Nhân giống in-vitro Lan Hài Paphiopedilum

Nhân giống invitro lan Hài Paphiopedilum: Paphiopedilum là một trong những loài lan nổi tiếng và cũng khá hiếm. Các thành viên của loài này được bán và trưng bày dưới dạng chậu cây cảnh và hoa cắt cành. Các quần thể hoang dã của Paphiopedilum đang bị đe doạ bởi sự tuyệt chủng do sự khai thác quá mức và mất môi trường sống thích hợp.

Việc giảm giá trị thương mại thông qua việc nhân giống trong ống nghiệm với quy mô lớn là một giải pháp để giảm áp lực từ việc khai thác bất hợp pháp, cố gắng đáp ứng các nhu cầu thương mại và thiết lập lại các loài bị đe doạ để đưa trở lại hoang dã. Mặc dù Paphiopedilum được nhân giống thương mại hóa thông qua việc nảy mầm không cộng sinh, nhưng vẫn được xem là khó nhân giống in vitro, đặc biệt là sự tái sinh cây con từ nuôi cấy mô. Đánh giá này nhằm mục đích đề cập đến các khía cạnh quan trọng nhất và cập nhật nghiên cứu tiến bộ trong nhân giống in vitro Paphiopedilum đồng thời nhấn mạnh tầm quan trọng của việc cải tiến thêm các quy trình nuôi cấy mô từ các mẫu cấy ex vitro.

Giới thiệu phương pháp nhân giống in-vitro Lan Hài Paphiopedilum

Paphiopedilum Pfitzer (Orchidaceae) thường được biết đến là lan hài vì hoa của chúng có hình cái túi giống như chiếc hài của phụ nữ. Các thành viên của chi này là một trong những loài hoa lan phổ biến nhất và được thương mại hóa dưới dạng những chậu hoa kiểng và hoa cắt cành vì chúng có rất nhiều hình dạng hoa, kích cỡ và màu sắc, đã thu hút sự quan tâm của nhiều người trồng lan và những người chơi lan. Paphiopedilum là một trong những giống lan phổ biến và hiếm được bán và trưng bày ngày nay (Cribb, 1998, Liu và cộng sự, 2009, Sheehan & Sheehan, 1994). Chi Paphiopedilum có khoảng 96-100 loài và phạm vi phân bố của nó trải dài từ phía đông Ấn Độ qua miền Nam Trung Quốc đến Philippines, Đông Nam Á và quần đảo Mã Lai đến New Guinea và quần đảo Solomon (Cribb, 1998; Liu và cộng sự, 2009, World Checklist of Selected Plant Families, 2014, Wu và cộng sự, 2009). Các quần thể tự nhiên đang bị đe doạ bởi sự tuyệt chủng do hậu quả của việc khai thác quá mức và mất môi trường sống thích hợp, và tất cả các loài Paphiopedilum được liệt kê trong Công ước về thương mại quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES) Phụ lục I. Theo CITES, việc buôn bán các loài này là bị cấm (Zeng và cộng sự, 2012).

Lan Paphiopedilum thường được nhân giống qua sự phân chia chồi nách từ cây mẹ. Phương pháp nhân giống truyền thống này rất không hiệu quả và mất thời gian. Trong môi trường tự nhiên, hạt giống Paphiopedilum nảy mầm tương đối chậm do đặc điểm hình thái và sinh lý, tương tự như các loài hoa lan khác (Lee và cộng sự, 2006; Rasmussen, 1995, Zeng và cộng sự, 2012). Việc khám phá ra sự nảy mầm không cộng sinh ở hoa lan bởi Knudson (1921) là phương pháp nhân giống in vitro thực tiễn đầu tiên của bất kỳ loài thực vật nào dưới điều kiện vô trùng. Sự nảy mầm in vitro của Paphiopedilum, thông qua sự kết hợp hữu sinh và vô sinh, là một phương pháp phổ biến cho việc nuôi cấy in vitro (Zeng et al., 2013). Ở Paphiopedilum, đã có 58 phương pháp nảy mầm in vitro được mô tả, hoặc 80.6% trong số tất cả các nghiên cứu in vitro (Vật liệu bổ sung). Tuy nhiên, việc xử lý hạt giống và tỷ lệ nẩy mầm của nhiều loài/cây Paphiopedilum là rất thấp và thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố không xác định (Arditti, 2008 Pierik et al., 1988). Sự thành công của quá trình vi nhân giống Paphiopedilum từ các mẫu mô cấy ex vitro thì tương đối hạn chế do nguồn nguyên liệu hiếm, những khó khăn liên quan đến sự nhiễm bẩn vi khuẩn và nấm của mẫu cấy và sự phát triển kém của các mẫu mô cấy sống sót dưới điều kiện in vitro (Huang, 1988; Stewart & Button, 1975). Các loài hoa lan (Paphiopedilum) và cây lai là những cây lan được thương mại hóa duy nhất không được nhân bản (Huang, 1988, Liao và cộng sự, 2011, Ng & Saleh, 2011). Tuy nhiên, sự nhân lên nhanh chóng các nhân bản vô tính, sản xuất các cây khỏe mạnh và không có bệnh và việc đưa nhanh các giống mới với các tính trạng mong muốn là rất cần thiết trong các chương trình cải tạo Paphiopedilum, và để giải quyết vấn đề này, các kỹ thuật nuôi cấy dường như đóng một vai trò quan trọng.

Nhân giống in vitro loài Paphiopedilum/ giống lai

Đến nay đã có 75 nghiên cứu được báo cáo về sự nhân giống in vitro các loài Paphiopedilum và cây trồng, trong đó có gần 32 loài bản địa và hơn 30 giống lai. Tuy nhiên, có 58 nghiên cứu được báo cáo cho sự nảy mầm bằng hạt và hình thành PLB (Protocorm Like Bodies: thể tiền chồi) sau đó. Hầu hết các mẫu nuôi cấy của quá trình vi nhân giống Paphiopedilum được sử dụng có nguồn gốc từ nguyên vật liệu in vitro của giống lai Paphiopedilum và chỉ có ba báo cáo có nguyên vật liệu nguồn gốc từ các mẫu cấy ex vitro.

Sự nảy mầm không cộng sinh

Cho đến gần đây, do sự hạn chế trong các quy trình nuôi cấy mô, sự nhân giống thương mại Paphiopedilum của người trồng vẫn còn hoàn toàn thông qua việc nảy mầm không cộng sinh (Hong và cộng sự, 2008). Sự nảy mầm không cộng sinh từ hạt giống Paphiopedilum trưởng thành thường gặp nhiều khó khăn và khác biệt (Pierik et al., 1988, Stimart & Ascher, 1981). Sự nẩy mầm và phát triển của hạt Paphiopedilum chịu ảnh hưởng đáng kể bởi một số yếu tố, bao gồm sự trưởng thành của hạt, tiền xử lý hạt, thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và phương pháp nuôi cấy. Một số kết quả thí nghiệm, chẳng hạn như tỷ lệ nảy mầm của hạt giống của cùng một loài trên cùng một môi trường, đã được chứng minh là không nhất quán, ví dụ tỷ lệ nảy mầm của 120 ngày sau khi thụ phấn (DAP) của hạt P. armeniacum là 25.2% (Chen và cộng sự, 2004b) và 18.4% (Ding và các cộng sự, 2004) trên môi trường Robert Ernst (RE, Arditti và cộng sự, 1982).

Sự nảy mầm từ hạt và sự phát triển mầm đốt thân của Paphiopedilum

Sự nảy mầm, tăng trưởng của cây con và sự phát triển trong ống nghiệm của Paphiopedilum thường được chia thành 5 giai đoạn: (1A-F, Zeng và cộng sự, 2012): (1) quá trình tách vỏ hạt giống bằng cách phình to của phôi (quá trình nảy mầm); (2) sự xuất hiện của chồi (mô phân sinh non) và/hoặc rễ giả; (3) sự xuất hiện và sự kéo dài của lá thứ nhất; (4) sự hiện diện của một lá và một hoặc nhiều rễ; (5) sự hiện diện của hai hoặc nhiều lá và rễ, hình thành cây con. Tốc độ nảy mầm có thể đơn giản được tính trong mỗi giai đoạn phát triển (tức là mỗi đơn vị thời gian) bằng cách chia số lượng hạt cho số lượng các mầm đốt thân.

Ảnh hưởng của hạt giống trưởng thành và quá trình tiền xử lý đối với sự nảy mầm không cộng sinh

Ở hoa lan, phôi hợp tử biệt hóa rất kém, và những mô phân sinh và lá mầm thường không có mặt tại thời điểm sự phát tán hạt (Yeung và cộng sự, 1996). Hiện nay, thông tin về sự phát triển phôi ở các loài Paphiopedilum là rất hạn chế, và chỉ có một vài báo cáo về P. insigne (Nagashima, 1982, Zinger & Poddubnaya-Arnoldi, 1966), P. godefroyae (Ren & Wang, 1987), P Delenatii (Lee và cộng sự, 2006) và P. hirsutissinum, P.appletonianum và P. armeniacum (Zhang và cộng sự, 2013). Những quan sát quan trọng và chi tiết được thực hiện bởi Lee et al. (2006), người phát hiện rằng thụ tinh xảy ra ở khoảng 60 và 75 DAP, hợp tử và mầm phôi có thể được quan sát trong các túi nang, mặc dù kết quả không được định lượng. Trong giai đoạn đầu của hình dạng cầu (90 DAP), sự phân chia tế bào bổ sung đã xảy ra ở lớp bên trong cũng như lớp bề mặt, dẫn đến sự phát triển của phôi hoàn thiện. Tầng nguyên bì rõ rệt đã được tìm thấy ở khoảng 105 DAP, khi 105 DAP, những bào quan nhỏ với các hạt tinh bột, ty thể, lipid và những không bào nhỏ đã được nhìn thấy dễ dàng trong các tế bào của phôi hoàn thiện. Khi phôi đạt đến giai đoạn hình cầu hoàn toàn (150 DAP), hoạt động phân bào ngừng lại. Một lượng lớn không bào trong tế bào chất giảm xuống và tế bào chất trở nên đậm đặc. Lớp vỏ hạt có nguồn gốc từ các tế bào bên trong và bên ngoài của noãn. Các tế bào của các lớp bên trong của vỏ hạt đã hình dạng mảnh mai, trong khi các lớp bên ngoài lại rộng hơn. Trong giai đoạn hình cầu của phôi (150 DAP), lớp ngoài của vỏ bắt đầu co lại và teo lại dần dần, và lớp biểu bì bao phủ toàn bộ phôi và vỏ bên trong noãn và phôi, tạo ra một hàng rào không thấm nước và sự hấp thu chất dinh dưỡng ở hạt giống P. delenatii trưởng thành. Giống như các loài lan khác, không thấy nội nhũ vì vỏ hạt của hầu hết cây lan thường xuất phát từ phần ngoài (Yeung và cộng sự, 1996) mặc dù vỏ hạt của P. delenati có nguồn gốc từ cả phần tế bào bên trong và bên ngoài. Ngoài ra, các hình thái đặc trưng của tế bào vận chuyển và không có lớp biểu bì trong thành tế bào sợi treo đã chứng minh giả thiết rằng sợi treo là điểm hấp thụ dinh dưỡng chính cho phôi phát triển ở P. delenatii (Lee và cộng sự, 2006).

Dưới các điều kiện nảy mầm thích hợp, phôi hoàn toàn hình thành và vỏ hạt có thể không bị hóa gỗ, cho phép nó có thể thẩm thấu được nước và các chất dinh dưỡng. Hạt 90-DAP chưa trưởng thành của Paphiopedilum wardii không nảy mầm và hóa nâu ngay sau khi cấy và hạt 120-DAP cần khoảng thời gian dài hơn 150-DAP để nảy mầm hoặc để trưởng thành hơn, cho thấy rằng những noãn lan còn non không thích hợp cho sự nảy mầm và có thể cần thời gian cho sự hình thành bộ phận hoặc tổng hợp các chất dinh dưỡng hoặc để giúp phôi nhận ra các chất kích thích có trong môi trường, do đó cho phép chúng nảy mầm (Nhut et al., 2005, Zeng và cộng sự, 2012). Ngoài ra, phôi có thể kém phát triển để hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường (Long và cộng sự, 2010). 180 hạt DAP của P. wardii có thể nảy mầm tốt nhờ sự huy động protein hiệu quả trong quá trình bù nước và vỏ phôi chưa phát triển (Bảng 1, Rasmussen, 1995, Zeng và cộng sự, 2012). Một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Paphiopedilum trưởng thành: vỏ hạt không thấm nước (Van Waes & Debergh, 1986a), sự có mặt của các chất ức chế hóa học như abscisic acid (ABA), hoặc thiếu hormone kích thích sự nẩy mầm (Van der Kinderen, 1987). Trong các điều kiện nảy mầm thích hợp, phôi bào tử của hầu hết các hạt trưởng thành hoàn toàn và vỏ hạt có thể không bị hóa gỗ, cho phép nó có thể thẩm thấu được nước và các chất dinh dưỡng trong khi các hạt trưởng thành có thể có khả năng nhân giống và bảo quản lớn hơn do lớp vỏ hạt đã hoàn thiện và lượng nước thấp hơn (Miyoshi & Mii, 1998, Zhang và cộng sự, 2013).

Sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum và sự phát triển mầm đốt thân được kích thích bằng phương pháp tiền xử lý phù hợp, bao gồm natri hypochlorite (NaOCl) hoặc NaOH (Lee, 2007, Liao & Chen, 2006, Zeng và cộng sự, 2012). Loại, nồng độ của dung dịch tiền xử lý và thời gian tiền xử lý là những yếu tố chính. Zeng và các cộng sự (2012) báo cáo rằng việc xử lý trước hạt giống P. wardii (360 DAP) với dung dịch NaOCl có chứa 0.5% Clo trong 60 phút hoặc 1.0% Clo trong 40 phút làm tang đáng kể tỷ lệ nảy mầm (70.33 và 67.67%) so với các phương pháp tiền xử lý khác và việc kiểm soát (dung dịch 0.1% HgCl2) và tất cả phương pháp tiền xử lý đã rút ngắn đáng kể thời gian cho sự nảy mầm. Việc tiền xử lý bằng NaOCl, NaOH hoặc Ca(OCl)2 có thể đã ăn mòn vỏ hạt và tăng tính thẩm thấu của hạt với oxy và các chất dinh dưỡng (Major & Wright, 1974, Rasmussen, 1995 Van Waes & Debergh, 1986 a, b), trong khi các chất ức chế như ABA có thể bị giảm trong hạt (Lee, 2007, Van der Kinderen, 1987). Tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp hoặc không nảy mầm có thể là vì hạt bị hư hại do thời gian xử lý với NaOCl quá dài (Kaneko & Morohashi, 2003).

Hình 1. Nuôi cấy in vitro, phát triển cây con và đưa Paphiopedilum wardii Sumerh trở lại môi trường tự nhiên. (A) giai đoạn 0, hạt giống, không nảy mầm. (B) Giai đoạn 1, tvỏ hạt bị vỡ. (C) Giai đoạn 2, xuất hiện của rễ giả. (D) Giai đoạn 3, sự xuất hiện và sự kéo dài của lá thứ nhất. (E) Giai đoạn 4, một lá và xuất hiện rễ. (F) Giai đoạn 5, có hai hoặc nhiều lá. (G) Sự nảy mầm không cộng sinh trên môi trường 1/2 MS được bổ sung với NAA 0.5 mg/L, 10% CW (v/v) và 1.0 g/L AC. (H) và (I) Phát triển cây con trên môi trường Hyponex N026 bổ sung với NAA 1.0 mg/L, 10% CW và 1.5 g/L AC. (J) Sự phát triển của cây con trên môi trường Hyponex N016 chứa 1.0 mg/L NAA, 50 g/L BH và 1.5 g/L AC. (K) Cây hoa từ cây con in vitro trong nhà kính. (L) Thiết lập các cây con in vitro trong 12 tháng sau khi tái giới thiệu.

 

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự nảy mầm không cộng sinh
Ảnh hưởng của môi trường cơ bản và pH

Bảng 1. Ảnh hưởng của mức độ trưởng thành hạt giống của Paphiopedilum lên sự nảy mầm trong ống nghiệm.

Species/cultivars Days after pollination

(DAP)

Medium Seed germination percentage (%) References
P. insigne var sanderae (Rchb.f.; O. Gruss & Roeth) 160 Hyponex 0.5 Nagashima (1982)
170 85
180 85
190 75
200 65
210 65
220 65
P. primulinum (M. W. Wood & P. Taylor) 70 1/4 MS 6.1 Lee & Lee (1999)
90 28.6
110 57.6
130 41.1
150 43.6
P. philipinense (Rchb.f.) Stein 70 1/4 MS 9.0 Lee & Lee (1999)
90 32.4
110 23.1
130 32.0
150 0
P. bellatulum (Rchb.f.) Stein 70 1/4 MS 15.8 Lee & Lee (1999)
90 60.7
110 48.1
130 69.7
150 56.8
P. delenatii Guillaumin 70 1/4 MS 15.7 Lee & Lee (1999)
90 20.0
11 37.5
130 55.6
150 68.0
210 31.0
P. armeniacum (S. C. Chen & F. Y. Liu) 60 1/5 MS 3.5 Ding et al. (2004)
80 10.3
100 22.3
120 40.6
140 32.8
160 24.7
180 22.9
P. armeniacum (S. C. Chen & F. Y. Liu) 120 1/4 MS 11.0 Chen et al. (2004a)
180 0
P. armeniacum (S. C. Chen & F. Y. Liu) 120 RE 32.4 Chen et al. (2004a)
180 0
P. micranthum (Tang & F. T. Wang) 120 RE 25.2 Chen et al. (2004a)
180 0
P. micranthum (Tang & F. T. Wang) 120 1/4 MS 11 Chen et al. (2004a)
180 0
P. delenatii Guillaumin 90 KC 0 Nhut et al. (2005)
180 8.8
270 90.1
P. armeniacum (S. C. Chen & F. Y. Liu) 86 1/4 MS 15.13 Liao & Chen (2006)
106 30.12
127 64.62
156 0
180 2.0
200 3.2
238 2.5
P. villosum var. densissimum (Z. J. Liu & S. C. Chen) 140 1/4 MS 0 Long et al. (2010)
150 0.12
160 0.17
170 0.74
180 0.9
190 0.71
200 31.33
300 13.33
P. callosum (Rchb.f.) Stein 180 1/2 RE 0
210 0
230 42
270 95
300 20
P. micranthum (Tang & F. T. Wang) 110 1/5 MS 35
Species/cultivars Days after pollination

(DAP)

Medium Seed germination percentage (%) References
120 37
130 29
140 34
150 37
160 31
170 26
180 27
190 22
200 25
210 18
P. wardii Summerh. 60 1/2 MS (half- strength macro- and

micro-nutrients, full-strength other ingredient)

0f Zeng et al. (2012)
90 0f
120 10.00e
150 31.33c
180 65.33a
210 53.33b
240 30.33c
270 20.00d
300 6.33e
330 5.67e
360 6.00e
P. hangianum (Perner & Gruss) 60 H026 medium 0f Zeng et al. (2013a)
90 12.33e
120 45.67c
150 61.00b
180 72.67a
210 59.33b
240 30.00d
270 17.67e
300 17.00e

Bảng 2: Ảnh hưởng của môi trường cơ bản lên sự nhân giống in vitro Paphiopedilum

Appropriate basal media Species/cultivars Seed germination frequency (%) or description References
Burgeff EG-1; KC; Norstog; Thomale GD P. callosum (Rchb.f.) Stein

P. hybrids (P. McLaren ParkP. White

Fringe, P. Jack Tonkin

JasonP. Hellas Westonbint,

P. parishiiP. curtisii var. Sandarae)

Burgeff EG-1 was most suitable for germination and survival in the light.

Thomale GD was most suitable for germination and survival in the dark.

Stimart & Ascher (1981)a
Hypnonex; MS P. insigne var sanderae (Rchb.f.) O. Gruss & Roeth Hypnonex was better than MS for seed germination. Nagashima (1982)a
Norstog; Burgeff EG-1 P. sukhakulii Schoser & Senghas and its four hybrids (P. sukhakulii

P. nevium, P. sukhakulii P. acmodontum, P. sukhakulii P. bellatum, P. Clair de LuneP. sukhakulii)

Norstog was suitable for seed germination

Burgeff EG-1 was suitable for protocorm differentiation and subsequent growth of the seedlings.

Tay et al. (1988)a
Modified Thomale GD1 P. ciliolare (Rchb.f.) Stein 75% Pierik et al. (1988)
KC 78 %
1/4 MS 78 %
1/2 MS 68 %
3/4 MS 58 %
MS 50 %
MS P. delenatii Guillaumin, P. bellatulum

(Rchb.f.) Stein, P. primulinum

(M. W. Wood & P. Taylor)

1/8 MS medium was most suitable for P. delenatii, 1/4 MS medium was most suitable for P. bellatulum, P. primulinum. Lee & Lee (1999)a
KC; VW; Thomale GD; Hyponex No. 1 3g/L P. delenatii Guillaumin, P. bellatulum,

(Rchb.f.) Stein, P. primulinum

(M. W. Wood & P. Taylor)

Knudson C was most suitable for P. bellatulum, Thomale GD was most suitable for P. delenatii and P. primulinum. Lee & Lee (1999)a
1/2 MS Paphiopedilum villosum var. densissimum (Z. J. Liu & S. C. Chen) 21 Long et al. (2010)
1/4 MS 14
VW 37
KC 56
MS P. armeniacum (S. C. Chen & F. Y. Liu) 2.9 Chen et al. (2004a)
1/4 MS 11.0
VW 17.3
RE 32.4
KC 16.1
Hyponex 1 9.5
1/2 MS P. armeniacum (S. C. Chen & F. Y. Liu) 15.8 Ding et al. (2004)
1/5 MS 42.5
1/10 MS 31.4
RE 18.4
Hyponex 1 23.1
MS P. micranthum (Tang & F. T. Wang) 0 Chen et al. (2004a)
1/4 MS 8.1
VW 7.2
RE 25.2
KC 11.6
Hyponex 1 5.9
KC P. delenatii Guillaumin 90.1 Nhut et al. (2005)
MS 9.0
1/2 MS 73.0
1/2 MS Paphiopedilum villosum var. densissimum (Z. J. Liu & S. C. Chen) 21% Long et al. (2010)
1/4 MS 14 %
VW 37 %
KC 56 %

Tác động của nhiều môi trường khoáng chất cơ bản đã được thử nghiệm trên sự nảy mầm in vitro của hạt Paphiopedilum. Sự nảy mầm của hạt và phát triển cây con của Paphiopedilum bị ảnh hưởng mạnh bởi thành phần khoáng chất của môi trường cơ bản (Bảng 2). Hầu hết các loài Paphiopedilum thích môi trường khoáng thấp để nảy mầm hạt và sự ức chế nảy mầm của Paphiopedilum trên môi trường Murashige và Skoog (MS, Murashige & Skoog, 1962) có thể là do hàm lượng khoáng cao (Chen et al., 2004a; Ding et. Al., 2004, Long et al., 2010, Pierik và cộng sự, 1988), như là 1/2, 1/4, 1/6, 1/5 hoặc 1/8 MS (nghĩa là /2, 1/4, 1/6, 1/5 hoặc 1/8 lượng chất dinh dưỡng vi chất và vĩ mô) đã được chứng minh phù hợp hơn (Ding và cộng sự, 2004, Lee & Lee, 1999, Zhou và cộng sự, 2013).

Môi trường lý tưởng cho sự nảy mầm của cùng một loài Paphiopedilum là khác nhau. Ví dụ, Nhut et al. (2005) báo cáo hạt giống 9 tháng tuổi của P. delenatii được nuôi cấy trên môi trường Knudson C (KC) (Knudson, 1946), là tối ưu cho sự nảy mầm in vitro so với môi trường MS hoặc 1/2 MS. Tương tự, đối với P. wardii cho thấy sự nảy mầm là thấp hơn đáng kể trên môi trường MS so với môi trường MS 1/2 (Zeng et al., 2012). Tuy nhiên, khoáng chất không phải là yếu tố duy nhất ảnh hưởng đến sự nảy mầm của P. wardii bởi vì tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp hơn đáng kể ở môi trường 1/4 MS – chứa hàm lượng khoáng chất thấp hơn so với môi trường 1/2 MS. Tuy nhiên, thành phần môi trường chính xác và tỷ lệ các khoáng chất khác nhau cũng có một ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm hạt P. wardii và phát triển cây con của P. wardii. Chẳng hạn, sự nảy mầm của hạt giống cao nhất là trên môi trường Vacin và Went (VW, Vacin & Went, 1949), nhưng chỉ có 14% mầm đốt thân phát triển thành cây con ở giai đoạn 5, thấp hơn đáng kể so với môi trường 1/2 MS và Hyponex N026, trong đó 52% các mầm đốt thân ở giai đoạn 2 đã chết (Zeng và cộng sự, 2012).

Pierik et al. (1988) báo cáo sự nảy mầm của P. ciliolare cao nhất trên môi trường KC và 1/4 MS và thấp hơn nhiều trên môi trường MS; KC dẫn đến cái chết của thực vật. Môi trường Thomale GD1 (Thomale, 1954) được sửa đổi đã cho thấy sự phát triển mầm đốt thân và tăng trưởng cây non cao hơn môi trường 1/4 MS. Sự nảy mầm của hạt P. ciliolare thấp hơn đáng kể trên môi trường 1/4 MS, mà chứa 3/4 hoặc toàn bộ muối vi lượng (trừ sắt) so với môi trường không có vi chất dinh dưỡng, nhưng sự nảy mầm của P. ciliolare không khác biệt đáng kể ở 1/4 MS chứa 1/4-, 1/2-, 3/4- hoặc toàn bộ các chất dinh dưỡng vi lượng. Sự nảy mầm của P. ciliolare không ảnh hưởng đáng kể bởi nồng độ NaFeEDTA, ở nộng độ 25 mg/L là tối ưu. Sự phát triển của cây được thúc đẩy mạnh mẽ bởi sắt, và tất cả các mầm đốt thân và cây con chết trong quá trình xử lý ánh sáng trong môi trường không chứa sắt.

Sự nảy mầm của P. villosum var. Densissimum cao hơn trên VW so với môi trường 1/4 MS, RE hoặc KC, pH ở tất cả môi trường là 5.8 (Long và cộng sự, 2010). Điều này có thể liên quan đến nồng độ muối khoáng và N vô cơ trong môi trường VW tương đối thấp (nồng độ khoáng: KC, 13.42 mM, VW, 16.3 µM, nồng độ N vô cơ: KC, 12.25 mM, VW, 3.78 mM) và nồng độ phosphat (4.74 mM) của VW cao so với 1/4 MS (0.32 mM), RE (2.21 mM) và KC (1.84 mM), mặc dù nồng độ phosphate cao gây ức chế sự phát triển mầm đốt thân tiếp theo.

Trong hầu hết các nghiên cứu Paphiopedilum, sự nảy mầm của hạt có thể đạt được ở pH 5.0-6.0 (Ernst, 1975, 1980, Fast, 1971, Flamee, 1978; Thomale, 1957, Zeng và cộng sự, 2012). Pierik et al. (1988) báo cáo rằng pH (5.5, 6.0, 6.5 và 7.0) của môi trường hầu như không ảnh hưởng đến sự nảy mầm của P. ciliolare, phản ứng tốt hơn ở pH 5.5 và 6.0, mặc dù không đáng kể, so với pH 6.5 và 7.0 . Hơn nữa, phát triển dưới ánh sáng rõ ràng là tốt hơn ở pH thấp, và pH 7.0 gây ức chế mạnh mẽ đến sự phát triển của cây con (Pierik và cộng sự, 1988).

Nguồn carbon

Carbohydrate như một nguồn năng lượng trong môi trường nuôi cấy vừa và chất thẩm thấu có ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm của Paphiopedilum và sự phát triển mầm đốt thân. Sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum không xảy ra nếu không có đường (Fast, 1971, Pierik và cộng sự, 1988). Sucrose là nguồn carbon sử dụng nhiều nhất cho sự nảy mầm của cây lan Paphiopedilum (Chen và cộng sự, 2004a, Ding và cộng sự, 2004, Hossain và cộng sự, 2013, Zeng và cộng sự, 2012). Tuy nhiên, các nguồn carbon khác bao gồm glucose, fructose, maltose và mannitol, cũng được sử dụng trong một số nghiên cứu (Long et al., 2010 Pierik et al., 1988). Pierik et al. (1988) báo cáo rằng sự nẩy mầm cao nhất (48%) trên môi trường Thomale đã biến đổi với nồng độ đường thấp nhất (0.5% glucose + 0.5% fructose), cao hơn đáng kể so với môi trường với 1.0% glucose + 1.0% fructose (37%) hoặc trên môi trường có 1.25% đường glucose + 1.25% fructose (29%), nhưng không cao hơn đáng kể so với môi trường 0,75% glucose + 0.75% fructose (41%). Long et al. (2010) báo cáo tỷ lệ nảy mầm cao hơn đáng kể (19%) của P. villosum var. densissimum trên môi trường bổ sung 2 g/L glucose so với môi trường bổ sung 2 g/L sucrose, hoặc môi trường bổ sung maltose 2 g/L hoặc malnose (0.08%). Maltose là một nguồn đường hiệu quả cho sự tăng trưởng của cây Oncidium “Vũ nữ” (Jheng et al., 2006) mặc dù Long et al. (2010) nhận thấy rằng maltose ít hiệu quả hơn glucose hoặc sucrose trong việc thúc đẩy sự nảy mầm của Paphiopedilum.

Chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau đến sự nảy mầm của các loài lan khác nhau (Teixeira da Silva, 2013a). Hầu hết hạt giống Paphiopedilum có thể nảy mầm bình thường khi không có PGR( plant growth) ngoại sinh. Hegarty (1955) đã quan sát tác động kích thích của indolo-3-butyric acid (IBA) đối với sự nảy mầm của giống lai Paphiopedilum, Pierik et al. (1988) cũng nhận thấy auxin (0,001-1,0 mg/L indolo-3-acetic acid (IAA) và 0.001-1.0 mg/L IBA] có tác dụng kích thích nhẹ, nhưng không có cytokinin [0.001-1.0 mg/L N6-benzyladenine (BA) và 0.001-1.0 mg/L Kn cũng không acid gibberellic (0.001-1.0 mg/L GA3)] ảnh hưởng đến sự nảy mầm. Tuy nhiên, sự tăng trưởng và phát triển của cây con trong điều kiện ánh sáng ngày càng bị ức chế và biến dạng bởi nồng độ auxin, cytokinin và GA3 tăng lên. IBA là độc tính hơn (mặc dù tại sao nó được coi là độc hại không được định nghĩa) so với IAA, và sự ức chế bắt đầu ở 0.5 mg/L cytokinin và 0.01 mg/L GA3 (Pierik và cộng sự, 1988).

Các chất bổ sung hữu cơ

Sự nảy mầm hạt giống hoa lan và sự phát triển mầm đốt thân được kích thích hoặc ức chế bởi các hợp chất hữu cơ (Chen et al, 2004b, Harvais, 1973, Zeng và cộng sự, 2012). Các hợp chất hữu cơ được sử dụng bao gồm một số loại nước hoa quả như nước dừa (CW), bột chuối (BH), bột khoai tây (PH) và hợp chất hữu cơ như casein hydrolysed (HC), dịch chiết nấm men, tryptone và peptone (Curtis, 1947; Fast, 1971; Lee & Lee; 1999, Long et al., 2010, Pierik et al., 1988).

Trong thí nghiệm với môi trường bổ sung với hợp chất hữu cơ, Chen et al. (2004b) báo cáo rằng khi môi trường KC bổ sung với dịch chiết nấm men 1.0 g/L, tỷ lệ nảy mầm của hạt P. armeniacum và P. micranthun giảm đáng kể. Curtis (1947) báo cáo tỷ lệ nảy mầm của hạt P. insigne và P. hirsutissimum trên môi trường bổ sung peptone 1.0-2.0 g/L là cao hơn so với môi trường không có peptone, trong khi đó báo cáo của Zeng et al. (2012) cho thấy tỷ lệ nảy mầm của P. wardii tăng lên đáng kể khi hạt được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS và bổ sung 0.5, 1.0 hoặc 1.5 g/L peptone so với môi trường không có peptone (Hình 1G). Tryptone cũng có ảnh hưởng chi phối đến sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum và sự phát triển tiếp theo (Fast, 1971, Flamee, 1978, George và cộng sự, 2008, Lee & Lee, 1999, Pierik và cộng sự, 1988; Stimart & Ascher, 1981, Thomale, 1957, Zeng và cộng sự, 2012). Pierik et al. (1988) cho rằng tryptone (1.5, 2.0 hoặc 2.5 g/L) đã thúc đẩy đáng kể sự nảy mầm hạt P. ciliolare và sự phát triển của cây con. Lee & Lee (1999) báo cáo rằng môi trường 1/4 MS chứa 2 g/L tryptone thúc đẩy sự nảy mầm của hạt P. delenatii, P. bellatulum và P. primulinum. Zeng et al. (2012) cũng báo cáo rằng tỷ lệ nảy mầm của hạt P. wardii tăng đáng kể khi chúng được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS trộn với 1.0 g/L tryptone so với môi trường không có tryptone. Các hợp chất hữu cơ (HC, peptone và tryptone) thường bao gồm protein trọng lượng phân tử thấp, axit amin, vitamin và các chất tăng trưởng thực vật có khả năng tăng trưởng thực vật bằng cách cung cấp cho các tế bào thực vật với nguồn nitơ sẵn có (George và cộng sự, 2008). Ngoài ra, vitamin biotin và pyridoxin, đặc biệt axit nicotinic, có ảnh hưởng tích cực đến sự nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây con sau đó (Arditti, 1967, Lucke, 1971, Thomale, 1957, Withner, 1959). Lucke (1971) báo cáo rằng 0.0001% biotin làm tăng sự tổng hợp của chất diệp lục và thúc đẩy sự phát triển của cây con Paphiopedilum.

Trong các thí nghiệm của môi trường bổ sung với nước ép trái cây, Long et al. (2010) báo cáo tỷ lệ nảy mầm cao nhất của hạt P. villosum var. densissimum với 10% sữa dừa, trong khi tỷ lệ nảy mầm bằng cách sử dụng bột táo và khoai tây không vượt quá 3%, và 0% với su su và lactalbumin hydrolysate. Zeng et al. (2012) cũng báo cáo sự gia tăng đáng kể tỷ lệ nảy mầm khi P. wardii được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS và bổ sung 7.5, 10 và 15% CW (nhưng không có 5%) so với môi trường không có CW. CW chứa nhiều loại chất sinh học khác nhau, bao gồm các axit amin, vitamin, đường, khoáng chất và chất hormone thực vật (Yong và cộng sự, 2009) và các chất ức chế tự nhiên và các chất điều hòa bao gồm ethylene, ABA, phenol và sắc tố thực vật (Mamaril và cộng sự, 1988), tất cả đều có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt hoặc phát triển cây con. CW cũng bao gồm các ion vô cơ khác như phốt pho, magiê, kali và natri (Raghavan, 1977), có lợi cho sự nảy mầm hạt giống (Hossain và cộng sự, 2013, Teixeira da Silva, 2013a). Thành phần hoá học của CW bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố bao gồm giai đoạn trưởng thành của dừa, đất và điều kiện môi trường (Jackson và cộng sự, 2004, Yong và cộng sự, 2009). Việc bổ sung BH vào môi trường thúc đẩy sự nảy mầm của hạt giống Paphiopedilum và các giống lai (Ernst, 1980), nhưng cũng có một tác dụng ngược lại (Fast, 1971, Pierik và cộng sự, 1988). Việc bổ sung BH vào môi trường cũng thúc đẩy sự phát triển của chồi và rễ cây con in vitro Paphiopedilum (Ernst, 1974, 1975, 1980, Fast, 1971, Pierik và cộng sự, 1988, Zeng và cộng sự, 2012, Hình 1H – J). Lee và Lee (1999) báo cáo rằng 20g/L PH có thể thúc đẩy sự nảy mầm của P. bellatulum, P. delenatii và P. primulinum, trong khi 20 g/L BH làm giảm sự nảy mầm của P. bellatulum, P. delenatii và P. primulinum. Zeng et al. (2012) báo cáo không có sự khác biệt về tỷ lệ nảy mầm của hạt trên môi trường 1/2 MS có chứa PH, và thấp hơn đáng kể trên môi trường 1/2 MS có chứa 75 hoặc 100 g/L BH so với môi trường không có bất kỳ sự bổ sung chất hữu cơ nào. BH bao gồm các khoáng chất, IAA, GA7 và GAx, zeatin, zeatin riboside và N6 -2 (isopentenyl) adenine (2iP) (Khalifah, 1966a, b, Van Staden & Stewart, 1975), thường được biết đến là thúc đẩy sự nảy mầm ở cây lan. Ngược lại, tác động ức chế của nồng độ BH cao đối với sự nảy mầm có thể là môi trường đó chứa quá nhiều đường hoặc các chất khác để cho sự nảy mầm hiệu quả ở Paphiopedilum, mặc dù nó thích hợp cho sự phát triển của cây trồng trong ống nghiệm.

Than hoạt tính

Không có mô hình hoàn thiện để biết liệu thêm than hoạt tính (AC) vào môi trường có thể cải thiện sự nảy mầm của hạt giống (Thomas, 2008). Nỗ lực đầu tiên để làm đen hóa môi trường nuôi cấy sử dụng cho sự nảy mầm của lan dường như đã được thực hiện trong nỗ lực nảy mầm loài Cypripedium bản địa châu Mỹ (Curtis, 1943). Đen hóa với than (không phải AC) có tác động tích cực đến sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây con Paphiopedilum (Ernst, 1974, 1975). Ding và cộng sự (2004) cũng báo cáo rằng tỷ lệ nảy mầm của P. armeniacum được tăng lên trên môi trường 1/5 MS có chứa 2 g/L AC, cao hơn 36.1% so với môi trường 1/5 MS mà không có AC (9.6%). Tuy nhiên, Lee & Lee (1999) báo cáo rằng AC không thúc đẩy sự nảy mầm của P. delenatii và P. primulinum, nhưng có thể thúc đẩy sự nảy mầm của P. bellatulum. Pierik et al. (1988) báo cáo rằng ở nông độ 0.1 hoặc 0.2% AC hầu như không ảnh hưởng đến sự nảy mầm của P. ciliolare, nhưng trong ánh sáng, cả hai hàm lượng đều ức chế sự phát triển của cây.

Lời giải thích về hiệu quả tích cực của AC đối với sự nảy mầm của hoa lan là AC cải thiện sự sục khí, đồng thời bổ sung thêm vi chất, phân cực, ảnh hưởng đến nhiệt độ bề mặt hoặc hấp thụ các chất độc hại bao gồm phenolic, ngược lại không hấp thụ 1 số hợp chất như một số vitamin và hoocmon nhất định, kết quả là thụ động (Ernst, 1974, Thomas, 2008, Weatherhead và cộng sự, 1978. Yam và cộng sự, 1990).

Môi trường nuôi cấy lỏng

Không có kết quả thống nhất hoặc tiêu chuẩn về môi trường nuôi cấy lỏng để cải thiện sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum. Lee và Lee (1999) đã báo cáo rằng sự nảy mầm của P. bellatulum, P. delenatii và P. primulinum có thể được nâng lên tỷ lệ cao hơn trong môi trường chất lỏng (58.2, 68 và 46.7%) so với môi trường dinh dưỡng rắn (36.5, 50.7 và 35.7%). Ding và cộng sự (2004) báo cáo rằng tỷ lệ nảy mầm của hạt không khác biệt đáng kể trong nuôi cấy lỏng hoặc rắn, mặc dù thời gian nảy mầm được rút ngắn và mức độ đồng bộ được tăng lên trong môi trường lỏng, dù cho ảnh hưởng này không được thống kê. Vasudevan & Van Staden (2010) cho rằng tăng khả năng nảy mầm trong môi trường dịch huyền phù có thể là do sự rửa trôi của vỏ hạt và sự pha loãng các chất ức chế thực vật.

Môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum
Nhiệt độ nuôi cấy

Trong hầu hết các nghiên cứu về Paphiopedilum, sự nảy mầm hạt có thể xảy ra ở nhiệt độ từ 22 đến 28 oC (Ernst, 1974). Pierik et al. (1988) báo cáo rằng mức độ nảy mầm của P. ciliolare ở 25 oC cao hơn so với ở 21 hoặc 29 oC.

Ánh sáng

Sự nảy mầm hạt giống hoa lan có mức phản ứng khác nhau đối với ánh sáng hoặc bóng tối (Arditti, 1967). Theo những ghi nhận cho rằng hoa phong lan (lan biểu sinh) cần ánh sáng và những loài địa lan cần bóng tối để nảy mầm là một thực tế được chấp nhận rộng rãi liên quan đến các yêu cầu của điều kiện tự nhiên mặc dù sự nảy mầm phản ứng với chu kỳ ánh sáng thường ở từng loài cụ thể, bất kể thói quen sinh trưởng (Kauth và cộng sự, 2008). Ánh sáng cũng đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng nảy mầm của một số loài Paphiopedilum, khi được nuôi cấy dưới ánh sáng, thường có biểu hiện ức chế sự nảy mầm và ở trạng thái ngủ. Pierik et al. (1988) báo cáo rằng sự nảy mầm tối đa của P. ciliolare trong bóng tối với sự nảy mầm ngày càng trở nên ức chế vì lượng chiếu sáng tăng từ 0 đến 3.0 Wm-2 trong 12 tuần đầu tiên, mặc dù sự ức chế đáng kể xảy ra ở 3.0 Wm-2. Tuy nhiên, ánh sáng là cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Đáng ngạc nhiên là không phải tất cả các hạt giống của các loài Paphiopedilum khác nhau đều cần chu kỳ tối để nảy mầm. Zeng et al. (2012) báo cáo rằng tỷ lệ nảy mầm của P. wardii không khác biệt đáng kể trong bóng tối liên tục (68.33%) hoặc dưới một chu kỳ ánh sáng 16 giờ mà không cần để trong tối trước (65.33%). Tuy nhiên, tỷ lệ nảy mầm của P. wardii cao nhất (75.67%) khi xử lý trong tối trước 45 ngày, sau đó là 16 giờ chu kỳ sáng và cao hơn đáng kể so với hai điều kiện ánh sáng nói trên.

Stimart & Ascher (1981) báo cáo rằng trong bốn môi trường (Burgeff EG-1, Thomale GD, KC, Norstog), Burgeff EG-1 thích hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt và sự sống còn của ba giống lai Paphiopedilum (P. McLaren Park x P. White Fringe, P. Jack Tonkin Jason x P. Hellas Westonbint và P. parishii x P. curtisii var. Sandara) trong ánh sáng, trong khi đó Thomale GD thích hợp nhất cho sự nảy mầm và sống sót trong bóng tối. Tay và cộng sự (1988) báo cáo sự nảy mầm và phát triển mầm đốt thân tốt nhất của P. sukhakulii và các giống lai của nó khi đã được xử lý trước trên môi trường Norstog trong 6 tuần hoặc lâu hơn trong bóng tối. Trong nghiên cứu này, hầu hết các mầm đốt thân trong ánh sáng liên tục chuyển sang màu nâu và chết ở giai đoạn phát triển sớm, trong khi đó cây con phát triển tốt nhất là những con được thu được từ nhửng mầm đốt thân được đặt trên môi trường Burgeff EG-1 trong ánh sáng. Axit amin, được sử dụng trong môi trường Norstog, hỗ trợ sự nảy mầm của hạt và tăng trưởng mầm đốt thân nhưng cũng có thể ức chế sự hình thành chồi ở các hoa lan khác (Arditti, 1967, Harvais, 1982). Sự quang hợp trên môi trường Norstog có thể xảy ra do sự có mặt của các axit amin, mà việc sử dụng chúng có thể bị ảnh hưởng bởi ánh sáng (Arditti, 1967, Spoerl, 1948).

Zeng et al. (2012) báo cáo rằng hạt P. wardii có thể nảy mầm dưới chu kỳ ánh sáng 16 giờ mà không cần để trong tối trước đó hoặc trong bóng tối hoàn toàn và tỷ lệ nảy mầm không khác biệt đáng kể trên môi trường 1/2 MS có chứa NAA 0,5 mg/L, 10% CW và 1,0 g/L AC, mặc dù tỷ lệ nảy mầm của hạt sau khi nuôi cấy trước trong bóng tối 45 ngày sau đó chuyển sang chu kỳ sang 16 giờ là cao hơn đáng kể so với chu kỳ 16 giờ mà không có nuôi cấy trong tối trước, hoặc nuôi cấy trong tối hoàn toàn. Hiện nay chức năng chính xác của tiền nuôi cấy trong tối vẫn chưa được hiểu rõ. Ngoài ra, tất cả các mầm đốt thân được nuôi cấy liên tục trong bóng tối đã không phát triển đến giai đoạn 5. Kết quả này cho thấy ánh sáng là một yếu tố vật lý quan trọng kiểm soát sự phát triển của cây con, nhưng không nhất thiết cho sự nảy mầm.

Nuôi cấy mô lan Paphiopedilum

Quá trình vi nhân giống hoa lan ra đời vào năm 1960 khi Morel lần đầu tiên nuôi cấy mô phân sinh chồi Cymbidium (Morel, 1960) nhưng Bubeck (1973) đã tiến hành nghiên cứu tiên phong để vi nhân giống Paphiopedilum, trong khi Morel (1974) ghi nhận quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô đỉnh chồi Paphiopedilum thành công đầu tiên. Tuy nhiên, Paphiopedilum được coi là khó tái tạo từ nuôi cấy mô do nguồn nguyên liệu hiếm, khó khăn do nhiễm bẩn vi khuẩn và nhiễm nấm của các mẫu có nguồn gốc từ ex vitro và sự phát triển kém của các loại thực vật sống dưới điều kiện in vitro.

Mẫu cấy, khử trùng bề mặt và khử trùng

Phản ứng hình thái học trong hoa phong lan thay đổi tùy thuộc vào mẫu mô (Chugh và cộng sự, 2009, Hossain và cộng sự, năm 2013). Các mẫu mô của cây lai Paphiopedilum thường được sử dụng trong vi nhân giống, cho thấy các giống lai Paphiopedilum có thể dễ dàng vi nhân giống hơn các loài bản địa (Chen et al., 2002, 2004a, b, Huang, 1988, Liao et al., 2011 Stewart & Button, 1975). Những mầm đốt thân, PLBs và cây con in vitro, hoặc các bộ phận của chúng, thường được sử dụng như là những mẫu mô ban đầu để nghiên cứu vi nhân giống Paphiopedilum, bao gồm đỉnh chồi (Huang và cộng sự, 2001; Ng và cộng sự, 2010), những lóng thân (Ng et al., 2010; Ng & Saleh, 2011; Nhut et al., 2007), PLBs (Lin và cộng sự, 2000, Zeng và cộng sự., 2013) hoặc mẫu lá (Chen và cộng sự, 2004a, Lin và cộng sự, 2000), mà không cần phải khử trùng. Cho đến nay, chỉ có ba báo cáo về quá trình vi nhân giống Paphiopedilum từ các mẫu mô ex vitro tồn tại (Huang, 1988, Liao và cộng sự, 2011. Stewart & Button, 1975). Stewart & Button (1975) đã sử dụng các thân hoa non và trưởng thành, đầu lá, rễ, nhị hoa, bầu nhụy và chồi đỉnh của ba loài Paphiopedilum trồng ngoài trời (P. villosum, P. fairrieanum, P. insigne). Huang (1988) đã sử dụng đỉnh chồi của cây lai Paphiopedilum, khử trùng chúng bằng cách ngâm trong dung dịch chứa 0.5% NaClO 15 phút dưới áp chân không nhẹ, sau đó, dưới kính hiển vi cắt lớp, các đỉnh chồi khoảng 2-3 mm đã được cắt bỏ, để giảm sự nhiễm trùng. Ngoài ra, môi trường MS, chứa 100-500 mg/L carbenicillin và / hoặc cefotaxime (kháng sinh) được lọc khử trùng, có hiệu quả hạn chế sự nhiễm bẩn vi khuẩn ở các môi trường nuôi cấy ban đầu. Liao et al. (2011) báo cáo rằng những mảnh lát ngang của các giống lai Paphiopedilum (P. Deperle và P. Armeni White) có thể tạo nên các chồi nụ bất định và tái sinh.

Các phương thức phát triển trong ống nghiệm và các yếu tố ảnh hưởng đến các phương thức phát triển
Sự kích thích mô sẹo và PLB

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (PGRs), bao gồm auxin (2,4-D), cytokinin [BA, thidiazuron (TDZ) và Kn] và những hợp chất khác như PBOA (phenylboronic acid), đã được sử dụng để kích thích sự hình thành mô sẹo và PLB (Lin et al., 2000, Long và cộng sự, 2010, Luan và cộng sự, 2012, Stewart & Button, 1975). PGRs phù hợp nhất là 2,4-D, TDZ hoặc sự kết hợp của chúng. Stewart & Button (1975) đã báo cáo rằng chồi đỉnh có thể tạo ra mô sẹo trên môi trường Heller (Heller, 1965) có chứa 1,0 mg/L 2,4-D có hoặc không có 0,5 mg/L BA. Lin và cộng sự (2000) báo cáo rằng mô sẹo toàn năng của một giống lai Paphiopedilum (P. callosum ” Oakhi ” P. lawrenceanum ” Tradition ”) có thể được kích thích từ mầm đốt thân của hạt giống trên môi trường 1/2 MS bổ sung 1-10 mg/L 2,4-D và 0,1-1 mg/L TDZ trong bóng tối. Luan và cộng sự (2012) cũng báo cáo ở môi trường 1/2 MS bổ sung 10 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L TDZ là phù hợp nhất cho sự kích thích mô sẹo của P. delenatii và P. callosum. Trong nghiên cứu của Lin và cộng sự (2000), trên môi trường không có PGR, mô sẹo nuôi cấy cấp 2 cho thấy sự phát triển nhỏ và cuối cùng bị nâu và hoại tử. Các hiện tượng tương tự đã được quan sát thấy trong mô sẹo được duy trì trên môi trường chỉ chứa TDZ hoặc 2,4-D; các mô sẹo nuôi cấy cấp 2 bắt đầu tăng sinh và tăng trọng lượng, sau đó bị hóa nâu và hoại tử. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa cả 2,4-D và TDZ tăng sinh tốt và sau đó được tái sinh trên môi trường được thiết lập để tái tạo cây con. Những môi trường được bổ sung với 5 mg/L 2,4-D và 1 mg/L TDZ đã được chọn làm môi trường duy trì tiêu chuẩn cho sự tăng sinh của mô sẹo toàn năng vì có tốc độ tăng trưởng tốt nhất. Mô sẹo toàn năng có thể phát triển trên môi trường duy trì này trong 3 năm mà không bị mất khả năng tái sinh chồi. Các mô sẹo đã phát triển, hình thành các PLBs và cuối cùng là các cây con mà có thể được chuyển vào chậu và phát triển tốt. Những mô sẹo nhỏ hình thành trên môi trường có chứa 1 mg/L 2,4-D hoặc 100 mg/L PBOA một mình, thì không tăng sinh và cuối cùng chết trong các lần nuôi cấy tiếp theo. Trong tất cả các sự kết hợp khác của PBOA và TDZ, đều không có sự hình thành mô sẹo. Chỉ một mình TDZ không thể kích thích mô sẹo. Tuy nhiên, những mẫu mô của thân, đầu rễ và lá của bất cứ cây lai Paphiopedilum nào (P. henryanum ‘# 19’ ‘P. philippinense’ ‘# 10’ ‘) cũng không tạo ra mô sẹo hữu hiệu khi được nuôi cấy trên các môi trường nói trên cũng như trên các môi trường nuôi cấy khác (Lin và cộng sự, 2000).

Hong và các cộng sự (2008) báo cáo rằng hạt giống từ quả nang xanh 5 tháng tuổi của một loài lan Maudiae, P. Alma Gavaert, có thể hình thành mô sẹo toàn năng trên môi trường 1/2 MS bổ sung với 22,60μM 2,4-D (5,0 mg/L) và 4,54 μM (1,0 mg/L) TDZ trong bóng tối. Mô sẹo được tăng sinh và duy trì mà không có bất kỳ hình thái học nào khác trên cùng một môi trường với khoảng thời gian 2 tháng nuôi cấy cấp 2 trong hơn 2 năm.

Ng & Saleh (2011) báo cáo sự kích thích của mô sẹo từ các mẫu mô đốt thân của của cây con P. rothschildianum in vitro được nuôi cấy trên 1/2 MS bổ sung 4 μM (0,86 mg/L) Kn và 2 g/L peptone. Các mô sẹo được kích thích có thể tăng sinh và hình thành PLBs từ bề mặt của mô sẹo tăng sinh khi được nuôi cấy cấp 2 trên cùng một môi trường. Số lượng trung bình cao nhất của PLB thứ cấp được tạo thành trên môi trường 1/2 MS bổ sung 4.0 μM (0.86 mg/L) Kn là 4.1 PLBs/ mẫu mô sau 8 tuần nuôi cấy. Ngược lại, việc bổ sung BA đã ức chế sự kích thích của sự hình thành PLB thứ cấp. PLBs thứ cấp tiếp tục tăng sinh và hình thành 9.5-12.1 PLBs/PLB thứ cấp sau khi nuôi cấy lần 2 trên môi trường 1/2 MS không PGR được bổ sung với 60 g/L BH.

Ng & Saleh (2011) đã thử nghiệm môi trường 1/2 MS với các nồng độ khác nhau của BH, PH và TH (tương ứng 15, 30, 45 hoặc 60 g/L) hoặc 5, 10, 15 và 20% CW trên sự hình thành PLB. Ở nồng độ 20% (v/v) CW là sự bổ sung hữu cơ hiệu quả nhất để tạo điều kiện cho sự hình thành PLB ở P. rothschildianum và sự biệt hóa thành các cây con sau đó.

Nhân chồi

Các PGR bao gồm auxin (2,4-D và NAA), cytokinin (BA, TDZ, zeatin và Kn) và các hợp chất khác như 2iP được sử dụng để nhân chồi. Huang (1988) đã báo cáo rằng chồi bất định và cây con có thể phát triển từ những đỉnh chồi của giống lai Paphiopedilum (P. philippinense P. Susan Booth) in vitromôi trường MS bổ sung với 3.0 mg/L 2iP, 0.1 mg/L NAA, 30 mg/L adenine sulfate và 15% CW có hiệu quả cho sự hình thành và phát triển các mẫu mô vô trùng, trong khi môi trường MS có bổ sung 100 mg/L BA (mức BA này là độc đối với hầu hết các cây) có thể được dùng để nhân chồi bằng cách gia tăng phân nhánh ở nách (Huang, 1988, Wu và cộng sự, 2012).

Huang và cộng sự (2001) phát hiện ra rằng TDZ không hiệu quả hơn BA cho sự tăng sinh chồi và sự hình thành rễ của ba giống lai Paphiopedilum (P. philippinense x P. Susan Booth, P. bellatulum ” Big spot ” x P. Jo Ann Wine, P. micranthum x P. Glaucophyllum). Số lượng chồi giống lai Paphiopedilum tăng gấp đôi mỗi 12 tuần khi xử lý với 13 µM (2.93 mg/L) BA và NAA 1.6 µM (0.3 mg/L), trong khi đó TDZ ức chế sự tang sinh chồi của các giống lai tương tự. NAA cũng không có lợi cho sự hình thành chồi, nhưng hơi ức chế khi ở nồng độ cao nhất (1.0 mg/L).

Chen và cộng sự (2002) báo cáo rằng môi trường nuôi cấy 1/2 MS được bổ sung TDZ nồng độ 0.45 hoặc 4.45 µM (0.1 hoặc 1.0 mg/L), hoặc 4.52 hoặc 45.25 µM (1.0 hoặc 10.0 mg/L) 2,4-D, một mình hoặc kết hợp, có thể kiểm soát sự phát triển của quá trình nhân chồi từ các mẫu mô đốt thân của giống lai P. philippinense (PH59, PH60). Môi trường 1/2 MS bổ sung với sự kết hợp của 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D và 0.45 µM (0.1 mg/L) TDZ kích thích tỷ lệ phần trăm cao hơn của các mẫu mô với chồi và tăng số lượng chồi/mẫu mô nhiều hơn so với môi trường không có PGR ở giống lai PH59. Ở giống lai PH60, mặc dù tỷ lệ phần trăm của các mẫu mô tạo thành các chồi đã tăng lên đáng kể trên môi trường nuôi cấy 1/2 MS được bổ sung với 4.52 µM 2,4-D (1.0 mg/L) và 0.30 µM (0.1 mg/L) TDZ, số lượng chồi/mẫu mô cao nhất có thể đạt được với 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D, nhưng không có TDZ. Tuy nhiên, Luan và cộng sự (2012) cho thấy môi trường 1/2 MS được bổ sung 0.5 mg/L TDZ và 0.1 mg/L NAA là phù hợp nhất cho sự tăng sinh chồi nụ của P. delenatii và P. callosum.

Hong và các cộng sự (2008) đã báo cáo một quy trình thích hợp cho sự kích thích PLB của P.Alma Gavaert từ mô sẹo có nguồn gốc từ hạt trên môi trường 1/2 MS với 2.69 µM (0.5 mg/L) NAA kết hợp với 0.45 µM (0,1 mg/L) TDZ. Khi chuyển sang môi trường 1/2 MS bổ sung NAA 26.85 µM (5.0 mg/L), trung bình đạt 4.4 PLB/chồi nụ được hình thành từ mỗi mẫu mô sau 120 ngày nuôi cấy. Nồng độ PGR thích hợp để nhân chồi là 4.65 µM (1.0 mg/L) Kn, mà trung bình có thể kích thích 3.0 chồi từ một chồi non duy nhất sau 60 ngày nuôi cấy.

Long và các cộng sự (2010) báo cáo rằng chiều dài và số lượng chồi của bốn loài Paphiopedilum spp. bị ảnh hưởng bởi nồng độ và sự kết hợp của cytokinin và auxins được thêm vào môi trường. Không có lợi thế bằng cách thay thế BA bằng TDZ cho kích thích sự hình thành chồi ở cả 4 loài. Một nồng độ BA tương đối cao làm tăng số lượng chồi ở P. villosum var. densissimum và P. armeniacum nhưng giảm số lượng chồi ở P. insigne. BA ở nồng độ 3.5 mg/L gây hoại tử lan rộng ở mẫu mô P. insigne. Cơ chế hình thành cơ quan cao nhất của Paphiopedilum spp. xảy ra với sự kết hợp khác nhau của cytokinin và auxin trong môi trường. Số lượng chồi cao nhất của P. armeniacum với 4.0 mg/L BA và 0.1 mg/L NAA, với 1.0 mg/L BA và NAA 0.5 mg/L đối với P. insigne, với 3.0 mg/L BA và 1.0 mg/L NAA hoặc với 6.0 mg/L BA và 0.1 mg/L NAA cho P. villosum var. densissimum và với 5.5 mg/L BA và 0.5 mg/L NAA cho P. bellatulum.

Nhut và các cộng sự (2007) đã báo cáo rằng TDZ kích thích ra chồi gây ra ở P. delenatii có hiệu quả hơn BA hoặc zeatin, với 75% các đoạn đốt thình thành các chồi khi nuôi cấy trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 1.5 mg/L TDZ sau 30 ngày nuôi cấy. Khi các mẫu mô cấy được nuôi cấy trên môi trường MS biến đổi bổ sung với BA 2.0 mg/L hoặc 1.5 mg/L zeatin, 54.5 và 58% các mẫu mô, hình thành chồi tương ứng.

Liao và các cộng sự (2011) báo cáo rằng lát cắt ngang của các giống lai Paphiopedilum (P. Deperle và P. Armeni White) có thể kích thích chồi bất định và tái sinh thành toàn bộ cây trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 4.43 µM (1.0 mg/L) BA và 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D, hoặc trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 44.39 µM (10.0 mg/L) BA và 26.85 µM (5.0 mg/L) NAA. Liao và các cộng sự (2011) phát hiện ra rằng các phần của nụ hoa dài từ 1.5-3.0 cm P. Deperle có thể tạo ra chồi, nhưng chỉ có các phần của nụ hoa ≥ 2.5 cm từ P. Armeni White có thể tái sinh. Các quan sát bằng kính hiển vi cho thấy lá bắc nhỏ ở cuống hoa bao bọc một nụ hoa thu nhỏ mới mà phát triển thành nụ hoa hoàn chỉnh với các mô tương tự như mô phân sinh dạng vòm có thể dẫn đến sự kích thích của thực vật. Sự lặp lại mô hình này đã dẫn đến cấu trúc cụm hoa duôi bò cạp ở loài Paphiopedilum đa hoa, và không cho kết quả lặp lại như trên đối với một hoa đơn lẻ.

Nhut và các cộng sự (2005) báo cáo rằng trạng thái vật lý của môi trường (lỏng hoặc bán rắn) ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành chồi ở các cây con bị thương in vitro của P. delenatii. Khi không bị chìm hoàn toàn trong môi trường nuôi cấy, cây con bị thương có thể lấy thành phần dinh dưỡng và PGR dễ dàng hơn trong môi trường lỏng. Điều này đã kích thích sự biệt hóa của mô bị ảnh hưởng và kết quả là số lượng chồi/mẫu mô ra nhiều hơn từ những cây con bị thương in vitro của P. delenatii. Trong môi trường bán rắn có chứa NAA 0.5 mg/L, số lượng chồi được hình thành mới có xu hướng giảm (từ 2.3 đến 0 chồi/mẫu mô) khi nồng độ TDZ tăng lên (0.25-2.5 mg/L). Ngược lại, số lượng chồi được hình thành trong môi trường lỏng tăng lên (từ 1.2 đến 3.0 chồi/mẫu mô) đáng kể khi mức độ TDZ tăng lên. Kết quả cho thấy những ảnh hưởng của TDZ đối với các mẫu mô phụ thuộc đáng kể vào các tính chất vật lý của môi trường. Trên môi trường lỏng hoặc bán rắn chứa 0.5; 1.0 hoặc 3.0 mg/L TDZ, không có auxin NAA, ảnh hưởng của môi trường lỏng lên sự tái sinh chồi tốt hơn môi trường bán rắn. Khi TDZ được sử dụng ở mức 1.0 mg/L, số lượng chồi/mẫu mô được hình thành (5.2 chồi/mẫu mô) trong môi trường lỏng lớn gấp gần 5 lần so với môi trường bán rắn (1.1 chồi/mẫu mô) và lớn hơn hai lần (2.2 chồi/mẫu mô) so với môi trường có chứa auxin, cho thấy rằng auxin có thể đóng vai trò ức chế trong môi trường lỏng.

Nhut và các cộng sự (2005) thấy rằng không có chồi nào được hình thành trong kiểm soát việc xử lý với các chồi không bị thương trong ống nghiệm của cây con P. delenatii trong tất cả các loại môi trường thử nghiệm. Trung bình có 2.3 chồi khỏe mạnh thu thập được từ những cây con đã được nuôi cấy trên môi trường MS rắn có chứa 0.25 mg/L TDZ và NAA 0.5 mg/L, bước tạo vết cắt trên chồi là điều kiện tiên quyết cho sự hình thành chồi ở cây con. Các tế bào bị thương ở khu vực bị hư hỏng có thể đã phản ứng dễ dàng hơn với các tác nhân kích thích như PGRs nhất định có trong môi trường, cho phép biệt hóa thành những chồi bất định.

Ng và các cộng sự (2010) báo cáo rằng thể chồi có thể được kích thích thành công từ các mô đốt thân và mô chồi đơn của P. rothschildianum được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS không có PGRs và nitơ hữu cơ (kiểm soát). Số lượng thể chồi tăng thêm bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nitơ hữu cơ (peptone và tryptone-peptone). Số lượng chồi nhân nhiều nhất đã hình thành trên các mô đốt thân được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS và bổ sung 1.0 g/L peptone với trung bình 2.9 chồi/mẫu mô sau 16 tuần nuôi cấy; Tuy nhiên, số lượng chồi cao nhất được hình thành trên môi trường bổ sung với 2.0 g/L tryptone-peptone với trung bình 2.8 chồi hình thành trên mỗi mẫu chồi đơn. Ngược lại, peptone không kích thích hiệu quả sự hình thành thể chồi từ các mẫu chồi non, trừ ở nồng độ thấp (0.5 gg/L). Việc bổ sung một lượng peptone lớn hơn (1.0 và 2.0 g/l) đã ức chế sự hình thành thể chồi.

Kích thích rễ

Sự kích thích rễ dễ dàng đạt được trong quá trình nuôi cấy in vitro của Paphiopedilum, và có thể được thúc đẩy bằng cách bổ sung chất hữu cơ và/hoặc PGRs (Huang và cộng sự, 2001, Zeng và cộng sự, 2013). Hong và các cộng sự (2008) báo cáo rằng PGR thích hợp cho sự ra rễ là NAA 26.85 µM (5.0 mg/L). Huang và cộng sự (2001) thấy rằng sự ra rễ đã được tăng mạnh bởi 1.6 µM (0.3 mg/L) và NAA 5.4 mM (1.0 mg/L). Huang và cộng sự (2001) cũng báo cáo rằng CW và HC làm tăng sự hình thành rễ, 15% (v/v) CW và 1.0 g/L HC là phù hợp nhất. Sucrose là tốt hơn cho sự ra rễ so với maltose, sự ra rễ ít xảy ra ở tất cả các nồng độ maltose, trong khi sucrose tăng cường ra rễ ở 0.18 M (62 g/L), nhưng đã ức chế ra rễ ở nồng độ cao hơn (0.26 M hoặc 89 g/L).

Thiết lập chế độ chăm sóc ex vitro và vườn ươm

Các bình nuôi cấy có chứa cây con hoặc cây con Paphiopedilum vi nhân giống in vitro thường được chuyển sang điều kiện tự nhiên từ buồng nuôi cấy trong khoảng 1-2 tuần trước khi chúng được đưa ra vườn ươm, mà có thể tăng khả năng thích ứng với môi trường bên ngoài, điều này rất hữu ích cho các dự án đưa loài lan Paphiopedilum trở lại tự nhiên (Chen và cộng sự, 2004b, Zeng và cộng sự, 2012). Các môi trường nuôi cấy cho lan thường bao gồm những viên gạch vỡ, đá núi lửa, rong rêu, than bùn, đá Zhijing (có tính chất giữ nước tốt hơn đá bình thường), vỏ cây và các môi trường hỗn hợp khác. Trong môi trường nhà kính có độ ẩm không khí cao, khoảng 60% cây con P. villosum var. Densissimum sống sót trên nền giá thể than bùn với rêu (Long et al., 2010). Zeng và các cộng sự (2012) báo cáo rằng môi trường hỗn hợp [2 : 1 : 1 (v/v) đá Zhijing : than bùn: vụn vỏ cây] phù hợp hơn cho việc nuôi cấy cây con P. wardii hơn là giá thể chỉ chứa rêu, than bùn hoặc đá Zhijing, có khả năng duy trì đồng thời độ ẩm và không khí (Hình 1K).

Nơi tốt nhất để bảo tồn nguồn gen thực vật và để thúc đẩy đa dạng sinh học là trong tự nhiên (McNaughton, 1989, Zeng và cộng sự, năm 2015). Việc đưa trở lại tự nhiên các loài bản địa ngày càng trở nên quan trọng trong công tác bảo tồn trên toàn thế giới để phục hồi các loài quý hiếm (Rout et al., 2009). Cây con Paphiopedilum wardii đã được đưa ra vườn ươm thành công và đưa trở lại môi trường tự nhiên và môi trường sống trong rừng khác (Zeng et al., 2012). Tỷ lệ sống sót cao nhất (65%) ở môi trường rừng Ehuangzhang hơn là ở môi trường núi Gaoligong, có thể do chiếu xạ, đất, nước, chất dinh dưỡng, độ ẩm môi trường và các yếu tố khác trong quá khứ. Hai năm sau khi tái sinh, 32% cây có hoa đã nhảy con và tạo hạt giống, nhưng không có cây nào nhảy con và ra hạt trong hai môi trường sống trong rừng khác, có thể là do sự thiếu thụ phấn phù hợp (Hình 1L, Zeng et al, 2012).

Kết luận và triển vọng trong tương lai

Paphiopedilum có sẵn trên thị trường hầu hết có nguồn gốc từ các giống lai của cây in vitro. Có rất nhiều nghiên cứu về sự nảy mầm hạt giống trong ống nghiệm của Paphiopedilum. Tuy nhiên, các yếu tố sinh học như độ trưởng thành của hạt giống, tuổi tác hoặc giai đoạn phát triển của cây mẹ, và yếu tố phi sinh học liên quan đến môi trường cơ bản, các chất hữu cơ bổ sung, ánh sáng, nhiệt độ, nguồn carbon, lựa chọn PGRs, pH và phương pháp nuôi cấy có ảnh hưởng mạnh mẽ đến kết quả của sự nhân giống in vitro Paphiopedilum. Sự hiểu biết về sinh lý và sinh thái của hạt giống và toàn bộ sinh thái cây trồng của Paphiopedilum là cần thiết cho việc nhân giống thương mại.

Các đặc tính của cây trồng phải được dự đoán và thống nhất để có thể thương mại hóa trên quy mô lớn, nhưng các đặc điểm của các mầm đốt thân và cây con in vitro của giống lai Paphiopedilum là rất khác nhau và không thể đoán trước, điều này không thể chấp nhận được trong sản xuất thương mại (Liao và cộng sự, 2011). Hiện nay, có rất ít quy trình cho việc nuôi cấy mô Paphiopedilum từ mẫu cấy mô của cây trưởng thành, trong những loài Paphiopedilum và cây lai vẫn là cây duy nhất được trồng thương mại mà không được nhân bản bởi vì các mẫu cấy mô từ cây trưởng thành của các loài Paphiopedilum thì không kích thích tạo chồi và tái sinh cây (Arditti, 2008) hoặc vì rất khó để có được các phôi vô trùng từ các cây trưởng thành thông qua các bước khử trùng bề mặt bình thường để nuôi cấy in vitro do các vi khuẩn nội sinh (Chugh và cộng sự, 2009). Do đó, trong tương lai, điều quan trọng là phải tiếp tục cải tiến các phương pháp nuôi cấy mô in vitro của Paphiopedilum, bao gồm việc sử dụng các phôi vô trùng từ cây trưởng thành và tăng tốc độ nhân giống và tăng trưởng của Paphiopedilum (Liao và cộng sự, 2011).

Các quy trình khử trùng mẫu mô cấy có thể ảnh hưởng đến thành công của sự vô trùng và chất lượng tiếp theo và phát sinh cơ quan của mẫu mô cấy. Chọn lựa nguồn mẫu cấy thích hợp, sử dụng và chuẩn bị một mẫu cấy tối ưu, lựa chọn một chất khử trùng thích hợp và áp dụng một quy trình thích hợp có thể thành công trong việc làm giảm sự xâm nhiễm trong nuôi cấy in vitro. Các chiến lược trước in vitro cho cây được chọn làm mẫu cấy trong vườn hoặc nhà kính, bao gồm việc kiểm soát phân bón, tưới nước, bảo dưỡng thực vật và bệnh tật và dịch hại có thể có hoặc tạo ra các nguồn mẫu mô cấy có tính tái tạo cao (Winarto et al., 2013). Ở Paphiopedilum, cần phải có một nghiên cứu có hệ thống về bước khử trùng các mẫu mô cấy.

Bioreactor, do hiệu quả cao của chúng (Ziv, 2005), đã được áp dụng để nhân giống một vài loài lan, bao gồm Phalaenopsis( Hồ Điệp) (Park et al., 2000) và Oncidium ‘Sugar Sweet’ (Yang và các cộng sự, 2010). Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào áp dụng cho Paphiopedilum. Môi trường lỏng trong bioreactor cho phép tiếp xúc gần với mô kích thích và tạo thuận lợi cho sự hấp thu các chất dinh dưỡng và PGR, dẫn đến sự phát triển tốt hơn của chồi và rễ. Việc lắc liên tục thúc đẩy sự giảm biểu hiện của ưu thế đỉnh và thông khí dẫn tới sự kích thích và tăng sinh của chồi nách và đồng thời tăng trưởng nhanh hơn (Mehrotra và cộng sự, 2007), điều này có thể làm tăng hiệu quả sự nhân giống và tăng trưởng. Ngoài ra, sự kiểm soát chặt chẽ hơn của sự hình thành cơ quan có thể xảy ra nếu các lớp tế bào mỏng thu được từ các mầm đốt thân có nguồn gốc hạt được sử dụng (Teixeira da Silva, 2013b). Việc sử dụng các từ trường vĩnh cửu cũng có thể là một cách sáng tạo để kích thích sự hình thành cơ quan ở Paphiopedilum và đã thành công trong nuôi cấy mô ở CymbidiumPhalaenopsis (Van cộng sự, 2011, 2012).

Một số phương pháp công nghệ sinh học mới cho việc nhân giống in vitro và tăng trưởng cho lan, ví dụ như phương pháp làm giàu CO2 (Norikane và cộng sự, 2010) hoặc các hệ thống chiếu sáng luân phiên [diodes phát quang (đèn LED)/đèn huỳnh quang âm cực lạnh (CCFLs); Cybularz-Urban và các cộng sự, 2007; Godo và cộng sự, 2011; Tanaka và cộng sự, 1998] hoặc là sự kết hợp cả hai (Norikane và cộng sự, 2013), có thể tạo điều kiện nảy mầm hạt giống và kích thích tạo sinh khối ở hoa lan, điều này có thể rất hữu ích cho việc nhân giống in vitro Paphiopedilum do tốc độ nhân giống in vitro và tăng trưởng chậm của Paphiopedilum. Tuy nhiên, vẫn chưa có báo cáo về phương pháp sử dụng đèn LEDs và làm giàu CO2 được áp dụng trên nuôi cấy in vitro của Paphiopedilum.

Công bố quyền lợi

Các tác giả tuyên bố không có tranh chấp quyền lợi.

Tài liệu tham khảo

Songjun Zeng1, Weichang Huang2, Kunlin Wu1, Jianxia Zhang1, Jaime A. Teixeira da Silva3, and Jun Duan1,4
1Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, China, 2Shanghai Chen Shan Botanical Garden, Shanghai, China, 3P. O. Box 7, Miki-cho post office, Ikenobe 3011-2, Kagawa-ken, 761-0799, Japan, and 4Key Laboratory of South China Agricultural Plant Genetics and Breeding, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, China

Arditti J. (1967). Factors affecting the germination of orchid seeds. Bot Rev, 33, 1–97.
Arditti J, Clements MA, Fast G, et al. (1982). Orchid seed germination and seedling culture – a manual. In: Arditii J, ed. Orchid biology: review and perspectives. vol. 2. Ithaca (NY): Cornell University Press, 243–370.

Arditti J. (2008). Micropropagation of orchids. 2nd ed. Maiden (MA): Blackwell Publishing Ltd. Bubeck SK. (1973). A study of Paphiopedilum meristem culture [PhD Thesis]. Ann Arbor (MI): Rutgers University, University Microfilm International.

Chen TY, Chen JT, Chang WC. (2004a). Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids. Plant Cell Tissue Organ Cult, 76, 11–15.

Chen ZL, Ye XL, Liang CY, Duan J. (2004b). Seed germination in vitro of Paphiopedilum armeniacum and P. micranthum. Acta Hortic Sin, 31, 540–2.
Chen TY, Chen JT, Chang WC. (2002). Multiple shoot formation and plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids. In Vitro Cell Dev Biol Plant, 38, 595–7.
Chugh S, Guha S, Rao IU. (2009). Micropropagation of orchids: a review on the potential of different explants. Sci Hortic, 122, 507–20.
Cribb P. (1998). The genus Paphiopedilum. 2nd ed. Borneo, Malaysia: National History Publications, 48–396.
Curtis JT. (1943). Germination and seedling development in five species of Cypripedium. Am J Bot, 30, 199–206.
Curtis JT. (1947). Studies on the nitrogen nutrition of orchid embryos. I. Complex nitrogen sources. Am Orchid Soc Bull, 16, 654–60.
Cybularz-Urban T, Hanus-Fajerska E, S ́widerski A. (2007). Effect of light wavelength on in vitro organogenesis of a Cattleya hybrid. Acta Biol Craco Ser Bot, 49, 113–18.
Ding CC, Wu H, Liu FY. (2004). Factors affecting the germination of Paphiopedilum armeniacum. Acta Bot Yunnanica, 26, 673–7.
Ernst R. (1974). The use of activated charcoal in asymbiotic seedlings culture of Paphiopedilum. Am Orchid Soc Bull, 43, 35–8.
Ernst R. (1975). Studies in asymbiotic seedlings culture of orchids. Am Orchid Soc Bull, 44, 12–18.
Ernst R. (1980). Seed germination of paphiopedilums. Orchid Rev, 88, 235–6.
Fast G. (1971). Versuche zur Anzucht von Paphiopedilum aus Samen. Orchidee, 22, 181–92.
Flamee M. (1978). Influence of selected media and supplements on germination and growth of Paphiopedilum seedlings. Am Orchid Soc Bull, 47, 419–23.
George EF, Hall MA, Jan De Klerk G. (2008). Plant propagation by tissue culture. 3rd ed. The Netherlands: Springer.
Godo T, Fujiwara K, Guan K, Miyoshi K. (2011). Effects of wavelength of LED-light on in vitro asymbiotic germination and seedling growth of Bletilla ochracea Schltr. (Orchidaceae). Plant Biotechnol, 28, 397–400.
Harvais G. (1973). Growth requirements and development of Cypripedium reginae in axenic culture. Can J Bot, 51, 327–32.
Harvais G. (1982). An improved culture medium for growing the orchid Cypripedium reginae axenically. Can J Bot, 60, 2547–56.
Hegarty CP. (1955). Observations on the germination of orchids seed. Am Orchid Soc Bull, 24, 457–64.
Heller R. (1965). Some aspects of the inorganic nutrition of plant tissue cultures. In: White PR, Grove AR, eds. Proceedings of the International Conference on Plant Tissue Culture Berkeley: McCutchan.
Hong PI, Chen JT, Chang WC. (2008). Plant regeneration via protocorm-like body formation and shoot multiplication from seed derived mô sẹo of a Maudiae type slipper orchid. Acta Physiol Plant, 30, 755–9.
Hossain MM, Kant R, Van PT, et al. (2013). The application of biotechnology to orchids. Crit Rev Plant Sci, 32, 69–139.
Huang LC. (1988). A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum in vitro. Am Orchid Soc Bull, 57, 274–8.
Huang LC, Lin CJ, Kuo CI, et al. (2001). Paphiopedilum cloning in vitro. Sci Hortic, 91, 111–21.
Jackson JC, Gordon A, Wizzard G, et al. (2004). Changes in chemical composition of coconut (Cocos nucifera L.) water during maturation of the fruit. J Sci Food Agric, 84, 1049–52.
Jheng FY, Do YY, Liauh YW, et al. (2006). Enhancement of growth and regeneration efficiency from embryogenic callus cultures of Oncidium ‘‘Gower Ramsey’’ by adjusting carbohydrate sources. Plant Sci, 170, 1133–40.
Kaneko Y, Morohashi Y. (2003). The effect of sodium hypochlorite treatment on the development of a-amylase activity in mung bean cotyledons. Plant Sci, 164, 287–92.
Kauth PJ, Dutra D, Johnson TR, et al. (2008). Techniques and applications of in vitro orchid seed germination. In: Teixeira da Silva JA, ed. Floriculture, ornamental and plant biotechnology: advances and topical issues (1st Edn, Vol V). Isleworth, UK: Global Science Books, 375–91.
Khalifah RA. (1966a). Gibberellin-like substances from the developing banana fruit. Z Pflanzenphysiol, 76, 280–3.
Khalifah RA. (1966b). Indolyl-3-acetic acid from the developing banana. Nature, 212, 1471–2.
Knudson C. (1946). A nutrient for germination of orchids. Am Orchid Soc Bull, 15, 214–17.
Knudson L. (1921). La germinacio ´n no simbio ´tica de las semillas de orquideas. Bol Real Soc Espan ˜ola Hist Nat, 21, 250–60.
Lee N, Lee YI. (1999). Effect of capsual maturity, medium composition and liquid culture on seed germination in vitro of Paphiopedilum spp. In: Taiwan Paphiopedilum Society, ed. Paphiopedilum in Taiwan II. Chiayi Hsien, Taiwan: Taiwan Paphiopedilum Society, 10–11.
Lee YI, Yeung EC, Lee N, Chung MC. (2006). Embryo development in the lady’s slipper orchid, Paphiopedilum delenatii, with emphasis on the ultrastructure of the suspensor. Ann Bot, 98, 1311–19.
Lee YI. (2007). The asymbiotic seed germination of six Paphiopedilum species in relation to the time of seed collection and seed pretreatment. Acta Hortic, 755, 381–5.
Liao YZ, Chen JJ. (2006). Asymbiotic seed germination of Paphiopedilum. In: Taiwan Paphiopedilum Society, ed. Paphiopedilum in Taiwan IV. Chiayi Hsien, Taiwan: Taiwan Paphiopedilum Society, 11–14.
Liao YJ, Tsai YC, Sun YW, et al. (2011). In vitro shoot induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids. In Vitro Cell Dev Biol Plant, 47, 702–9.
Liu ZJ, Chen SC, Chen LJ, Lei SP. (2009). The genus Paphiopedilum in China. Beijing: Science Press, 13–349.
Lin YH, Chang C, Chang WC. (2000). Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid. Plant Cell Tissue Organ Cult, 62, 21–5.
Long B, Niemiera AX, Cheng ZY, Long CL. (2010). In vitro propagation of four threatened Paphiopedilum species (Orchidaceae). Plant Cell Tissue Organ Cult, 101, 151–62.
Luan LQ, Uyen NHP, Ha VTT. (2012). In vitro mutation breeding of Paphiopedilum by ionization radiation. Sci Hortic, 144, 1–9.
Lucke R. (1971). The effect of biotin on sowings of Paphiopedilum. Am Orchid Soc Bull, 40, 24–6.
Major RL, Wright LN. (1974). Seed dormancy characteristics of sideoats gramagrass (Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr.). Crop Sci, 14, 37–40.
Mamaril JC, Paner ET, Trinidad LC, et al. (1988). Enhancement of seedling growth with extracts from coconut water. Philipp J Crop Sci, 13, 1–7.
McNaughton SJ. (1989). Ecosystems and conservation in the twenty-first century. In: Western D, Pearl M, eds. Conservation for the twenty-first century. New York: Oxford University Press, 109–20.
Mehrotra S, Goel MK, Kukreja AK, Mishra BN. (2007). Efficiency of liquid culture systems over conventional micropropagation: a progress towards commercialization. Afr J Biotechnol, 6, 1484–92.
Miyoshi K, Mii M. (1998). Stimulatory effects of sodium and calcium hypochlorite, pre-chilling and cytokinins on the germination of Cypripedium macranthos seed in vitro. Physiol Plant, 102, 481–6.
Morel G. (1960). Producing virus free Cymbidium. Am Orchid Soc Bull, 29, 459–97.
Morel G. (1974). Clonal multiplication of orchid. In: Withner CL, ed. The orchid. Scientific studies. New York: Wiley Interscience.
Murashige T, Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 15, 473–97.
Nagashima T. (1982). Studies in the seed germination and embryogenesis in Cymbidium goeringii Rchb. f. and Paphiopedilum insigne var. sanderae Rchb. J Jpn Soc Hortic Sci, 51, 94–105.
Ng CY, Saleh NM, Zaman FQ. (2010). In vitro multiplication of the rare and endangered slipper orchid, Paphiopedilum rothschildianum (Orchidaceae). Afr J Biotechnol, 9, 2062–8.
Ng CY, Saleh NM. (2011). In vitro propagation of Paphiopedilum orchid through formation of protocorm-like bodies. Plant Cell Tissue Organ Cult, 105, 193–202.
Nhut DT, Trang PTT, Vu NH, et al. (2005). A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatii propagation. Propag Ornam Plants, 5, 158–63.
Nhut DT, Thuy DTT, Don NT, et al. (2007). In vitro stem elongation of Paphiopedilum delenatii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture. Propag Ornam Plants, 7, 29–36.
Norikane A, Takamura T, Morokuma M, Tanaka M. (2010). In vitro growth and single-leaf photosynthetic response of Cymbidium plantlets to super-elevated CO2 under cold cathode fluorescent lamps. Plant Cell Rep, 29, 273–83.
Norikane A, Teixeira da Silva JA, Tanaka M. (2013). Growth of in vitro Oncidesa plantlets cultured under cold cathode fluorescent lamps (CCFLs) with super-elevated CO2 enrichment. AoB Plants, 5, plt044.
Park SY, Murthy HN, Paek KY. (2000). Mass multiplication of protocorm-like bodies using bioreactor system and subsequent plant regeneration in Phalaenopsis. Plant Cell Tissue Organ Cult, 63, 67–72.
Pierik RLM, Sprenkels PA, Vanderharst B, Vandermeys QG. (1988). Seed germination and further development of plantlets of Paphiopedilum ciliolare Pfitz in vitro. Sci Hortic, 34, 139–53.
Raghavan V. (1977). Diets and culture media for plant embryos. In: Recheigl MJ, ed. CRC handbook series in nutrition and food. London: Taylor & Francis Publisher, 361–413.
Rasmussen HN. (1995). Terrestrial orchids. From seed to mycotrophic plant. Cambridge, UK: Cambridge University Press. Ren L, Wang FH. (1987). Embryological studies of Paphiopedilum godefroyae Stein. Acta Bot Sin, 29, 14–22.
Rout TM, Hauser CE, Possingham P. (2009). Optimal adaptive management for translocation of a threatened species. Ecol Appl, 19, 515–26.
Spoerl E. (1948). Amino acids as source of nitrogen for orchid embryos. Am J Bot, 35, 88–95.
Sheehan TJ, Sheehan M. (1994). An illustrated survey of orchid genera. Portland: Timber Press Inc. Stewart J, Button J. (1975). Tissue culture studies in Paphiopedilum. Am Orchid Soc Bull, 35, 88–95.
Stimart DP, Ascher PD. (1981). In vitro germination of Paphiopedilum seed on a completely defined medium. Sci Hortic, 14, 165–70.
Tay LJ, Takeno K, Hori Y. (1988). Culture conditions suitable for in vitro seed germination and development of seedling in Paphiopedilum. J Jpn Soc Hortic Sci, 57, 243–9.
Tanaka M, Takamura T, Watanabe H, et al. (1998). In vitro growth of Cymbidium plantlets cultured under superbright red and blue lightemitting diodes (LEDs). J Hortic Sci Biotechnol, 73, 39–44.
Teixeira da Silva JA. (2013a). Orchids: advances in tissue culture, genetics, phytochemistry and transgenic biotechnology. Floricult Ornamental Biotechnol, 7, 1–52.
Teixeira da Silva JA. (2013b). The role of thin cell layers in regeneration and transformation in orchids. Plant Cell Tissue Organ Cult, 113, 149–61.
Thomale H. (1954). Die Orchideen. Stuttgart: Eugen Ulmer, 62–88. Thomale H. (1957). Die Orchideen. Stuttgart: Eugen Ulmer, 11–211.
Thomas TD. (2008). The role of activated charcoal in plant tissue culture. Biotechnol Adv, 26, 618–31.
Vacin EF, Went FW. (1949). Some pH changes in nutrient solutions. Bot Gaz, 110, 605–13.
Van PT, Teixeira da Silva JA, Ham LH, Tanaka M. (2011). The effects of permanent magnetic fields on Phalaenopsis plantlet development. J Hortic Sci Biotech, 86, 473–8.
Van PT, Teixeira da Silva JA, Ham LH, Tanaka M. (2012). Effects of permanent magnetic fields on growth of Cymbidium and Spathiphyllum. In Vitro Cell Dev Biol Plant, 48, 225–32.
DOI: 10.3109/07388551.2014.993585 In vitro propagation of Paphiopedilum orchids 13
Critical Reviews in Biotechnology Downloaded from informahealthcare.com by Selcuk Universitesi on 01/17/15 For personal use only.
Van der Kinderen G. (1987). Abscisic acid in terrestrial orchid seeds: a possible impact on their germination. Lindleyana, 2, 84–7.
Van Staden J, Stewart J. (1975). Cytokinins in banana fruit. Z Pflanzenphysiol, 76, 280–3.
Van Waes JM, Debergh PC. (1986a). In vitro germination of some Western European orchids. Physiol Plant, 67, 253–61.
Van Waes JM, Debergh PC. (1986b). Adaptation of the tetrazolium method for testing the seed viability and scanning electron microscopy of some Western European orchids. Physiol Plant, 66, 435–42.
Vasudevan R, Van Staden J. (2010). In vitro asymbiotic seed germination and seedling growth of Ansellia africana Lindl. Sci Hortic, 123, 496–504.
Winarto B, Rachmawati F, Santi A, Teixeira da Silva JA. (2013). Mass propagation of Dendrobium ‘Zahra FR 62’, a new hybrid used for cut flowers, using bioreactor culture. Sci Hortic, 161, 170–80.
Weatherhead MA, Burdon J, Henshaw GG. (1978). Some effects of activated charcoal as an additive to plant tissue culture media. Zeit Pflanzenphysiol, 89, 141–7.
Withner CL. (1959). The orchids. A scientific survey. New York: Ronald Press Co., 1–648. World Checklist of Selected Plant Families. (2015). Available at http://apps.kew.org/wcsp/home.do [last accessed 8 January 2015].
Wu KL, Zeng SJ, Teixeira da Silva JA, et al. (2012). Efficient regeneration of Renanthera Tom Thumb ‘Qilin’ from leaf explants. Sci Hortic, 135, 194–201.
Wu ZY, Raven PH, Hong DY, eds. (2009). Flora of China. Vol. 25 (Orchidaceae). Beijing: Science Press/St. Louis (MO): Missouri Botanical Garden Press, 33–45.
Yam TW, Ernst R, Arditti J, et al. (1990). Charcoal in orchid seed and tissue culture media: a review. Lindleyana, 5, 256–65.
Yang JF, Piao XC, Sun D, Lian ML. (2010). Production of protocormlike bodies with bioreactor and regeneration in vitro of Oncidium ‘Sugar Sweet’. Sci Hortic, 125, 712–17.
Yeung EC, Zee SY, Ye XL. (1996). Embryology of Cymbidium sinense: embryo development. Ann Bot, 78, 105–10.
Yong JWH, Ge L, Ng YF, Tan SN. (2009). The chemical composition and biological properties of coconut (Cocos nucifera L.) water. Molecules, 14, 5144–64.
Zeng SJ, Wang J, Wu KL, et al. (2013). In vitro propagation of Paphiopedilum hangianum Perner & Gruss. Sci Hortic, 151, 147–56.
Zeng SJ, Wu KL, Teixeira da Silva JA, et al. (2012). Asymbiotic seed germination, seedling development and reintroduction of Paphiopedilum wardii Sumerh., an endangered terrestrial orchid. Sci Hortic, 138, 198–209.
Zeng SJ, Zhang Y, Teixeira da Silva JA, et al. (2015). Seed biology and in vitro seed germination of Cypripedium. Crit Rev Biotechnol, 35, 279–92.
Zhang JJ, Yan N, Hu H. (2013). The seed development of three Paphiopedilum species in relation to asymbiotic germination. Plant Diver Resour, 35, 33–40.
Zhou Y, Zhou HY, Zhu L, Zhou Q. (2013). Aseptic germination and rapid propagation of Paphiopedilum micranthum Tang. Guizhou Sci, 31, 79–82.
Zinger NV, Poddubnaya-Arnoldi VA. (1966). Application of histochemical techniques to the study of embryonic processes in certain orchids. Phytomorphology, 16, 111–24.
Ziv M. (2005). Simple bioreactors for mass propagation of plants. Plant Cell Tissue Organ Cult, 81, 277–85.

Minh Hiếu
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com

Facebook Comments

2 Replies to “Nhân giống in-vitro Lan Hài Paphiopedilum”

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *