for reducing microbial contamination of field grown strawberry explants intended for in vitro culture. Afr. J. Biotech. 12(39): 5749-5753.
Jin X.H., Chen S., Luo Y., 2009. Taxonomic revision of Dendrobium moniliforme complex (Orchidaceae). Sci. Hortic. 120: 143-145.
Ju S.M., Zhu W.L., Wang W.L., Gao Y., MaT., 2016. Direct regeneration of seedling from stem fragments of Dendrobium cvàidum. J. Gansu Agric. Univ. 51(1): 45-48 (in Chinese with English abstract).
JúniorR.F.G., Neto P.C., Mantovani C., 2011. Crescimento in vitro de Dendrobium nobile Lindley com adição de carvão ativado. Científica 40: 28-34 (in Portuguese with English abstract).
KabirM.F., Rahman M.S., Jamal A., Rahman M., Khalekuzzaman M., 2013. Multiple shoot regeneration in Dendrobium fimbriatum Hook an ornamental orchid. J. Animal Plant Sci. 23(4): 1140- 1145.
KaewduangtaW., Reamkatog P., 2011. Effect of modification medium on growth development of Dendrobium parishii in vitro. American-Eurasian J. Agric. Environ. Sci. 11: 117-121.
Kaewubon P., Hutadilok-TowatanaN., TeixeiradaSilvaJ.A., Meesawat U., 2015. Ultrastructural và biochemical alterations during browning of Pigeon orchid (Dendrobium crumenatum Swartz) callus. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 121(1): 53-69.
Kauth P.J., DutraD., Johnson T.R., Stewart S.L., Kane M.E., Vendrame W., 2008. Techniques và a Dendrobium hybrid (Orchidaceae). In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant 42: 568-571.
Gamborg O.L., MillerR.A., OjimaK., 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158.
George E.F., 1993. Plant Propagation by Tissue Culture. Part 1, Technology, Exegetics Ltd., Englvà: 121-145.
George E.F., Debergh P.C., 2008. Micropropagation: Uses và Methods. In: Plant Propagation by Tissue Culture, The Background. Vol.1. E.F. George, M.A. Hall và G-J. De Klerk (eds), Springer, Dordrecht, The Netherlvàs: 29-64.
Hajong S., KumariaS., Tvàon P., 2010. In vitro propagation of the medicinal orchid Dendrobium chrysanthum. Proc. Indian Natl. Sci. Acad. 76(1): 1-6.
Hall R.D., 1999. An introduction to plant-cell culture. In: Plant Cell Culture Protocols. R.D. Hall. (ed.), Humana Press Inc., Totowa, New Jersey: 1-18.
Hossain M.M., 2013. In vitro embryo morphogenesis và micropropagation of Dendrobium aggregatum Roxb. Plant Tissue Cult. Biotech. 23(2): 241-249.
Hossain M.M., SharmaM., PathakP., 2013. In vitro propagation of Dendrobium aphyllum (Orchidaceae) ‒ seed germination to flowering. J. Plant Biochem. Biotechnol. 22: 157-167.
Jan A., Bhat K.M., Bhat S.J.A., MirM.A., Bhat M.A., Wani I.A., RatherJ.A., 2013. Surface sterilization method for reducing microbial contamination of field grown strawberry explants intended for in vitro culture. Afr. J. Biotech. 12(39): 5749-5753.
Jin X.H., Chen S., Luo Y., 2009. Taxonomic revision of Dendrobium moniliforme complex (Orchidaceae). Sci. Hortic. 120: 143-145.
Ju S.M., Zhu W.L., Wang W.L., Gao Y., MaT., 2016. Direct regeneration of seedling from stem fragments of Dendrobium cvàidum. J. Gansu Agric. Univ. 51(1): 45-48 (in Chinese with English abstract).
JúniorR.F.G., Neto P.C., Mantovani C., 2011. Crescimento in vitro de Dendrobium nobile Lindley com adição de carvão ativado. Científica 40: 28-34 (in Portuguese with English abstract).
KabirM.F., Rahman M.S., Jamal A., Rahman M., Khalekuzzaman M., 2013. Multiple shoot regeneration in Dendrobium fimbriatum Hook an ornamental orchid. J. Animal Plant Sci. 23(4): 1140- 1145.
KaewduangtaW., Reamkatog P., 2011. Effect of modification medium on growth development of Dendrobium parishii in vitro. American-Eurasian J. Agric. Environ. Sci. 11: 117-121.
Kaewubon P., Hutadilok-TowatanaN., TeixeiradaSilvaJ.A., Meesawat U., 2015. Ultrastructural và biochemical alterations during browning of Pigeon orchid (Dendrobium crumenatum Swartz) callus. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 121(1): 53-69.
Kauth P.J., DutraD., Johnson T.R., Stewart S.L., Kane M.E., Vendrame W., 2008. Techniques và applications of in vitro orchid seed germination. In: Floriculture, Ornamental và Plant Biotechnology: Advances và Topical Issues (Vol. V). J.A. Teixeira da Silva (ed.), Global Science Books, Isleworth, UK: 375-391.
KhentryY., Chowpongpang S., Paradornuwat A., Tantiwiwat S., Thaveechai N., 2006a. Incidence of Cymbidium mosaic virus và Odontoglossum ringspot virus in Dendrobium spp. in Thailvà. Crop Protection 25: 926-932.
KhentryY., Chowpongpang S., Paradornuwat A., Tantiwiwat S., Thaveechai N., 2007. Detection of Cymbidium mosaic virus in protocorm-like bodies in Dendrobium Sonia using one-step RT-PCR. J. Plant Biochem. Biotech. 16(2): 123-125.
KhentryY., Paradornuwat A., Tantiwiwat S., Phansiri S., Thaveechai N., 2006b. Incidence of Cymbidium mosaic virus và Odontoglossum ringspot virus in in vitro Thai native orchid seedlings và cultivated orchid mericlones. Kasetsart J. (Nat. Sci.) 40: 49-57.
Kim S.M., Choi S.H., 2015. Simultaneous detection of Cymbidium mosaic virus và Odontoglossum ringspot virus in orchids using multiplex RT-PCR. Virus Genes 51: 417-422.
Knudson K., 1946. A new nutrient solution for germination of orchid seeds. Am. Orchid Soc. Bull. 15: 214-217.
Kong Q., Yuan S.Y., Végvári G.Y., 2007. Micropropagation of an orchid Dendrobium strongylanthum Rchb.f. Int. J. Hortic. Sci. 13: 61-64.
Kumari P., SabinaGeorge T., Rajmohan K., 2013. Influence of plant growth regulators on in vitro clonal propagation of Dendrobium Sonia ‘Earsakul’. J. Biol. Innov. 2(2): 51-58.
Lema-Rumińska J., Kulus D., 2014. Micropropagation of cacti – a review. Haseltonia 19: 46-63.
Li C., Zhang Z.J., Wei Y., Li L.X., Ling Z.Z., Wei K.H., 2013. Study on tissue culture và rapid propagation of Dendrobium fimbriatum Hook. var. oculatum. Hook. North Hortic. 6: 105-107.
Lim S.T., Wong S.M., Goh C.J., 1993. Elimination of Cymbidium mosaic virus và Odontoglossum ringspot virus from orchids by meristem culture và thin section culture with chemotherapy. Ann. Appl. Biol. 122: 289-297.
Liu X., Pijut P.M., 2008. Plant regeneration from in vitro leaves of mature black cherry (Prunus serotina). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 94: 113-123.
Lo S.F., Nalawade S.M., Kuo C.L., Chen C.L., TsayH.S., 2004. Asymbiotic germination of immature seeds, plantlet development và ex vitro establishment of plants of Dendrobium tosaense Makino – a medicinally important orchid. In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant 40: 528-535.
Lone A.B., BarbosaC.M., FariaR.T., Takahashi L.S.A., FonsecaI.C.B., 2008. Seleção de genótipos de Dendrobium phalaenopsis (Orchidaceae) nas fases de propagação in vitro e aclimatização. Semina: Ciências Agrárias 29: 755-760 (in Portuguese with English abstract).
Luo J.P., Wang Y., ZhaX.Q., Huang L., 2008. Micropropagation of Dendrobium densiflorum Lindl. ex Wall. through protocorm-like bodies: effects of plant growth regulators và lanthanoids. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 93: 333-340.
Luo J.P., Wawrosch C., Kopp B., 2009. Enhanced micropropagation of Dendrobium huoshanense C.Z. Tang et S.J. Cheng through protocorm-like bodies: The effects of cytokinins, carbohydrate sources và cold pretreatment. Sci. Hort. 123: 258-262.
Malabadi R.B., Mulgund G.S., KallappaN., 2005. Micropropagation of Dendrobium nobile from shoot tip sections. J. Plant Physiol. 162: 473-478.
Maridass M., Mahesh R., Raju G., Benniamin A., Muthuchelian K., 2010. In vitro propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud culture. Int. J. Biol. Technol. 1(2): 50-54.
Meesawat U., Kanchanapoom K., 2002. In vitro plant regeneration through embryogenesis và organogenesis from callus culture of pigeon orchid (Dendrobium crumenatum Sw.). Thammasat Int. J. Sci. Tech. 7(2): 9-17.
MihaljevicI., DugalicK., Tomas V., ViljevacM., PranjicA., CmelikZ., PuskarB., JurkovicZ., 2013. In vitro sterilization procedures for micropropagation of ‘Oblacinska’ sour cherry. J. Agric. Sci. 58(2): 117- 126.
MitraG.C., Prasad R.N., RoychowdharyA., 1976. Inorganic salts và differentiation of protocorms in seed-callus of an orchid và correlated changes in its free amino acid content. Indian J. Exp. Biol. 14: 350-351.
Mitsukuri K., AritaT., Johkan M., Yamasaki S., MishibaK-I., OdaM., 2009. Effects of type of explant và dark preconditioning on bud formation in Habenaria radiata (Thunb.) in vitro. HortScience 44(2): 523-525.
Mng’ombaS.A., Sileshi G., Du Toit E.S., Akinnifesi F.K., 2012. Efficacy và utilization of fungicides và other antibiotics for aseptic plant cultures, fungicides for plant và animal diseases. In: Fungicides for Plant và Animal Diseases. D. Dhanasekaran (ed.), InTech, Croatia: 245-254.
Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth và bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
Niedz R.P., BausherM.G., 2002. Control of in vitro contamination of explants from greenhouse- và field-grown trees. In Vitro Cell. Dev. Biol. ‒ Plant 38: 468-471.
Nitsch J.P., 1969. Experimental vàrogenesis in Nicotiana. Phytomorphology 19: 389-404.
Nongdam P., TikendraL., 2014. Establishment of an efficient in vitro regeneration protocol for rapid và mass propagation of Dendrobium chrysotoxum Lindl. using seed culture. Scientific World J. 2014: Article ID 740150, 8 p.
Onwubiko N.C., Nkogho C.S., Anyanwu C.P., Onyeishi G.C., 2013. Effect of different concentration of sterilant và exposure time on sweet potato (Ipomoea batatas Lam) explants. Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci. 2(8): 14-20.
Pant B., ThapaD., 2012. In vitro mass propagation of an epiphytic orchid, Dendrobium primulinum Lindl. through shoot tip culture. Afr. J. Biotechnol. 11(42): 9970-9974.
Paul S., KumariaS., Tvàon P., 2012. An effective nutrient medium for asymbiotic seed germination và large-scale in vitro regeneration of Dendrobium hookerianum, a threatened orchid of northeast India. AoB Plants 2012; plr032.
Pradhan S., Paudel Y.P., Pant B., 2013. Efficient regeneration of plants from shoot tip explants of Dendrobium densiflorum Lindl., a medicinal orchid. Afr. J. Biotech. 12: 1378-1383.
Prażak R., 2013. The influence of zinc on growth và development of Dendrobium kingianum Bidwill in in vitro culture. Electronic J. Polish. Agric. Univ. 16(2), #6. Available online at http://www.ejpau. media.pl/volume16/issue2/art-06.html; cited on 27 March 2016.
PriyaKumari I., SabinaGeorge T., Rajmohan K., 2013. Influence of plant growth regulators on in vitro clonal propagation of Dendrobium Sonia ‘Earsakul’.J. Biol. Innov. 2(2): 51-58.
PuchooaD., 2004. Comparison of different culture media for the in vitro culture of Dendrobium (Orchideaceae). Int. J. Agric. Biol. 6: 884-888.
Qian W.L., Zhang J.X., Wu K.L., Zeng S.J., Duan J., 2013. Study on propagation và cultivation technique of Dendrobium huoshanense seedlings. J. Trop. Subtrop. Bot. 21(3): 240-246.
Qian X., Wang C.X., Ouyang T., Tian M., 2014. In vitro flowering và fruiting in culture of Dendrobium officinate [sic] Kimura et Migo. (Orchidaceae). Pak. J. Bot. 46(5): 1877-1882.
Rao S., Barman B., 2014. In vitro micropropagation of Dendrobium chrysanthum Wall. ex Lindl. ‒ a threatened orchid. Scholars Acad. J. Biosci. 2(1): 39-42.
SharmaK.K.R., SharmaB., MajumdarS., 2005. Micropropagation of Dendrobium fimbriatum Hook. by green pod culture. J. Plant Biol. 48: 253-257.
SharmaU., RamaRao V., Mohan J.S.S., ReddyA.S., 2007. In vitro propagation of Dendrobium microbulbon A. Rich – A rare ethnomedicinal herb. Indian J. Biotechnol. 6: 381-384.
Soares J.S., RosaY.B.C.J., Suzuki R.M., Scalon S.P.Q., RosaJuniorE.J., 2012. Germinação assimbiótica e desenvolvimento de Dendrobium nobile Lindl. sob efeito de reguladores vegetais no tratamento pré-germinativo. Rev. Bras. Plantas Med. 14: 617-623 (in Portuguese with English abstract).
Soares J.S., RosaY.B.C.J., Suzuki R.M., Scalon S.P.Q., RosaJuniorE.J., 2013. In vitro cultivation of Dendrobium nobile using coconut water in the culture medium. Hortic. Bras. 31(1): 63-67 (in Portuguese with English abstract).
Soetopo L., Purnamaningisih S.L., 2012. Dendrobium và Phalaenopsis germplasms conservation by cloning technology. Agrivita J. Agric. Sci. 34 (2): 115-126.
Soundararajan T., 2009. Micropropagation studies on Bacopa monnieri, Nerium olevàer và Bioreactor studies on micropropagation of Dendrobium, an orchid. PhD thesis, Bharath University, India, 191 p.
Stewart S., ZettlerL., Minso J., Brown P., 2003. Symbiotic germination và reintroduction of Spiranthes brevilabris Lindley, an endangered orchid native to Florida. Selbyana 24: 64-70.
Su Z., Wang C.B., 2014. Tissue culture propagation techniques of Dendrobium dixanthum. For. Inventory Planning 39(6): 160-163.
Sugii N.C., 2011. The establishment of axenic seed và embryo cultures of endangered Hawaiian plant species: special review of disinfection protocols. In Vitro Cell. Dev. Biol. ‒ Plant 47: 157-169.
Sujjaritthurakarn P., Kanchanapoom K., 2011. Efficient direct protocorm-like bodies induction of dwarf Dendrobium using thidiazuron. Not. Sci. Biol. 3: 88-92.
SunitibalaH., KishorR., 2009. Micropropagation of Dendrobium transparens L. from axenic pseudobulb segments. Indian J. Biotech. 8: 448-452.
TakamiyaT., Wongsawad P., ajimaN., hiodaN., u J.F., Wen C.L., Wu J.B., vàaT., ijimaH., KitanakaS., YukawaT., 2011. Identification of Dendrobium species used for herbal medicines based on ribosomal DNA internal transcribed spacer sequence. Biol. Pharm. Bull. 34(5): 779-782.
Tan X.M., Wang C.L., Chen X.M., Zhou Y.Q., Wang Y.Q., Luo A.X., Liu Z.H., Guo S.X., 2014. In vitro seed germination và seedling growth of an endangered epiphytic orchid, Dendrobium officinale, endemic to China using mycorrhizal fungi (Tulasnella sp.). Sci. Hort. 165: 62-68.
TeixeiradaSilvaJ.A., 2013. The role of thin cell layers in regeneration và transformation in orchids. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 113(2): 149-161.
TeixeiradaSilvaJ.A., Dobránszki J., 2013. Plant thin cell layers: a 40-year celebration. J. Plant Growth Reg. 32(4): 922-943.
TeixeiradaSilvaJ.A., Dobránszki J., Cardoso J.C., Zeng S.J., 2015a. Dendrobium micropropagation: a review. Plant Cell Rep. 34(5): 671-704.
TeixeiradaSilvaJ.A., Jin X.H., Dobránszki J., Lu J.J., Wang H.Z., Zotz G., Cardoso J.C., Zeng S.J., 2016. Advances in Dendrobium molecular research: applications in genetic variation, identification và breeding. Mol. Phylogen. Evol. 95: 196-216. Soares J.S., RosaY.B.C.J., Suzuki R.M., Scalon S.P.Q., RosaJuniorE.J., 2013. In vitro cultivation of Dendrobium nobile using coconut water in the culture medium. Hortic. Bras. 31(1): 63-67 (in Portuguese with English abstract).
Soetopo L., Purnamaningisih S.L., 2012. Dendrobium và Phalaenopsis germplasms conservation by cloning technology. Agrivita J. Agric. Sci. 34 (2): 115-126.
Soundararajan T., 2009. Micropropagation studies on Bacopa monnieri, Nerium olevàer và Bioreactor studies on micropropagation of Dendrobium, an orchid. PhD thesis, Bharath University, India, 191 p.
Stewart S., ZettlerL., Minso J., Brown P., 2003. Symbiotic germination và reintroduction of Spiranthes brevilabris Lindley, an endangered orchid native to Florida. Selbyana 24: 64-70.
Su Z., Wang C.B., 2014. Tissue culture propagation techniques of Dendrobium dixanthum. For. Inventory Planning 39(6): 160-163.
Sugii N.C., 2011. The establishment of axenic seed và embryo cultures of endangered Hawaiian plant species: special review of disinfection protocols. In Vitro Cell. Dev. Biol. ‒ Plant 47: 157-169.
Sujjaritthurakarn P., Kanchanapoom K., 2011. Efficient direct protocorm-like bodies induction of dwarf Dendrobium using thidiazuron. Not. Sci. Biol. 3: 88-92.
SunitibalaH., KishorR., 2009. Micropropagation of Dendrobium transparens L. from axenic pseudobulb segments. Indian J. Biotech. 8: 448-452.
TakamiyaT., Wongsawad P., ajimaN., hiodaN., u J.F., Wen C.L., Wu J.B., vàaT., ijimaH., KitanakaS., YukawaT., 2011. Identification of Dendrobium species used for herbal medicines based on ribosomal DNA internal transcribed spacer sequence. Biol. Pharm. Bull. 34(5): 779-782.
Tan X.M., Wang C.L., Chen X.M., Zhou Y.Q., Wang Y.Q., Luo A.X., Liu Z.H., Guo S.X., 2014. In vitro seed germination và seedling growth of an endangered epiphytic orchid, Dendrobium officinale, endemic to China using mycorrhizal fungi (Tulasnella sp.). Sci. Hort. 165: 62-68.
TeixeiradaSilvaJ.A., 2013. The role of thin cell layers in regeneration và transformation in orchids. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 113(2): 149-161.
TeixeiradaSilvaJ.A., Dobránszki J., 2013. Plant thin cell layers: a 40-year celebration. J. Plant Growth Reg. 32(4): 922-943.
TeixeiradaSilvaJ.A., Dobránszki J., Cardoso J.C., Zeng S.J., 2015a. Dendrobium micropropagation: a review. Plant Cell Rep. 34(5): 671-704.
TeixeiradaSilvaJ.A., Jin X.H., Dobránszki J., Lu J.J., Wang H.Z., Zotz G., Cardoso J.C., Zeng S.J., 2016. Advances in Dendrobium molecular research: applications in genetic variation, identification và breeding. Mol. Phylogen. Evol. 95: 196-216. Soares J.S., RosaY.B.C.J., Suzuki R.M., Scalon S.P.Q., RosaJuniorE.J., 2013. In vitro cultivation of Dendrobium nobile using coconut water in the culture medium. Hortic. Bras. 31(1): 63-67 (in Portuguese with English abstract).
Soetopo L., Purnamaningisih S.L., 2012. Dendrobium và Phalaenopsis germplasms conservation by cloning technology. Agrivita J. Agric. Sci. 34 (2): 115-126.
Soundararajan T., 2009. Micropropagation studies on Bacopa monnieri, Nerium olevàer và Bioreactor studies on micropropagation of Dendrobium, an orchid. PhD thesis, Bharath University, India, 191 p.
Stewart S., ZettlerL., Minso J., Brown P., 2003. Symbiotic germination và reintroduction of Spiranthes brevilabris Lindley, an endangered orchid native to Florida. Selbyana 24: 64-70.
Su Z., Wang C.B., 2014. Tissue culture propagation techniques of Dendrobium dixanthum. For. Inventory Planning 39(6): 160-163.
Sugii N.C., 2011. The establishment of axenic seed và embryo cultures of endangered Hawaiian plant species: special review of disinfection protocols. In Vitro Cell. Dev. Biol. ‒ Plant 47: 157-169.
Sujjaritthurakarn P., Kanchanapoom K., 2011. Efficient direct protocorm-like bodies induction of dwarf Dendrobium using thidiazuron. Not. Sci. Biol. 3: 88-92.
SunitibalaH., KishorR., 2009. Micropropagation of Dendrobium transparens L. from axenic pseudobulb segments. Indian J. Biotech. 8: 448-452.
TakamiyaT., Wongsawad P., ajimaN., hiodaN., u J.F., Wen C.L., Wu J.B., vàaT., ijimaH., KitanakaS., YukawaT., 2011. Identification of Dendrobium species used for herbal medicines based on ribosomal DNA internal transcribed spacer sequence. Biol. Pharm. Bull. 34(5): 779-782.
Tan X.M., Wang C.L., Chen X.M., Zhou Y.Q., Wang Y.Q., Luo A.X., Liu Z.H., Guo S.X., 2014. In vitro seed germination và seedling growth of an endangered epiphytic orchid, Dendrobium officinale, endemic to China using mycorrhizal fungi (Tulasnella sp.). Sci. Hort. 165: 62-68.
TeixeiradaSilvaJ.A., 2013. The role of thin cell layers in regeneration và transformation in orchids. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 113(2): 149-161.
TeixeiradaSilvaJ.A., Dobránszki J., 2013. Plant thin cell layers: a 40-year celebration. J. Plant Growth Reg. 32(4): 922-943.
TeixeiradaSilvaJ.A., Dobránszki J., Cardoso J.C., Zeng S.J., 2015a. Dendrobium micropropagation: a review. Plant Cell Rep. 34(5): 671-704.
TeixeiradaSilvaJ.A., Jin X.H., Dobránszki J., Lu J.J., Wang H.Z., Zotz G., Cardoso J.C., Zeng S.J., 2016. Advances in Dendrobium molecular research: applications in genetic variation, identification và breeding. Mol. Phylogen. Evol. 95: 196-216.
TeixeiradaSilvaJ.A., Kulus D., 2014. Chrysanthemum biotechnology: discoveries from the recent literature. Folia Hort. 26(2): 67-77.
TeixeiradaSilvaJ.A., TsavkelovaE., Ng T.B., Dobránszki J., Parthibhan S., Cardoso J.C., Rao M.V., Zeng S.J., 2015b. Asymbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium. Plant Cell Rep. 34(10): 1685-1706.
TeixeiradaSilvaJ.A., TsavkelovaE., Zeng S.J., Ng T.B., Dobránszki J., Parthibhan S., Cardoso J.C., Rao M.V., 2015c. Symbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium: fungal và bacterial partners và their influence on plant growth và development. Planta 242(1): 1-22.
TeixeiradaSilvaJ.A., Winarto B., 2016. Somatic embryogenesis in two orchid genera (Cymbidium, Dendrobium). In: In Vitro Plant Embryogenesis in Higher Plants. M.A. Germanà và M. Lambardi (eds), Springer Science+Business Medium – Humana Press, Berlin, Germany: 371-386.
Traore A., Xing Z., BonserA., Carlson J., 2005. Optimizing a protocol for sterilization và in vitro establishment of vegetative buds from mature Douglas fir trees. HortScience 40(5): 1464-1468.
Udomdee W., Wen P.J., Lee C.Y., Chin S.W., Chen F.Y., 2014. Effect of sucrose concentration và seed maturity on in vitro germination of Dendrobium nobile hybrids. Plant Growth Regul. 72: 249-255.
Unemoto L.K., FariaR.T., Destro D., BarbosaC.M., Lone A.B., 2009. Survival và differentiation of Oncidium flexuosum protocorm submitted to peracetic acid và colchicine treatment. Acta Scient. Agron. 31(3): 503-508 (in Portuguese with English abstract).
Vacin E., Went F.W., 1949. Some pH changes in nutrient solutions. Bot. Gaz. 110: 605-613.
VijayakumarS., Rajalkshmi G., Kalimuthu K., 2012. Propagation of Dendrobium aggregatum through the culture of immature seeds from green capsules. Lankesteriana 12(2): 131-135.
Wang X.H., Cheng Y., Tan X., Zhang F.K., Li J.L., Liu G.M., 2013. In vitro rapid propagation Dendrobium officinale Kimura et Migo. J. Tropical Biol. 4(4): 374- 380.
Warcup J., 1981. The mycorrhizal relationships of Australian orchids. New Phytol. 87: 371-381.
Winarto B., Rachmawati F., 2013. In vitro propagation protocol of Dendrobium ‘Gradita 31’ via protocorm TeixeiradaSilvaJ.A., Kulus D., 2014. Chrysanthemum biotechnology: discoveries from the recent literature. Folia Hort. 26(2): 67-77.
TeixeiradaSilvaJ.A., TsavkelovaE., Ng T.B., Dobránszki J., Parthibhan S., Cardoso J.C., Rao M.V., Zeng S.J., 2015b. Asymbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium. Plant Cell Rep. 34(10): 1685-1706.
TeixeiradaSilvaJ.A., TsavkelovaE., Zeng S.J., Ng T.B., Dobránszki J., Parthibhan S., Cardoso J.C., Rao M.V., 2015c. Symbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium: fungal và bacterial partners và their influence on plant growth và development. Planta 242(1): 1-22.
TeixeiradaSilvaJ.A., Winarto B., 2016. Somatic embryogenesis in two orchid genera (Cymbidium, Dendrobium). In: In Vitro Plant Embryogenesis in Higher Plants. M.A. Germanà và M. Lambardi (eds), Springer Science+Business Medium – Humana Press, Berlin, Germany: 371-386.
Traore A., Xing Z., BonserA., Carlson J., 2005. Optimizing a protocol for sterilization và in vitro establishment of vegetative buds from mature Douglas fir trees. HortScience 40(5): 1464-1468.
Udomdee W., Wen P.J., Lee C.Y., Chin S.W., Chen F.Y., 2014. Effect of sucrose concentration và seed maturity on in vitro germination of Dendrobium nobile hybrids. Plant Growth Regul. 72: 249-255.
Unemoto L.K., FariaR.T., Destro D., BarbosaC.M., Lone A.B., 2009. Survival và differentiation of Oncidium flexuosum protocorm submitted to peracetic acid và colchicine treatment. Acta Scient. Agron. 31(3): 503-508 (in Portuguese with English abstract).
Vacin E., Went F.W., 1949. Some pH changes in nutrient solutions. Bot. Gaz. 110: 605-613.
VijayakumarS., Rajalkshmi G., Kalimuthu K., 2012. Propagation of Dendrobium aggregatum through the culture of immature seeds from green capsules. Lankesteriana 12(2): 131-135.
Wang X.H., Cheng Y., Tan X., Zhang F.K., Li J.L., Liu G.M., 2013. In vitro rapid propagation Dendrobium officinale Kimura et Migo. J. Tropical Biol. 4(4): 374- 380.
Warcup J., 1981. The mycorrhizal relationships of Australian orchids. New Phytol. 87: 371-381.
Winarto B., Rachmawati F., 2013. In vitro propagation protocol of Dendrobium ‘Gradita 31’ via protocorm TeixeiradaSilvaJ.A., Kulus D., 2014. Chrysanthemum biotechnology: discoveries from the recent literature. Folia Hort. 26(2): 67-77.
TeixeiradaSilvaJ.A., TsavkelovaE., Ng T.B., Dobránszki J., Parthibhan S., Cardoso J.C., Rao M.V., Zeng S.J., 2015b. Asymbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium. Plant Cell Rep. 34(10): 1685-1706.
TeixeiradaSilvaJ.A., TsavkelovaE., Zeng S.J., Ng T.B., Dobránszki J., Parthibhan S., Cardoso J.C., Rao M.V., 2015c. Symbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium: fungal và bacterial partners và their influence on plant growth và development. Planta 242(1): 1-22.
TeixeiradaSilvaJ.A., Winarto B., 2016. Somatic embryogenesis in two orchid genera (Cymbidium, Dendrobium). In: In Vitro Plant Embryogenesis in Higher Plants. M.A. Germanà và M. Lambardi (eds), Springer Science+Business Medium – Humana Press, Berlin, Germany: 371-386.
Traore A., Xing Z., BonserA., Carlson J., 2005. Optimizing a protocol for sterilization và in vitro establishment of vegetative buds from mature Douglas fir trees. HortScience 40(5): 1464-1468.
Udomdee W., Wen P.J., Lee C.Y., Chin S.W., Chen F.Y., 2014. Effect of sucrose concentration và seed maturity on in vitro germination of Dendrobium nobile hybrids. Plant Growth Regul. 72: 249-255.
Unemoto L.K., FariaR.T., Destro D., BarbosaC.M., Lone A.B., 2009. Survival và differentiation of Oncidium flexuosum protocorm submitted to peracetic acid và colchicine treatment. Acta Scient. Agron. 31(3): 503-508 (in Portuguese with English abstract).
Vacin E., Went F.W., 1949. Some pH changes in nutrient solutions. Bot. Gaz. 110: 605-613.
VijayakumarS., Rajalkshmi G., Kalimuthu K., 2012. Propagation of Dendrobium aggregatum through the culture of immature seeds from green capsules. Lankesteriana 12(2): 131-135.
Wang X.H., Cheng Y., Tan X., Zhang F.K., Li J.L., Liu G.M., 2013. In vitro rapid propagation Dendrobium officinale Kimura et Migo. J. Tropical Biol. 4(4): 374- 380.
Warcup J., 1981. The mycorrhizal relationships of Australian orchids. New Phytol. 87: 371-381.
Winarto B., Rachmawati F., 2013. In vitro propagation protocol of Dendrobium ‘Gradita 31’ via protocorm like bodies. Thammasat Int. J. Sci. Technol. 18(2): 54-68.
Winarto B., Rachmawati F., Santi A., TeixeiradaSilvaJ.A., 2013. Mass propagation of Dendrobium ‘Zahra FR 62’, a new hybrid used for cut flowers, using bioreactor culture. Sci. Hortic. 161: 170-180.
Winarto B., TeixeiradaSilvaJ.A., 2012. Sterilization procedures for in vitro culture of leatherleaf fern (Rumohra adiantiformis). Int. J. Plant Dev. Biol. 6(1):46-50.
Winarto B., TeixeiradaSilvaJ.A., 2015. The use of coconut water và fertilizer for the in vitro proliferation và plantlet production of Dendrobium ‘Gradita 31’. In Vitro Cell. Dev. Biol. ‒ Plant 51(3): 303-314.
Yang N., Chen Z.L., Duan J., Zeng S.J., 2006. In vitro propagation of Dendrobium cochliodes Schltr. Plant Physiol. Commun. 42(2): 248.
Yao C., Li Z.S., Li W.S., Gen X.Y., Bai Y.B., Zhou H.G., 2015. Research on the tissue culture và rapid propagation technology of Dendrobium falconeri Hook. J. Anhui Agri. Sci. 43(30): 33-34, 69 (in Chinese with English abstract).
Yeoman M.M., Macleod A.J., 1977. Tissue (callus) culture technique. In: Plant Tissue và Cell Culture. H.E. Street (ed.), Blackwell Scientific Publications, Oxford: 31-59.
Zhao D., Hu G., Chen Z., Shi Y., Zheng L., Tang A., Long C., 2013. Micropropagation và in vitro flowering of Dendrobium wangliangii: A critically endangered medicinal orchid. J. Med. Plant Res. 7(28): 2098-2110.
Zhao M.M., Zhang G., Zhang D.W., Hsiao Y.Y., Guo S.X., 2013. ESTs analysis reveals putative genes involved in symbiotic seed germination in Dendrobium officinale. PLoS ONE 8: 1-10.
Zhao P., Wu F., Feng F.S., Wang W.J., 2008. Protocorm-like body (PLB) formation và plant regeneration from the callus culture of Dendrobium cvàidum Wall ex Lindl. In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant 44: 178-185.
Zhou X.K., Lan S.R., Peng D.H., Wu S.S., Jiang M.T., Zhang L.Y., 2014. In vitro tissue culture và plant regeneration from mature embryos of Dendrobium warkianum. J. Fujian Coll. Forestry 34(4): 289-296.

 

 

 

 

 

 

 

 

Facebook Comments

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *